和牛体外受精胚胎玻璃化冷冻与解冻孵化试验

用添加5％犊牛血清(FCS)的TCM-199进行卵母细胞成熟,BO液进行体外受精后,在5％犊牛血清的CR1aa液进行体外培养获得和牛体外受精胚胎。经玻璃化冷冻保存后解冻,进行孵化试验,解冻后透明带完整率为100％,解冻后存活率为90％。用含20％和5％犊牛血清(FCS)的TCM-199培养孵化,经24h、48h存活率分别为77．8％、74．1％;51．9％、49．1％。两者差异不显著。     

不同冷冻方法对牛体外受精胚胎冷冻效果的影响

通过采用程序降温法(试验1:分步法10%甘油;试验2:直接法1.8mol/L乙二醇+0.1mol/L蔗糖)和玻璃化法(试验3:20%甘油+0.3M蔗糖+0.3M木糖+3%聚乙二醇+20%乙二醇)对牛体外受精胚胎进行冷冻保存及解冻后进行孵化培养试验,用囊胚孵化率对各方法进行了比较。结果表明,10%甘油组、1.8mol/L乙二醇+0.1mol/L蔗糖组及玻璃化组胚胎存活率分别为85%、82.5%、90%;囊胚孵化率分别为50%、55%和80%(P<0.05)。体外受精胚用玻璃化法保存显著优于程序降温法,可获得较高的胚胎存活率(90%)和囊胚孵化率(80%)。     

ε-聚赖氨酸对小鼠胚胎玻璃化冷冻的影响

为研究ε-聚赖氨酸(ε-PL)对小鼠胚胎玻璃化冷冻效果的影响,探讨冷冻保护剂ε-PL适宜的浓度和平衡时间,试验采用了不同质量浓度的ε-PL(20,30,40 g/L)及不同的平衡时间(0.5,1.0,2.0 min)对小鼠囊胚进行玻璃化冷冻,统计胚胎解冻后存活率及孵化率。结果表明:在冷冻液中添加30 g/L的ε-PL,平衡时间为1.0 min时,冷冻效果最好,囊胚胚胎的存活率达91.2%,孵化率达89.7%。因此,ε-PL可以作为一种高分子非渗透性保护剂对胚胎玻璃化冷冻起保护作用。     

影响奶牛体外受精胚胎培养效果的胚胎因素

对胚胎因素影响奶牛体外受精胚胎培养效果进行了研究。结果发现,在胚胎因素中,胚胎类型(冻胚和鲜胚)与胚胎发育阶段对胚胎培养效果没有显著影响(P>0.05);冷冻胚胎解冻后停留时间对胚胎培养效果影响极显著(P<0.01);冷冻胚胎解冻后胚胎等级对胚胎培养效果影响显著(P<0.05),解冻后A级胚胎存活率(80%,128/160)、囊胚孵化率(58.75%,94/160)显著高于B级胚胎存活率(59.38%,95/160)和囊胚孵化率(37.5%,60/160)(P<0.05);解冻水浴温度(20℃、30℃)对培养效果有极显著影响(P<0.01)。     

胚胎因素对奶牛体外受精胚胎解冻孵化影响的试验研究

对胚胎因素影响奶牛体外受精胚胎培养效果进行了研究。结果发现：在胚胎因素中，胚胎类型（冻胚和鲜胚）与胚胎发育阶段对胚胎培养效果没有显著影响（P〉0．05）；冷冻胚胎解冻后停留时间对胚胎培养效果影响显著（P〈0．01）；冷冻胚胎解冻后胚胎等级对胚胎培养效果影响显著（P〈0．05），解冻后A级胚胎存活率（80％，128／160）、囊胚孵化率（58．75％，94／160）显著高于B级胚胎存活率（59．38％，95／160）和囊胚孵化率（37．5％，60／160）（P〈0．05）；解冻水浴温度（20℃、30℃）对培养效果有极显著影响（P〈0．01）。     

