绵羊intelectin基因cDNA克隆与序列分析

【研究目的】克隆并分析绵羊intelectin基因;【方法】十二指肠粘膜组织提取总RNA,分别以上游电子克隆的拼接体和下游保守区为模板设计引物进行RT-PCR,PCR产物与pMD-19T载体连接后转化E. coli JM109,筛选阳性克隆并测序;【结果】克隆的绵羊intelectin基因与牛、猪、人、大鼠的同源性分别为93%、87%、83%、79% ,预测的氨基酸序列包含FBG结构域。【结论】成功克隆了绵羊intelectin-2基因,并注册GenBank (Accession. EF624459)     

绵羊regakine-1基因的克隆与序列分析

【研究目的】克隆并分析绵羊regakine-1基因;【方法】肠系膜淋巴结组织提取总RNA,利用设计的引物进行RT-PCR,PCR产物与pMD-19T载体连接后转化JM109感受态细胞,筛选阳性克隆、测序,并进行序列分析;【结果】克隆的绵羊regakine-1基因与牛的同源性为91%,推测的氨基酸序列信号肽为1~21aa,SCY结构域为29~87aa,结构特征与牛的相一致。【结论】克隆了绵羊regakine-1基因的ORF,并注册GenBank (AccessionEF617337)     

猪Musclin基因片段克隆与序列分析

【研究目的】克隆并分析猪musclin基因；【方法】肌肉组织提取总RNA，利用设计的引物进行RT-PCR，PCR产物与pMD19-T连接后转化E. coli DH5α，检测阳性克隆并测序；【结果】克隆的猪musclin基因片段与人、大鼠、小鼠同源性分别为86%、78%、75%，预测的氨基酸序列含有“KKKR”结构和与小鼠ANP、BNP、CNP蛋白的同源性区域；【结论】克隆了猪musclin基因片段并注册GenBank (Accession.EF369511)。     

德州驴生长激素基因的克隆与序列分析

摘要：【研究目的】为了研究德州驴生长激素基因的多态性及其对生长发育的影响,【方法】根据不同物种同一基因序列的同源性比对结果,在线设计引物,应用PCR 技术克隆基因,用生物信息学方法对获得的德州驴GH基因DNA序列及其推定cDNA、氨基酸序列进行分析。【结果】结果表明德州驴GH基因DNA序列约为1928bp,包含完整的5个外显子和4个内含子,德州驴GH基因DNA序列与德宝矮马67、蒙古马、猪、牛、绵羊和人GH基因序列的同源性分别为98.8%、98.2%、79.4%、68.3%、70.9%和68.3%,cDNA编码的氨基酸序列同源性分别为99.5%、98.6%、97.2%、89.8%、88.9%和68.4%。【结论】表明GH基因在进化上非常保守。     

猪脂肪特异性蛋白27基因的克隆与序列分析

基于电子延伸序列,本试验克隆并分析了猪脂肪特异性蛋白27(fat specific protein 27)基因.各种组织提取总RNA,利用设计的引物进行RT-PCR,PCR产物与pMD19-T连接后转化E. coli JM109 ,检测阳性克隆并测序。猪FSP27基因的cDNA 序列,其全长为745bp,开放阅读框为11-727bp,编码有238个氨基酸。同源分析结果表明,猪FSP27的核酸序列与人、小鼠和牛的同源性分别为86%、77.6%、82.3%,氨基酸序列的同源性分别为83.2%、74.4%、79.3% 。组织分布结果显示：猪FSP27基因在多种组织均有分布。克隆的猪FSP27基因并注册GenBank (Accession.EU395789)。     

CD147基因在家兔肠道的克隆与结构预测

基于电子延伸序列,克隆并分析兔CD147基因.采用兔十二指肠黏膜组织提取总RNA,进行RT-PCR反应,测序并进行结构预测.克隆的兔CD147基因包含一个完整的开放阅读框架,全长为810 bp,编码由270个氨基酸残基组成的CD147前体蛋白,推导的氨基酸序列信号肽为1～16个氨基酸.氨基酸序列与牛、人、褐鼠、野猪的同源性分别为62.5%,65.9%,59.5%和66.3%,三级结构预测表明CD147具有2个免疫球蛋白类似区.试验成功克隆了兔CD147基因,注册到GenBank(Accession.EU650668),并预测其三级结构,为进一步研究其生物学功能奠定基础.     

