△6-脂肪酸脱饱和酶基因种子特异表达载体的构建

以napA基因序列设计引物，以甘蓝型油菜中油821基因组总DNA为模板，通过PCR扩增，克隆了种子特异表达napin启动子。序列分析表明，试验得到扩增片段长1148bp，含有其它napin启动子序列共有的高度保守序列。将扩增序列与真菌匍枝根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因RnD6D连接，构建了RnD6D的种子特异表达载体pCNR，为获得高产γ-亚麻酸的转基因油菜奠定了基础。     

棉花种子特异性启动子的克隆及表达载体构建

种子特异性表达启动子是植物种子基因工程改良的重要工具.Lea(Late embryogenesis abundant)蛋白是胚胎发育后期种子中大量积累的一系列蛋白质,因此,其调控序列可能提供一个很好来源的种子特异性表达启动子.为研究植物Lea蛋白基因启动子在种子中的特异性表达,本研究通过PCR扩增,从亚洲棉(Gossy...     

果实特异启动子调控薄皮甜瓜ACC合成酶反义基因植物表达载体的构建

从成熟的薄皮甜瓜(齐甜1号)果肉组织中提取总DNA,经PCR扩增得到约0.5kb的ACC合成酶基因的片段,将其克隆到质粒载体pMD18-T中,测序表明,该基因为583bp,编码194个氨基酸;从番茄(东农706)叶片组织中提取总DNA,经PCR扩增得到约2.2kb的E8基因片段,将其克隆到质粒载体pGEM-TEasy中,测序表明,该基因为2192bp;以pCAM2301为起始植物表达载体,pCAM-GT为中间载体,成功构建了果实特异启动子(E8)调控薄皮甜瓜ACC合成酶反义基因植物表达载体,采用冻融法将其转入根癌农杆菌LBA4404,得到了完整的Ti质粒表达载体系统。     

陆地棉异质型ACCase基因的种子特异表达载体构建与遗传转化

异质型ACCase催化乙酞CoA形成丙二酞辅酶A是植物脂肪酸合成途径中的第一个关键的步骤,也是限速步骤:植物体内过量表达ACCase能够增加脂肪酸合成的底物,有可能导致植株种子含油量的增加.本实验采用GUS基因瞬时表达检测棉花愈伤组织中种子特异性表达启动子AGP的活性;利用RT-PCR扩增,克隆了陆地棉异质型ACCas...     

棉花种子特异表达的LEA启动子克隆及功能验证

以棉花品种新陆早33号为材料,克隆获得其胚胎发育晚期丰富蛋白LEA基因的种子特异性启动子。启动子序列全长为1228bp;作用元件分析表明该区域除了具有启动子核心调控序列外,还含有多个与组织特异性、激素、逆境等表达相关的顺式作用元件,如E-box、ABRE元件、A-box等。与已报道的棉花品种Coker 201的LEA基因D34的5'端上游调控序列1212bp相比,两者具有97%的一致性。拟南芥遗传转化的功能分析结果表明,所克隆的序列能驱动GUS基因在种子中特异表达,且GUS主要在转基因植物的种子发育后期表达;其表达强度要弱于组成型的CaMV35S启动子。研究结果不仅有助于进一步深入认识棉花LEA基因功能及其表达调控规律,也为植物遗传转化提供组织特异性的启动子。     

棉花纤维特异表达GhCesA4启动子的克隆及序列分析

 以新疆陆地棉品种新陆早19的DNA为模板,克隆了棉花纤维特异启动子GhCesA4,GenBank登录号：EU183119 ,将启动子基因序列克隆到pMD19-T载体中,由载体通用引物M13-47、RV-M 经PCR鉴定获得pMD19-T/GhCesA4重组载体。测序和序列分析表明,该启动子序列由1503 bp核苷酸组成,与GenBank中GhCesA4基因启动子序列同源性高达98％。分别用限制性内切酶ClaⅠ和BamⅠ双酶切重组质pMD19-T/GhCesA4和双元植物表达载体pBI121,分别回收pMD19-T/GhCesA4重组质粒中的GhCesA4小片段和pBI121 植物表达载体中缺失CaMV35S组成型启动子的大片段,经连接、转化、酶切及测序鉴定,获得由GhCesA4驱动报告基因GUS的新型植物表达载体,命名为pBI-GhCesA4     