牛体外受精低品质胚胎冷冻保存效果

体外受精胚的品质和耐冻性较体内受精胚差、妊娠率低 ,特别是低品质冻胚的妊娠率更低。为了改善低品质冻胚的妊娠率 ,我们设 10 %乙二醇 (EG)、 8%EG和 5%EG +5 % 1,2 丙二醇 (PD) 3种不同处理的防冻剂就牛体外受精低品质胚胎的冷冻效果进行了初步的探讨。结果用这 3种防冻剂冷冻保存的胚胎 ,解冻后用TCM - 199+10 %犊牛血清 (FCS) +10 0 μmol/Lβ 巯基乙醇 (β ME)培养 72h的孵化率分别为 11 1%、 2 1 4 %和 2 0 6 % ,后两者明显地高于前者     

牛卵母细胞的玻璃化冷冻研究

本试验通过牛卵母细胞玻璃化冷冻过程中采用载体、冷冻时卵母细胞所带颗粒细胞层数和其成熟培养时间这3个方面对牛卵母细胞的玻璃化冷冻进行了探讨。(1)不同载体的对比:玻璃OPS管和塑料OPS管冷冻效果较好。玻璃OPS管冷冻卵母细胞,解冻后形态正常率、体外受精后卵裂率和囊胚率分别为91.2%、41.3%和14.52%。塑料OPS管冷冻卵母细胞,解冻后形态正常率、体外受精后卵裂率和囊胚率分别为89.09%、40.90%和14.54%。(2)保留2￣3层颗粒细胞的卵母细胞玻璃化冷冻的冷冻效果较好,其冷冻解冻后形态正常率、体外受精后卵裂率和囊胚率分别为90.79%、40.13%和15.13%。(3)体外成熟培养22h的卵母细胞冷冻效果较好,其冷冻解冻后形态正常率、体外受精后卵裂率和囊胚率分别为94.14%、41.80%和15.23%。     

猪冷冻（—20℃）胚胎在我国移植成功

实验Ⅰ将129枚猪胚胎,用于冷冻-解冻-体外培养研究。以含有1.5M甘油的PBS液为冷冻液,以1℃/分的速率从35℃降至-7℃,在-7℃自动诱发给冰,然后以0.3℃/分的速率降至-35℃,再以0.1℃/分的速率降至-36℃,立即投入液氮(-196℃);胚胎解冻在37℃水浴中进行、分步脱出甘油后以改进的mBMOC-Ⅱ为培养液进行体外培养。结果,囊胚、扩张囊胚、刚孵出囊胚和孵化出后期囊胚、解冻后体外培养存活率分别为0％(0 /2)、64％(16/25)、0％(0/9)。在液氮中(-196℃)保存80～103天,扩张囊胚、刚孵出囊胚和孵出后期囊胚解冻后,体外培养存活率分别为41.6％(5/12)、63.7％(7/11)和0％(0/70)。结果表明,在液氮温度(-196℃)保存下,刚孵出囊胚有较高的耐冻性和存活能力。实验Ⅱ进行猪冷冻胚胎解冻后体内发育能力研究。96枚扩张囊胚和刚孵出囊胚,分批冷冻和保存在-20℃、-35℃和-196℃。解冻后移植3头受体,其中2头返情,1头妊娠并于1990年7月31日产仔2头,公母各1头,初生重均为1.35kg,妊娠期为116夭。该结果为我国首例猪冷冻(-20℃)胚胎移植成功,并为今后开展猪胚胎超低温(-196℃)冷冻保存技术研究奠定了基础。     

牛体外受精胚胎冷冻与解冻孵化试验报告

用添加 5 %犊牛血清 (FCS)的HEPES缓冲TCM 199,用共培养法获得牛体外受精胚胎。冷冻保护液组成为 :18%FCS、72 %PBS、10 %( 1.4mol)甘油、0 .1g/ml蔗糖。冷冻程序为 :①从 -7℃开始冷冻 10分钟 ,第二分钟植冰 ;② 0 .5℃ /分缓慢冷冻 3 2分钟至-2 3℃ ;③最后以 -2 3℃冷冻 10分钟后投入液氮。冷冻保存 6h～5d的胚胎解冻存活率为 90 .0 %;用 2 0 %FCS +80 %HamF1 0 孵化2 4、48h存活率分别为 77.8%、5 1.9%     

