鸡传染性贫血病毒衣壳蛋白的原核表达及鉴定

[目的]用大肠杆菌表达出CIAV的衣壳蛋白(VP1)作为免疫抗原,以建立鸡传染性贫血病毒(CIAV)的血清学诊断方法.[方法]根据已发表的CIAV的衣壳蛋白(VP1)序列,结合Protean软件预测出抗原富集区域,设计并合成1对引物,利用PCR扩增该区域基因,将扩增成功的VP1基因片段经T4连接酶连接至PGEX-6P-1表达载体.连接成功的重组质粒转化不同的大肠杆菌表达菌株,通过IPTG诱导进行原核表达,筛选出表达量最高的菌株及最佳诱导时间和1PTG诱导浓度.以感染CIAV的鸡阳性血清为一抗,对重组蛋白GST-VP1进行Western-blot分析.[结果]成功获得了重组质粒PGEX-VP1,诱导表达后经SDS-PAGE和Western-blot分析,分子量约71kD的融合蛋白GST-VP1在大肠杆菌Rosseta中以包涵体形式大量表达,并能与鸡传染性贫血病毒阳性血清发生反应.[结论]该研究可为抗CIAV单克隆抗体的制备及血清学诊断方法的建立等研究奠定基础.     

猪细环病毒1型衣壳蛋白的原核表达及鉴定

为了制备猪细环病毒1型(TTSuV1)抗体,并为建立TTSuV1免疫学检测方法奠定基础。用PCR技术扩增TTSuV1衣壳蛋白(Cap)基因片段,与载体pET-32a定向连接,构建重组原核表达质粒pET-32a-Cap,转化入大肠杆菌Rosetta(DE3),诱导重组阳性菌表达,SDS-PAGE研究融合蛋白表达情况。对重组融合蛋白进行纯化、复性后,免疫BALB/c小鼠4次来制备鼠抗TTSuV1-Cap蛋白抗体。分别以鼠抗TTSuV1-Cap蛋白抗体和TTSuV1猪阳性血清为一抗,对重组融合蛋白进行免疫印迹检测。结果显示,成功表达了TTSuV1Cap截短体融合蛋白,表达产物以包涵体形式存在,重组蛋白可与鼠抗TTSuV1-Cap蛋白抗体及TTSuV1猪阳性血清发生特异性结合,表明表达的TTSuV1-Cap融合蛋白具有良好的免疫原性和反应原性。     

胃癌组织中p27蛋白表达及预后的研究

目的:研究p27蛋白在胃癌组织的表达情况及其与胃癌生物学行为、预后的关系.方法:免疫组化SP法检测胃癌组织中p27蛋白的表达.结果:胃癌组织中27蛋白的表达阳性率为36.8%,无脉管侵犯病例p27表达高于有脉管侵犯病例,二者差异有显著性(P<0.05);p27低表达、有脉管侵犯、肿瘤直径≥4cm这3种因素与胃癌的不良预后有关.结论:p27蛋白表达为判断胃癌组织恶性程度及预后的有价值指标之一.     

猪圆环病毒3型衣壳蛋白的原核表达和鉴定

[目的]表达出猪圆环病毒3型(PCV3)衣壳蛋白(Cap),为PCV3免疫学检测方法建立基础.[方法]用PCR技术扩增PCV3-Cap基因片段,与pET-32a原核表达载体定向连接,构建重组原核表达质粒.经大肠杆菌表达后,通过SDS-PAGE来检测目的蛋白的大小与存在方式,并用小鼠抗PCV3-Cap抗体进行Western blot检测.[结果]用pET-32a原核表达系统成功表达出重组PCV3-Cap融合蛋白,其多以包涵体形式存在,纯化后的融合蛋白能与小鼠抗PCV3-Cap血清发生特异性结合,显示出良好的免疫反应性.[结论]原核表达出具有良好免疫反应性的PCV3 Cap.     

牛病毒性腹泻病毒非结构蛋白p7的克隆和原核表达纯化

为了对牛病毒性腹泻病毒(BVDV)p7蛋白进行表达和纯化,本研究开展p7基因克隆、原核表达载体构建和原核表达分析.依据GenBank数据库中BVDV毒株NADL的p7基因设计引物,以BVDV NADL的cDNA为模版,PCR扩增p7基因,测序鉴定后将其克隆至pCold-MBP原核表达载体中;优化蛋白诱导的IPTG浓度,...     