绵羊Gastorkine-1基因的克隆与序列分析

基于电子延伸序列,克隆并分析了绵羊Gastorkine-1基因。提取皱胃黏膜组织总RNA,利用设计的引物进行RT-PCR,PCR产物与pMD19-T载体连接后转化E.coliJM109感受态细胞,检测阳性克隆并测序。克隆的绵羊Gas-torkine-1基因长619 bp,编码185个氨基酸,与人、小鼠、猪、牛的同源性分别为82.0%,48.8%,85.4%,96.9%,推测的氨基酸序列信号肽为1~20 aa,BRICHOS结构域为54~150 aa,结构特征与人、小鼠、猪、牛的Gastorkine-1相一致。     

荞麦BTI全长基因的克隆及表达分析

【研究目的】扩增荞麦胰蛋白酶抑制剂(Buckwheat trypsin inhibitor,BTI)基因,并对其表达特性和氨基酸同源性进行分析。【方法】根据荞麦胰蛋白酶抑制剂氨基酸的保守序列设计简并引物,采用RT-PCR和RACE技术,以荞麦cDNA为模板,扩增BTI基因并进行序列及其表达谱分析。【结果】克隆得到了BTI基因。它的cDNA全长为459bp,含有一个216bp的完整阅读框,编码72个氨基酸。同源性分析表明,其蛋白质序列与已报道的荞麦种子提取的BWI-1的氨基酸序列的同源性达96%,与笕属植物ATI、亚麻属植物Luti、马铃薯蛋白酶抑制剂PPI-I的氨基酸序列的同源性分别为65%、59%、48%。RT-PCR分析表明,BTI基因可在不同的组织中进行表达,但经伤害处理后的叶片中其表达量略高于生长各阶段。这可能与逆境情况(如外界损伤)下的应答等生理过程有关。【结论】荞麦BTI基因的获得,可为荞麦胰蛋白酶抑制剂的基础及应用研究奠定基础。     

鸡Muslin cDNA克隆与序列分析

基于电子延伸序列,本试验克隆并分析了鸡Muslin基因。肌肉组织提取总RNA,利用设计的引物进行RT-PCR,PCR产物与pMD19-T连接后转化E.coliDH5α,检测阳性克隆并测序;克隆的Musclin基因与人、大鼠、小鼠同源性分别为74%,73%,70%,推测的氨基酸序列同源性分别为58%,54%,50%,氨基酸序列含有"KKKR"结构和与小鼠ANP,BNP,CNP蛋白的同源性区域。试验成功克隆了鸡Musclin基因并注册GenBank(EF551041)。     

香蕉果实凝集素基因的克隆及原核表达

【研究目的】植物凝集素具有重要的生理功能,通过原核表达香蕉凝集素基因(BanLec)并探讨其功能具有重要意义。【方法】提取了巴西蕉果肉总RNA,利用RT-PCR方法扩增BanLec cDNA 全长序列,并对该序列进行分析。将BanLec克隆至表达载体pET-30a,并将筛选到的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行诱导表达。【结果】克隆到的BanLec cDNA 序列为460bp,开放读码框为426bp,编码142个氨基酸。与其它已知的香蕉凝集素基因相比较,核苷酸和氨基酸序列同源性分别为94%和93%以上。SDS-PAGE 分析结果表明,经IPTG诱导,BanLec基因以融合蛋白形式表达,相对分子量约为20kD。【结论】该研究为探讨香蕉凝集素的活性及生化功能等奠定基础。     