体外受精不同时间等因素对体外受精效果的影响

本试验对牛体外受精不同时间、不同的培养液成分和培养方法等对奶牛体外受精后的卵裂率、囊胚发育率的影响进行了研究。试验包括:(1)牛体外受精不同时间(8h、20h)对奶牛体外受精后的卵裂率、囊胚发育率的影响;(2)不同的培养液成分对奶牛体外受精早期胚胎发育的影响。研究结果表明:(1)牛体外受精时间20h对奶牛体外受精后的卵裂率(78%)好于体外受精8h组(76%),但囊胚发育率前者不如后者好(20.51%VS23.68%),两者间差异不显著(P0.05)。(2)作为早期胚胎的培养液IVD101、TCM199培养系的卵裂率分别为76%、74%,而囊胚率却分别为22.37%、22.97%,TCM199培养系好于IVD-101,但两者间差异不显著(P0.05)。     

鸡囊胚细胞玻璃化冷冻保存技术的研究

研究不同冷冻液配方对鸡囊胚细胞的玻璃化冷冻保存效果。对新鲜种蛋囊胚细胞分离提纯后,在DMEM中添加不同的冷冻保护剂DMSO（二甲基亚砜）、EG（乙二醇）、蔗糖,分别组成6种玻璃化冷冻保护液,进行超低温冷冻保存。复苏后通过苔盼蓝染色测定活细胞存活率。结果：玻璃化冷冻保存中,囊胚细胞在玻璃化冷冻液配方2（10％EG＋10％DMSO＋0．5mol／L蔗糖＋20％FBS＋DMEM）条件下复苏后存活率最高（71．32％）,与玻璃化冷冻液配方1和3条件下复苏后存活率之间差异显著（P〈0．05）,且与玻璃化冷冻液配方4、5、6条件下复苏后存活率之间差异均极显著（P〈0．01）,可以作为鸡囊胚细胞的玻璃化冷冻液。     

家畜卵和胚胎冷冻的现行方法及有待研究的问题

近17年来,采用建立起来的牛非手术采卵及冷冻方法,已能将牛桑葚胚和囊胚冷冻,并获得较高的存活率。现在试验中和商业上牛胚胎冷冻大多数是采取控制降温和解冻的程序。解冻后存活率按形态评定可达90％～100％,非手术移植的妊娠率为60％。绵羊、山羊和马的桑葚胚和囊胚用控制降温和解冻程序也能有效的冷冻。简化的控制降温和解冻程序的一步法用于牛胚胎,妊娠率可达50％。此法免去了解冻后较繁琐的脱除冷冻保护剂和胚胎评定过程。玻璃化法和快速冷冻法是较先进的方法,可大大缩短胚胎冷冻时间,而且无需复杂的冷冻设备。不过,迄今家畜胚胎冷冻的结果还是有待提高的,尽管牛、绵羊、山羊桑葚胚和囊胚用玻璃化法冷冻已经成功,移植后产了仔。另外,卵母细胞、早期胚胎、显微手术(切割、克隆、活组织检查)后的胚胎、猪胚胎冷冻成功率还很低。因此,为使胚胎移植技术能在生产中应用和开展胚胎显微操作、体外受精、克隆和基因转移之类生物技术的试验及应用,很有必要加强研究建立起更为有效的胚胎冷冻解冻方法。     