PTD-FNK蛋白的原核表达及纯化鉴定

【目的】原核表达Bcl-xL蛋白的突变体PTD-FNK蛋白,为揭示PTD-FNK蛋白的抗凋亡机制及加快其在家畜精液冷冻保存中的应用提供参考依据。【方法】根据FNK蛋白核苷酸序列设计两对突变引物,以pET-28a(+)-PTD-Bcl-xL质粒为模板,PCR扩增两段突变序列;回收PCR产物片段进行Dpn I消化,构建重组质粒并转化大肠杆菌DH5α,以IPTG诱导融合蛋白表达,探索IPTG诱导表达的适宜温度,最后以SDS-PAGE电泳和Western bloting对纯化蛋白进行鉴定。【结果】两个突变片段的PCR扩增产物大小分别为462和5616 bp,经Dpn I消化后进行重组反应,再转化至大肠杆菌DH5α能成功构建pET-28a(+)-PTD-FNK质粒。在30℃下以IPTG诱导7 h可获得可溶性的PTD-FNK蛋白,以NI-NTA Argrose纯化后的融合蛋白经Western blotting鉴定为PTD-FNK蛋白。【结论】通过调控IPTG诱导温度可成功以可溶性形式表达出PTD-FNK蛋白,且诱导时间短,无须复性,有利于蛋白纯化及加快其在家畜精液冷冻保存中的应用。     

PRRS病毒核衣壳蛋白基因的原核表达

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核酸序列设计1对引物，用RT—PCR扩增出美洲型PRRSV的核衣完蛋白(N)基因，克隆到pGEM—Teasy载体中，再亚克隆到表达载体pGEX—6p—1谷既甘肽—S—转移酶(GST)基因的下游。重组质粒转化大肠杆菌BL21，用IPTG于37℃条件下诱导，经SDS—PAGE和Western blotting分析，GST—N融合蛋白的分子质量约为39．5ku，另3种不同大小的GST—N降解产物，分子质量分别为33．0、30．5和27．5ku，其中39．5和30．5ku的降解产物分别占菌体蛋白的30．9％和15．3％。结果表明：PRRSV核衣壳蛋白基因在大肠杆菌中以GST融合蛋白的形式得到高效表达，且表达产物能与PRRSV抗体阳性的猪血清发生特异性反应，可作为PRRS诊断抗原。     

鸡贫血病毒衣壳蛋白基因的原核表达

[目的]为VP1蛋白的免疫学研究和鸡贫血病毒基因工程疫苗的研制奠定基础。[方法]将1个新克隆的鸡贫血病毒vpl基因（AF448446）在大肠杆菌DE3中进行表达,并对该蛋白进行纯化。[结果]结果表明：已成功构建了表达载体pET30（b^＋）-vp1;VP1蛋白已成功诱导表达并得以纯化;获得的VP1蛋白序列与已发表的VPl蛋白序列存在差异。[结论]试验克隆的vp1基因大小为1347bp,编码449个氨基酸的蛋白。     

鸡p15INK4B基因的克隆表达及纯化

为研究鸡p15INK4B蛋白的功能及为制备此蛋白的单克隆抗体提供材料,应用引物搭桥法合成p15INK4B基因,应用基因工程的手段构建p15INK4B基因的原核表达载体,在E.coliRosetta(DE3)菌进行融合表达,并对表达产物进行亲和层析纯化。结果成功地构建了p15INK4B基因原核表达载体,经亲和层析制备了较高纯度的目的表达产物。     

p27基因在宫颈癌组织中的表达及其意义

目的：探讨肿瘤抑制基因p27在宫颈癌组织中的表达及其临床意义。方法：应用免疫组织化学方法（SP法）检测p27基因在62例官颈癌组织和20例正常官颈组织中的表达。结果：62例宫颈癌组织中,p27的阳性表达率为38．7％（24／62）;p27的阳性表达与宫颈病灶大小、临床分期、细胞分化程度、转移及预后有密切关系（P〈0．01或〈0．05）;与宫颈癌的病理类型及年龄无关（P〉0．05）。结论：p27基因的表达与宫颈癌的生长、浸润及淋巴结转移有关,其表达水平的高低可作为判断宫颈癌预后的重要指标之一。     

猪干扰素-γ基因的表达、纯化及活性分析

依照猪IFN-γ基因序列设计引物,将该基因克隆至原核表达载体pET-30a,构建pET-30a-pIFN-γ重组表达载体,转化入寄主菌BL21(DE3),经PCR、双酶切、测序鉴定正确后,用IPTG进行诱导表达,可溶性的表达产物分别经镍柱和Sephadex-G100纯化;包涵体经DOC洗涤、SKL变性溶解、透析复性进行纯化,然后进行SDS-PAGE、Western-blot分析,并用细胞病变抑制法进行重组猪IFN-γ活性测定.结果表明:试验得到了高纯度的重组pIFN-γ,且纯化的重组猪IFN-γ蛋白具有较高的干扰病毒复制的活性,对PRV的活性为2.0×103U.mg-1,而对标准O型口蹄疫病毒的活性为2.56×105U.mg-1.     