小鼠不同组织中催乳素释放肽 受体基因表达的研究

【研究目的】克隆并研究小鼠催乳素释放肽受体基因在妊娠期小鼠不同组织的表达【方法】提取小鼠不同组织总RNA,进行RT-PCR,PCR产物与pMD-19T连接后转化E.coli DH5a,检测阳性克隆并测序【结果】测序结果表明,所得序列与小鼠催乳素释放肽编码区序列的相似性为99.49%【结论】克隆所得序列为小鼠催乳素释放肽受体基因片段,催乳素释放肽在妊娠期小鼠不同组织均有表达     

鲤鱼TLR8基因的克隆及组织表达

为获得鲤鱼TLR8基因序列,并明确其在不同组织的表达情况。通过RT-RCR方法克隆了鲤鱼TLR8基因序列,利用荧光定量PCR分析了TLR8 基因的表达特征。结果表明：所得鲤鱼TLR8基因序列1349bp,开放阅读框（ORF）序列1113bp,GeneBank登陆号为KT886923。另外,该克隆序列与金钱鲃、斑马鱼的序列同源性分别达到91%、82%,但与人和鼠等哺乳动物的序列同源性却很低。表达分析显示,TLR8基因在所有被检测的鲤鱼组织中均表达,尤其是在肠道和脾脏中的表达水平显著高于其它组织（p＜0.05）。总之,本研究成功获得了鲤鱼TLR8基因序列,证明其在肠道、脾脏和皮肤中的特异性表达,为进一步研究TLR8基因在鲤鱼免疫应答中的作用提供了基础。     

猪瘟病毒河南野毒株E2基因的克隆及序列分析

【研究目的】旨在了解猪瘟病毒流行毒株的变异情况,为防制猪瘟提供科学依据。【方法】根据GenBank上已发表的猪瘟石门株E2基因序列,设计合成了1对特异引物,应用RT-PCR技术对河南省一猪场采集的疑是猪瘟病料的猪瘟野毒E2基因进行扩增,将扩增的E2基因克隆于pGEM-T Easy载体,对其进行了序列测定及氨基酸序列推导,同时将其与HCLV株、C株、Alfort株和Brecsia株进行了同源性比较及遗传进化分析,并构建了CSFV的遗传发生树。【结果】通过PCR扩增得到与预期大小相等的产物,克隆测序验证是E2基因;所扩增的流行野毒与HCLV株、C株、Shimen株、Alfort株和Brecsia株核苷酸序列同源性分别为99.0%,96.5%,93.5%,94.4%和89.9%;氨基酸同源性分别97.8%,94.0%,92.6%,92.0% 和91.0%;所绘制的遗传发生树显示所测得流行野毒与C株、HCLV株关系较近。【结论】所测的流行株与与我国使用的C株疫苗毒核苷酸同源性很高,说明现行的猪瘟疫苗在一定程度上仍然可以起到保护作用。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因A抗原位点的克隆及原核表达载体的构建

【研究目的】对猪传染性胃肠炎病毒S基因A抗原位点进行克隆和原核表达载体的构建。【方法】参考GenBank上公布的TGEV S基因A抗原位点序列,应用Primer6.0设计一对含酶切位点的引物,用于RT-PCR扩增A抗原位点目的片段,将扩增产物连接于paesy-T克隆载体上构建克隆载体,用EcoR I和Xhol I对表达载体PET-32a（+）和重组质粒进行酶切,将酶切产物亚克隆至PET-32a（+）多克隆位点上,连接、转化至BL21(DE3),构建A位点的原核表达载体,并对阳性重组质粒进行酶切、PCR和测序鉴定。【结果】所扩增的目的片段的大小为534bp,与原核表达载体连接后,经核苷酸及推导的氨基酸序列分析表明,该基因与其它猪传染性胃肠炎病毒相应基因具有很高的同源性,说明成功地构建了TGEV S 基因A抗原位点的原核表达载体。【结论】TGEV S 基因A抗原位点原核表达载体的成功构建,填补了中国国内单独针对此位点进行研究的空白,也为TGEV诊断方法的建立提供良好的技术基础。     