乙二醇联合丙二醇用于猪GV期卵母细胞玻璃化冷冻保存的研究

本实验以猪GV期卵母细胞为模型,旨在研究乙二醇(EG)联合丙二醇(PROH)作为渗透性冷冻保护剂的冷冻保存方案。将卵母细胞在室温(25℃)和生理温度(39℃)2种冷冻操作条件下,采用2.5%EG+2.5%PROH直接处理10 min(预平衡方式Ⅰ)或分步以3.75%EG+3.75%PROH、7.5%EG+7.5%PROH 2种溶液各处理2.5 min(预平衡方式Ⅱ)进行预平衡,然后Cryotop法玻璃化冷冻保存,解冻后分析其存活、体外成熟及孤雌发育能力。结果表明:在2种温度下,预平衡方式Ⅰ组卵母细胞解冻后2 h的存活率均显著高于预平衡方式Ⅱ组(P0.05),但存活卵母细胞成熟培养后,在各冷冻组间的存活率无明显差异(P0.05);冷冻组卵母细胞的核成熟也与新鲜卵母细胞无显著性差异(P0.05);在相同温度下,预平衡方式Ⅰ组的卵裂率和囊胚发育率均显著高于预平衡方式Ⅱ组(P0.05);当采用同一预平衡方式时,39℃的冷冻操作条件所获卵裂率和囊胚发育率显著低于25℃(P0.05);此外,各组间囊胚细胞数均无明显差异(P0.05)。综上所述,EG联合PROH用于猪GV期卵母细胞的Cryotop法玻璃化冷冻保存时,25℃冷冻操作条件下,采用预平衡方式Ⅰ可获得较高的冷冻存活率及囊胚发育率。     

山羊胚胎冷冻保存技术研究

本研究探讨了不同抗冻保护剂、不同冷冻方法、玻璃化液(EFS40)中添加FCS和BSA,以及冷冻前细胞松驰素B处理对山羊胚胎冷冻保存效果的影响。结果表明,山羊胚胎常规冷冻时以1.5 mol/L EG为抗冻保护剂的保护效果最好,解冻后胚胎发育率为70.59%,孵化率为58.82%;玻璃化冷冻细管法和OPS法以EFS40为保护液的冷冻效果较好,其解冻后胚胎的发育率分别为67.57%和52.94%;EFS40中添加BSA的冷冻保护效果显著地高于不添加其他成分的EFS40;山羊胚胎冷冻前用细胞松驰素B处理,能提高冷冻保存的效果。     

亚油酸蛋白对牛IVF胚胎的冷冻后发育能力的影响研究

本试验主要讨论了冷冻液添加亚油酸蛋白(LAA)对牛体外受精胚胎(IVF)冷冻后发育能力的影响。结果表明:①低温(0～4℃)保存卵巢获得的卵子受精卵裂率达68.16%(167/245);②LAA添加浓度为4mg/mL时,IVF6日龄胚胎解冻后的存活率与孵化率分别为69.4%(34/49)和22.4%(11/49)最高;不添加LAA的解冻后胚胎的存活率及孵化率分别为47.8%(22/46)和13.0%(6/46)最低,两者差异显著(P<0.05),添加其他浓度各组间差异不显著;③7日龄胚的冻后存活率和孵化率分别为71.4%(90/126)和23.0%(29/126),6日龄胚的分别为68.6%(48/70)和22.9%(16/70),两者差异不显著(P>0.05),8日龄胚的分别为36.3%(33/91)和3%(3/91),与6,7日龄IVF胚冻后的存活率与卵化率差异极显著(P<0.01)。     

ε-聚赖氨酸在牛胚胎玻璃化冷冻中的保护作用

通过研究ε-聚赖氨酸(ε-PL)对牛胚胎玻璃化冷冻的影响,探讨ε-PL在牛胚胎玻璃化冷冻中的保护作用,为优化牛胚胎玻璃化冷冻技术提供依据。单独以ε-PL作为冷冻保护剂,其质量浓度为20、35、50g/L,分别进行胚胎冷冻,结果均不能取得成活胚胎,说明ε-PL不能单独作为冷冻保护剂使用。在传统玻璃化冷冻剂中分别添加质量浓度为10、20、30g/L的ε-PL进行胚胎冷冻,结果发现添加ε-PL之后的冷冻保护液具有更好的保护效果,且ε-PL质量浓度为20g/L时效果最好,囊胚解冻孵化率可达42.37%。进一步探索了用该冷冻保护剂,缓冲时间分别为5、7.5、10min进行胚胎冷冻的效果,结果发现缓冲时间为7.5 min取得最高孵化率,孵化率为46.58%。结果表明,ε-PL对牛胚胎玻璃化冷冻具有一定的保护作用,且适当延长缓冲时间可取得更好的冷冻效果。     