人CYP27B1真核表达构建及其在293T细胞表达

CYP27B1是血清活性维生素D_3合成的关键酶,根据Gen Bank报道的序列设计特异引物,以Hep G2细胞的c DNA为模板,扩增CYP27B1的编码区,构建CYP27B1的真核表达载体,在293T细胞表达并检测其催化活性。结果表明,重组表达载体pc DNA-CYP27B1构建成功,pc DNA-CYP27B1及对照质粒pc DNA分别瞬时转染293T细胞。Western blot检测结果表明CYP27B1在293T成功表达。HPLC检测结果显示重组表达的CYP27B1能羟化25(OH)D_3生成1α,25(OH)_2D_3。     

森林草莓FveD27的表达特性和功能

[目的]新型植物激素独脚金内酯是调控植物分枝发育的关键因子,但独脚金内酯在草莓生长发育中的作用尚不清楚.揭示森林草莓(Fragaria vesca)中独脚金内酯生物合成关键基因DWARF27(D27)的表达特性及主要功能,探索FveD27在草莓分枝以及生长发育过程中的作用,为研究草莓植株构型奠定理论基础.[方法]本研究...     

甲状腺肿瘤中p53、bcl-2及c-myc蛋白的表达

目的 :探讨p5 3、bcl 2和c myc蛋白在甲状腺肿瘤中的表达意义。 方法 :应用免疫组化EnvisionTM法对 73例甲状腺肿瘤中 p5 3、bcl 2和c myc蛋白的表达进行检测。 结果 :3 6例腺瘤中 p5 3、bcl 2和c myc蛋白的阳性表达率分别为 :0 0 %( 0 / 3 6)、88.6%( 3 2 / 3 6)和 5 0 .0 %( 18/ 3 6) ;3 7例腺癌则分别为 :2 1.6%( 8/ 3 7)、64 .9%( 2 4/ 3 7)和 89.2 %( 3 3 / 3 7) ;p5 3、bcl 2、c myc蛋白分别在 3 6例腺瘤与 3 7例腺癌之间比较差异均有显著性 (P <0 .0 5或P <0 .0 1)。p5 3蛋白阳性表达的腺癌 8例 ,其bc1 2及c myc蛋白阳性表达率分别为 75 .0 %( 6/ 8)和 10 0 %( 8/ 8) ,在腺癌中 p5 3蛋白表达与bcl 2蛋白表达仅呈低度正相关 (r =0 .3 5 1,P <0 .0 5 )。 5例淋巴结转移性甲状腺癌中p5 3蛋白阳性表达率为 60 0 %( 3 / 5 ) ,但均无bc1 2蛋白阳性表达。结论 :p5 3、bcl 2及c myc蛋白可能共同参与甲状腺癌的发生发展 ;检测 p5 3蛋白有助于甲状腺良恶性肿瘤的鉴别     

猪脂肪特异性蛋白27基因的克隆与序列分析

基于电子延伸序列,克隆并分析了猪脂肪特异性蛋白27基因.各种组织提取总RNA,利用设计的引物进行RT-PCR,PCR产物与pMD19-T连接后转化E.coli JM109,检测阳性克隆并测序.猪FSP27基因的cDNA序列,其全长为745bp,开放阅读框为11-72Top,编码有238个氨基酸.同源分析结果表明,猪FSP27的核酸序列与人、小鼠和牛的同源性分别为86%、77.6%、82.3%.氨基酸序列的同源性分别为83.2%、74.4%、79.3%.组织分布结果显示:猪FSP27基因在多种组织均有分布.克隆的猪FSP27基因并注册GenBank(Accession.EU395789).     