大豆gma-miR160o启动子的克隆及植物表达载体构建

为了研究miRNA表达的调控机制,以大豆Williams 82基因组DNA为材料,根据预测的gma-miR160o启动子序列设计引物,采用PCR方法克隆gma-miR160o上游一段长度为1 910 bp的启动子序列。采用Plant CARE和PLACE启动子在线预测工具分析表明,gma-miR160o启动子序列具有TATA-box、CAAT-box基本的顺式作用元件和一些参与非生物胁迫、光和植物激素应答相关的顺式作用元件。将gma-miR160o启动子替代p BI121载体中的Ca MV35S启动子,构建了与GUS融合的启动子表达载体。     

大豆gma-miR169c启动子的克隆及植物表达载体构建

本研究以大豆Williams 82基因组DNA为材料,根据预测的gma-mi R169c启动子序列设计引物,采用PCR方法克隆得到gma-mi R169c上游一段长度为1 935 bp的启动子序列。采用Plant CARE启动子在线预测工具分析表明,gma-mi R169c启动子序列具有TATA-box、CAAT-box基本的顺式作用元件和一些参与非生物胁迫和植物激素应答相关的顺式作用元件。将gma-mi R169c启动子部分缺失序列替代p BI121载体中的Ca MV35S启动子,构建了与GUS融合的启动子元件缺失表达载体。研究结果为进一步分析gma-mi R169c启动子元件的功能和调控机制奠定了基础。     

甘蓝型油菜oleosin基因片段的克隆及序列分析

以油菜（Brassica napus）基因组DNA为模板,通过设计一对特异性引物,利用多聚酶链式反应（PCR）扩增获得oleosin基因片段。将其克隆到E.coli质粒上进行序列分析。结果表明,该基因由878个碱基组成,含一个内含子,编码193个氨基酸。不计附加的18 bp凝血酶切割序列,与已报道的序列相比较,核苷酸序列及推导出的氨基酸序列的同源性分别为79.20%和91.21%。推测的氨基酸序列构成的蛋白质具有oleosin的基本结构特点,包含3个结构区域：两性N末端区（an amphipathic N-terminal region）,中心疏水区（a central hydrophobic domain）,两性C-末端区（an amphipathic C-terminal domain）。     

甘蓝型油菜PEPC基因保守序列的克隆和种子特异性ihpRNA表达载体的构建

为了通过转基因途径获得油菜种子中PEPC基因发生转录后基因沉默,通过PCR扩增分别分离得到了甘蓝型油菜种子特异性表达的Napin启动子序列（1138bp）和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）基因保守序列（181bp）,将它们分别克隆到pMD18-T载体中,利用中间载体pBS-NEI构建了PEPC基因的反向重复框。再将PEPC基因片段以正向的方式连接到一个可剪切的内含子5＇末端,以反向的方式连接到该内含子的3＇末端;然后将Napin启动子序列克隆到植物表达载体pCAMBIA1391的pUC18多克隆位点上,获得了种子特异表达的载体pCAMNapin;再将PEPase基因的反向重复序列克隆到pCAMNapin载体Napin启动子的3＇末端,构建了具有种子特异性表达的PEPC基因的ihpRNA表达载体pCAMNapin-B2-NEI-B1。通过限制性内切酶酶切对载体作了鉴定分析。     