猪卵母细胞的室温(20℃)保存与成熟培养

猪卵母细胞在TCM-199培养基中,在20℃和37℃(对照)下分别培养24小时和48小时。在TCM-199培养基中加入20％ 3种犊牛的混合血清、5％的猪卵泡液。气体浓度为90％N_2、5.2％O_2和4.8％CO_2。24小时20℃和37℃培养的卵母细胞经台盘蓝鉴别后存活率分别为71％和69％。当培养到48小时,20℃组的成活率明显高于37℃组,分别为61％和25％。电镜观察:20℃组卵母细胞的线粒体较完整,微绒毛较多。而37℃组则相反。当20℃培养24小时后,把卵母细胞移到37℃下继续培养24小时,仍有45％的存活率,11％的颗粒细胞扩散程度较好。染色或切片后可见第一极体和染色体,说明处于第二次成熟分裂的中期。实验说明:猪卵母细胞20℃保存24小时仍有继续发育成熟的潜力。     

绵羊玻璃化冷冻胚胎直接移植试验研究

应用EFS40玻璃化液对6.5～7日龄的绵羊胚胎进行玻璃化冷冻及解冻后直接移植试验.结果:桑椹胚、囊胚冷冻解冻后移植的妊娠率分别为37.50%(3/8)和54.55%(6/11),胚胎存活率分别为33.33%(3/9)和50.00%(6/12),差异均不显著(P＞0.05);胚胎解冻后用0.5 mol/L蔗糖脱防冻剂与直接用胚胎存放液脱除防冻剂的妊娠率分别为44.44%(4/9)和50.00%(5/10),胚胎存活率分别为40.00%(4/10)、45.45%(5/11)差异不显著(P＞0.05);10枚解冻后的胚胎细管内脱防冻剂后,直接装管移植给8只受体,妊娠率为50.00%(4/8),胚胎成活率为40.00%(4/10),与同期常规冷冻解冻组相比无显著差异(P＞0.05).     

小鼠囊胚和扩张囊胚玻璃化冷冻保存的研究

以6M甘油+6.5%PVP(V1)和8MEG+7%PVP(V2)为玻璃化溶液,采用细管法和OPS一步法对小鼠囊胚进行冷冻.结果表明:胚胎在玻璃化溶液中平衡20S显著高于平衡60S后的存活率(P＜0.05);蔗糖四步法解冻后的发育率与蔗糖三步法冷冻解冻后的发育率差异不显著(P＞0.05);用OPS三步法冷冻后(V2)的小鼠囊胚的体外发育率显著高于细管法和OPS一步法冷冻后的发育率(P＜0.01);在OPS三步法冷冻过程中,平衡时间对胚胎冷冻后的发育率有一定的影响.     

小鼠囊胚和扩张囊胚玻璃化冷冻保存的研究

以6M甘油+6.5%PVP(V1)和8MEG+7%PVP(V2)为玻璃化溶液,采用细管法和OPS一步法对小鼠囊胚进行冷冻。结果表明:胚胎在玻璃化溶液中平衡20S显著高于平衡60S后的存活率(P<0.05);蔗糖四步法解冻后的发育率与蔗糖三步法冷冻解冻后的发育率差异不显著(P>0.0 5);用OPS三步法冷冻后(V2)的小鼠囊胚的体外发育率显著高于细管法和OPS一步法冷冻后的发育率(P<0.01);在OPS三步法冷冻过程中,平衡时间对胚胎冷冻后的发育率有一定的影响。