p16与CyclinD1在骨肉瘤中的表达及临床意义

目的探讨细胞周期调控因子p16和CyclinD1在骨肉瘤中的表达及其临床意义。方法应用S-P免疫组织化学方法检测46例骨肉瘤和l6例骨软骨瘤组织中p16和CyclinD1的表达,并比较p16、Cyclin D1表达在骨肉瘤组织学分型、分化程度间的差异。结果46例骨肉瘤组织中p16和CyclinD1的阳性表达率分别为56.5%和69.6%;而它们在骨软骨瘤的阳性表达率为18.8%和25.0%,与骨肉瘤组比较差异有统计学意义(P<0.01)。骨肉瘤中,低分化组织p16的阳性率明显低于高分化组织(P<0.05);低分化组织CyclinD1的阳性率明显高于高分化组织(P<0.05),p16、CyclinD1在不同组织类型骨肉瘤中的表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论在骨肉瘤中p16和CyclinD1的表达异常,两者的表达都与骨肉瘤的病理分期无关,但与分化程度有关。提示它们在骨肉瘤的发生、发展中可能起重要作用,可作为判断骨肉瘤患者预后的参考指标之一。     

牦牛HSP27基因的克隆及其在雌性生殖器官中的表达

【目的】克隆牦牛热休克蛋白27(heat shock proteins27,HSP27)基因,分析其生物学特性,研究正常生理条件下HSP27基因在母牦牛主要生殖器官中的表达差异。【方法】采取卵泡期后期、黄体期后期同侧的卵巢、输卵管和子宫,以及妊娠期早期（胚胎约长2.3cm）妊娠侧的卵巢、输卵管和子宫组织,以其cDNA为模板,利用RT-PCR扩增牦牛HSP27基因,并将纯化的PCR产物克隆到pMDTM18-T Vector 载体中进行测序;利用生物信息学软件对HSP27基因的特征进行生物信息学分析,预测功能结构域;采用实时荧光定量 RT-qPCR 测定繁殖周期母牦牛主要生殖器官中的相对表达量,用SPSS19.0软件对试验数据进行差异显著性分析。【结果】成功克隆出包含完整编码区的牦牛HSP27基因序列,其编码区长450bp（GenBank 登录号：KP716832）,可编码149个氨基酸,其中含量最高的是亮氨酸Leu（10.7%）,含量最低的是色氨酸Trp（0.7%）。HSP27编码区蛋白原子个数为2 366,分子式为C747H1189N205O220S5,分子量为16.722kD,理论等电点为5.33;HSP27编码蛋白为非跨膜可溶性蛋白。同源性分析显示,牦牛HSP27基因的核苷酸序列与家牛、印度水牛、绵羊、藏羚羊、虎鲸、野骆驼、野猪、马、灰狼、人和猩猩的核苷酸序列同源性分别为99.8%、98.4%、97.8%、97.6%、90.3%、89.7%、89.7%、86.7%、86.7%、85.5%和85.3%,牦牛HSP27基因的氨基酸序列与家牛、印度水牛、绵羊、藏羚羊、虎鲸、野骆驼、野猪、马、灰狼、人和猩猩的氨基酸序列同源性分别为100%、100%、100%、100%、96.3%、100%、96.8%、100%、100%、96.3%和96.3%;系统进化树表明,牦牛HSP27基因与家牛、印度水牛、绵羊和藏羚羊的进化水平较为相近,与灰狼、猩猩和人类的较远。RT-qPCR结果表明,牦牛HSP27基因在卵泡期、黄体期、妊娠期不同时期的卵巢、输卵管和子宫组织中均有表达,其中在卵泡期卵巢中的表达量最高,在黄体期子宫中的表达量最低;在不同繁殖周期,牦牛HSP27基因在卵巢中的表达均极显著大于在子宫中的表达,其在卵巢、输卵管和子宫的表达因妊娠而发生了显著变化。【结论】通过与其他物种HSP27基因的同源性对比分析,发现HSP27基因在进化中具有高度保守性,同时也存在种属特异性;通过对HSP27在繁殖周期母牦牛主要生殖器官中的表达情况分析,推测出HSP27可能参与了母牦牛妊娠的调控,为进一步探讨HSP27在牦牛生殖过程中发挥的作用提供了参考资料。     

斑马鱼p53基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

利用原核表达系统克隆表达斑马鱼p53基因。RT-PCR法从斑马鱼胚胎中扩增获得p53基因编码区,并将其克隆至原核表达载体pET28a上,构建重组质粒pET28a/z-p53,将重组质粒转化E.coli BL21(DE3)受体菌,IPTG诱导表达,表达产物经镍柱纯化、尿素透析复性,SDS-PAGE电泳分析,结果表明,p53基因在大肠杆菌中成功表达,表达的p53融合蛋白分子量大约为53kD,透析复性后获得了高纯度可溶性的p53蛋白。