甘蓝型油菜 LPAT5基因克隆与表达分析

克隆并对溶血磷脂酸酰基转移酶时空表达和逆境表达进行分析,旨在为进一步研究其生物学功能奠定基础。结合同源克隆与半定量RT-PCR的方法,克隆得到甘蓝型油菜湘油15 LPAT5的1条全长1041 bp 的CDs序列,并命名为BnLPAT5。序列分析表明,它具有LPLAT_LCLAT1样结构域,属于LPLAT超基因家族。时空表达分析表明, BnLPAT5在根中的表达量最高,是茎和胚的2倍。逆境分析表明,BnLPAT5在NaCl、PEG4000、水渍、6BA和ABA的胁迫下呈现2种不同的表达模式,他们均对BnLPAT5基因的表达具有抑制作用。在NaCl、PEG4000及水渍处理下,BnL-PAT5呈“骤降缓升”的表达模式,处理3 h时,达到最低表达量。对于6BA和ABA的处理,BnLPAT5却呈现“缓降缓升”的表达模式,处理12 h时,表达量最低。极差分析显示,高盐、干旱、水渍、6BA和ABA对BnLPA5基因的表达影响程度相当,相对而言,高盐对其表达的影响较大。试验首次从甘蓝型油菜中克隆得到LPAT5的1个拷贝,并分析了其时空表达和逆境表达,认为所得基因为普遍表达基因,并对干旱比较敏感。     

甘蓝型油菜BnDGAT3基因克隆与载体构建及其生物信息学分析

二酰甘油酰基转移酶(DGATs)是肯尼迪途径中三酰甘油合成的限速酶,DGAT3基因是DGAT基因家族重要成员之一,参与植物体内油脂代谢。为进一步探索甘蓝型油菜BnDGAT3基因功能,本研究通过查找拟南芥AtDGAT3 (AT1G48300),并在Brassica Database数据库检索到2条甘蓝型油菜DGAT3序列,以此为参考序列设计引物,在甘蓝型油菜W0111中克隆了大小均为1 071 bp的BnDGAT3两个拷贝,分别命名为BnDGAT3-1、BnDGAT3-2;经双酶切技术,构建pBI101-DGAT3-35S载体,并转化根癌农杆菌GV3101。2条BnDGAT3序列经生物信息学预测结果显示:BnDGAT3编码的氨基酸均为356,理论分子量约38 442.55 Da;BnDGAT3蛋白的二级结构大致相同且无跨膜结构,由具有TRX-like Fds及含有类似TRX-like Fd结构域的蛋白组成,属于TRX-like Fdfamily超基因家族;BnDGAT3均含有相同数目的外显子和内含子,分别位于A08、C08染色体上。本研究克隆的BnDGAT3经生物信息学分析表明该基因是DGAT3基因家族成员,为进一步探索甘蓝型油菜BnDGAT3基因功能及油菜分子育种提供帮助。     

甘蓝型油菜TIP4;1基因的克隆与表达分析

水孔蛋白是位于质膜和液泡膜等生物膜上主要负责水分跨膜运输的通道蛋白。为了分析甘蓝型油菜种子萌发过程水分调控的分子机制,采用RT-PCR法从甘蓝型油菜种子中克隆了液泡膜内在蛋白(Tonop last intrinsic proteins,TIPs)TIP4;1基因片段序列,并对甘蓝型油菜种子TIP4;1基因在种子萌发过程及干旱、低温和盐胁迫下的表达进行了qRT-PCR(Quantitative Real-time PCR)分析。结果表明,TIP4;1基因在干种子中表达水平很低,但是在种子萌发过程中表达量增加。此外,在干旱、低温及盐的胁迫处理下,TIP4;1基因的表达上调,结果暗示着该基因可能参与了甘蓝型油菜种子萌发和逆境响应过程。随着研究的深入,水孔蛋白的水分调控机制将进一步被揭示,这对于解决干旱胁迫和盐胁迫等实际问题具有重大现实意义。     

甘蓝型油菜依赖焦磷酸的磷酸果糖激酶(PFK)基因片段克隆及hpRNAi载体构建

依赖焦磷酸的磷酸果糖激酶(PFK)是糖酵解途径的关键酶。本研究首先构建带有种子特异性napin启动子和Nos终止子的植物表达载体2300-nap及带有组成型35S启动子和Nos终止子的植物表达载体2300-35S;然后用PCR法从甘蓝型油菜(BrassicanapusL.)中油119总基因组中扩增出依赖焦磷酸的磷酸果糖激酶(PFK)基因片段,再以扩增出的PFK基因片段作模板设计引物扩增出一个相应的小片段。将两个PFK基因片段反向连接,插入到植物表达载体2300-nap的napin启动子和nos终止子之间,植物表达载体2300-35S的35S启动子和nos终止子之间,分别构建成可转录表达出发夹RNA(hairpinRNA,hpRNA)结构的种子特异型和组成型油菜RNA干扰载体,为今后油菜利用RNA干扰(RNAi)提高含油量的基因工程研究奠定了基础。     