甘草甜素对金黄色葡萄球菌诱发小鼠实验性乳腺炎的影响

【目的】探讨甘草甜素对金葡菌所致小鼠乳腺炎控制效果；【方法】30只BALB/C雌孕鼠随机分成正常对照组（Con,n=10）、阳性对照组（P,n=10）和试验组（T,n=10）。阳性对照组和试验组母鼠于产后8-10d经乳头管注入50μl 7.0×102CFU细菌悬液，生理盐水组注入50μl 灭菌生理盐水。30只母鼠于接菌-12h、0h、12h、36h腹腔注射甘草甜素88mg/kg或生理盐水0.2ml。接菌后66h处死小鼠，取乳腺组织固定，进行组织学观察；【结果】观察显示P组的小鼠乳腺组织破坏得最为严重。P组小鼠乳腺组织间质宽度与正常对照组相比极显著增加（p＜0.01）,T组小鼠乳腺组织间质宽度极显著高于正常对照组（p＜0.01），与P组相比极显著减少（p＜0.01）；与正常对照组相比，P组小鼠乳腺组织中TNF-α、INF-γ含量极显著升高（p＜0.01），T组小鼠乳腺组织中TNF-α、INF-γ含量与P组相比极显著降低（p＜0.01）。【结论】结果表明，甘草甜素不仅减少乳腺内的细菌数，降低对组织的损伤，而且减轻乳腺炎症变化及全身反应，对乳腺具有一定的保护作用。     

牛ANGPTL2基因结构与功能的生物信息学分析

以牛的血管生成素样蛋白2(Angiopoietin-like protein2,ANGPTL2)基因为研究对象,运用生物信息学方法对其编码的蛋白质结构、理化性质及功能结构域进行分析。结果表明:牛ANGPTL2基因cDNA全长21 141 bp,最长开放阅读框为1 482 bp,编码493个氨基酸;序列比对结果显示,牛的ANGPTL2基因与人、家犬、鸭嘴兽、原鸡、斑马鱼、家马、小家鼠、野猪的核苷酸序列同源性分别为25.3%,24.7%,24.2%,24.3%,24.8%,24.9%,25.3%,25.5%;牛AN-GPTL2基因编码的氨基酸序列与上述其他动物的同源性分别为98.0%,96.8%,9.1%,6.3%,6.9%,51.9%,94.5%,98.2%;系统进化分析结果显示,在人、野猪、家犬、家马等动物中,牛的ANGPTL2基因与野猪的进化关系最为密切,亲缘关系最近;牛ANGPTL2蛋白中α螺旋较多,含有一个跨膜区。     

苎麻肉桂酰辅酶A还原酶基因cDNA序列的克隆与分析

根据苎麻转录组测序信息,利用RACE法克隆出2个肉桂酰辅酶A还原酶基因全长cDNA序列,对其进行生物信息学分析,并利用荧光定量技术对苎麻快速生长期、成熟期和成熟后期该基因在木质部和韧皮部的表达模式进行研究。结果表明,BnCCR1全长1056 bp,编码277个氨基酸,Blast比对BnCCR1基因与白桦、蓖麻CCR基因核苷酸序列相似性均为70%,推测的氨基酸与蓖麻CCR基因氨基酸序列相似度为77%,蛋白质预测显示其N端存在一个3 Beta-HSD/Epimerase/NAD-binding-10的保守域;BnCCR2基因全长1291 bp,编码248个氨基酸,Blast比对BnCCR2基因与毛果杨CCR基因核苷酸序列相似度为74%,推测的氨基酸与蓖麻、毛果杨CCR基因氨基酸序列相似度均为81%,蛋白质预测显示其N端存在一个3 Beta-HSD/Epimerase/NAD-binding-4的保守域;BnCCR1和BnCCR2基因编码蛋白三维模型与矮牵牛CCR基因相似度分别达30.68%、44.77%,建模结果可靠;荧光定量结果显示BnCCR1和BnCCR2基因具有时期表达差异性,不具有组织表达差异,但不同组织表达量具有差异。推测BnCCR1和BnCCR2基因是存在于苎麻木质素代谢中的两种CCR基因。