甘蓝型油菜防御素基因的克隆与生物信息学分析

为了研究甘蓝型油菜防御素基因的结构和功能,根据白菜防御素基因序列设计引物,采用RT-PCR方法从甘蓝型油菜中克隆到4个防御素基因,并对其序列进行了生物信息学分析。结果表明,甘蓝型油菜防御素基因cDNA全长325~335 bp,包含231~243 bp的开放阅读框,编码76~80个氨基酸;防御素基因在长期进化过程中产生了显著的差异,但防御素含有的8个保守半胱氨酸残基均稳定存在;Bndef1、Bndef2、Bndef3与萝卜Rs-AFP1、诸葛菜Omdef亲缘关系较近,Bndef4与豇豆Vudef亲缘关系较近;4个防御素蛋白均为稳定蛋白,具有信号肽结构,可能为分泌蛋白。     

甘蓝型油菜烯脂酰-CoA还原酶基因BnECR的克隆及功能分析

反式烯脂酰-CoA还原酶(trans-2, 3-enoyl-CoA reductase, ECR)是催化超长链脂肪酸(VLCFAs)合成的脂肪酰-CoA延长酶之一。根据已报道拟南芥等的ECR基因设计引物,采用RACE (rapid amplification of cDNA ends)方法从甘蓝型油菜中克隆ECR的全长cDNA序列和对应的基因组序列,命名为BnECR (GenBank登录号分别为FJ899705和FJ899706)。序列分析结果显示,BnECR的全长cDNA序列为1 328 bp,对应的基因组序列为2 093 bp,由4个外显子组成,在ORF的上、下游分别有一个163 bp的5′UTR和一个232 bp的3′UTR。根据编码区预测BnECR前体蛋白为一个310个氨基酸残基的多肽链,包含ECR蛋白的重要功能位点K₁₄₄、R₁₄₅及一个NAD(P)H结合基序G₂₂₅SGGYQIPR/HG₂₃₄。NCBI Blastn、氨基酸序列多重比对及保守域分析表明, 该基因与拟南芥AtECR基因的同源性最高,是对应拟南芥AtECR的垂直同源基因。RT-PCR分析表明,BnECR基因在甘蓝型油菜根、茎、叶、花及角果中均有表达,其中在茎中的表达量最高。BnECR在高芥酸材料种子发育中后期的表达量显著高于低芥酸种子,表明BnECR可能参与甘蓝型油菜芥酸的合成。将BnECR克隆到酿酒酵母的穿梭表达载体中,分别转化野生型酵母By4743和突变体菌株YDL015c,添加半乳糖诱导表达。气相色谱分析表明,BnECR在酿酒酵母中有效表达,转化菌株中的芥酸(C22:1)占总脂肪酸含量的1.34%,比对照增加了52%;对突变体的转化结果表明芥酸含量恢复到野生型水平。     

Maternal Effects on the Expression of Individual Aliphatic Glucosinolates in Seeds and Seedlings of Brassica napus

An investigation into the glucosinolate profile of seed and leaf tissue of F₁ hybrids from reciprocal crosses between B. napus‘Cobra’ and a synthetic B. napus line was undertaken to test hypotheses concerning the site of biosynthesis of seed glucosilates. The profile of the seed aliphatic glucosinolates was dentical to the maternal parent suggesting the absence of glucosinolate biosynthesis and glucosinolate interconversion within the embryo and the transfer of fully formed glucosinolates from maternal tissue into the developing seed. In cotyledons, while there was no evidence for de novo glucosinolate biosynthesis, there was evidence for side chain modication and the interconversion of existing glucosinolates. in true leaves, the glucosinolate profile of the reciprocal F₁ hybrids were identical, and in accordance with that expected from the F₁ genotype.