石斑鱼神经坏死病毒RNA干扰的

克隆了石斑鱼神经坏死病毒(Nervous necrosis virus,NNV)的衣壳蛋白(Major capsid protein,MCP)基因序列并构建了绿色荧光蛋白(EGFP)基因与MCP基因的融合真核表达载体pEGFP-MCP,设计了3对针对MCP基因序列的小片段干扰性RNA(Small interrering...     

海水青鳉雌激素受体基因的克隆、组织表达特性及环境雌激素EE2对其表达的影响

为了获得海水青鳉Oryzias melastigma雌激素受体的基因信息及其表达特性,采用RACE-PCR技术和实时荧光定量PCR方法,进行了雌激素受体基因的克隆、表达特性分析及其在17α-炔雌醇(EE2)暴露下的基因响应研究。结果表明:海水青鳉雌激素受体基因与其他脊椎动物雌激素受体基因同源性较高,特别是DNA结合结构域(DBD)在进化上高度保守,配体结合结构域(LBD)次之;OM-ERα/β1/β2在所检测的10种组织中均有表达,其中在青鳉肝脏、性腺、脾脏和肠中表达量较高;OM-ERα在肝脏中的表达和OM-ERβ1/β2在性腺中的表达,雌雄间存在显著性差异(P0.05);在EE2浓度为5、50、500ng/L的水体中暴露96 h后,海水青鳉仔鱼中的分子标志物卵黄蛋白原基因(vtg1)被显著诱导(P0.05),且呈浓度依赖关系;中浓度(50 ng/L)的EE2诱导仔鱼OM-ERβ1基因表达,OM-ERβ2对EE2暴露呈现低浓度诱导、高浓度抑制的趋势;攻毒试验结果表明,OM-ERα和vtg1之间存在一种正相关关系,暗示EE2可能主要通过ERα调控vtg1基因的表达;EE2攻毒下,β亚型存在一种倒U型的剂量-反应关系。研究表明:克隆获得的海水青鳉3个雌激素受体亚型基因OM-ERα/β1/β2,为后续开展海水模式鱼类雌激素受体相关研究提供了基础信息;OM-ERα/β1/β2的组织表达特性及EE2对仔鱼OM-ERα/β1/β2表达的不同调控,显示出海水青鳉3种ER亚型基因存在着不同的生理功能,且其对环境污染物的应答模式不同。     

钒对日本青鳉胚胎发育及仔鱼的毒性影响

为揭示钒对日本青鳉的生态毒理学效应,以日本青鳉受精卵和仔鱼为研究对象,进行了钒对日本青鳉胚胎的毒性和仔鱼的急性毒性试验。结果表明:随着钒浓度的升高,胚胎孵化率呈先升高后降低的趋势,当钒浓度大于10.13mg/L时,日本青鳉胚胎孵化率降低,胚胎畸形率增加;各钒暴露液均对日本青鳉胚胎孵化周期有较明显的迟滞效应。钒对日本青鳉仔鱼的72h、96h半致死浓度分别为0.85mg/L、0.43mg/L,安全浓度为0.0427mg/L。结论:钒对日本青鳉胚胎有一定的致畸和致死作用,对仔鱼有高毒性作用。     

青鳉tsn的克隆与表达分析

有性繁殖的性别决定机制虽具有多样性,但其生殖细胞都经过几轮有丝分裂和增殖后进入减数分裂,最终产生雌性或雄性配子。尽管有丝分裂过程中的生殖细胞在形态上没有雌雄差异,然而,未分化的生殖细胞在有丝分裂过程中如何获得雌雄性别特征尚不清楚。青鳉(Oryzias latipes)正常XX卵巢、正常XY精巢以及性腺体细胞衍生因子(gonadal soma-derived factor,gsdf)缺失型(gsdf^-/-)卵巢的蛋白质组学质谱比对分析结果显示,gsdf^-/-XY卵巢中Tsn(Translin)蛋白产物显著高于gsdf^-/-XX卵巢,提示Tsn蛋白表达可能受dmy(DM-domain on Y chromosome,又名dmrt1bY)及下游Gsdf雄性信号调控。从青鳉性腺组织的cDNA中克隆了tsn基因的ORF(Open Reading Frame)片段。氨基酸序列的同源性比对分析及系统发育树评估显示,Tsn在脊椎动物物种间具有进化保守性,青鳉和斑马鱼(Danio rerio)的Tsn氨基酸序列高度同源。反转录PCR和实时荧光定量PCR检测结果显示,tsn的mRNA在野生型青鳉多个组织中广泛表达,其中在精巢中的表达量显著高于卵巢。免疫荧光检测发现,gsdf^-/-XY卵巢中抗青鳉Tsn抗体阳性反应的囊性生殖细胞异常增多,同蛋白组学分析得到的gsdf^-/-XY卵巢中Tsn蛋白表达量高于gsdf^-/-XX卵巢的结果相一致。在青鳉性腺分化发育过程中,Gsdf信号可能抑制Tsn阳性的雄性囊性生殖细胞增殖,当该信号被破坏后,这种抑制作用消失,导致Tsn阳性生殖细胞在gsdf^-/-XY卵巢中大量积累。青鳉Tsn阳性生殖细胞的囊性增殖,是青鳉有丝分裂期生殖细胞雄性分化的特征之一,为脊椎动物有丝分裂期生殖细胞的雌雄性别鉴定提供了线索。     

somatostatin1基因突变斑马鱼仔鱼转录组分析

生长抑素（Somatostatin,SST）是一类神经激素多肽,对脊椎动物的生长和代谢起着关键的调控作用。在斑马鱼（Danio rerio）和其它鱼类中,生长抑素由6个基因编码（sst1-sst6）,sst1存在于所有脊椎动物中,并且在进化上最为保守。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在斑马鱼中构建了可稳定遗传的生长抑素基因sst1突变体鱼系。通过比较6 dpf（days post fertilization,dpf）的sst1-/-突变体和野生型仔鱼转录组,发现sst1-/-突变体相关生化过程和信号通路发生了显著变化。相比野生型,sst1-/-突变体仔鱼中有354个基因显著上调,504个基因显著下调。GO（Gene ontology）富集分析表明,大部分差异基因与氨基酸和蛋白质生物合成相关。KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路富集显示代谢通路、氨基酸合成、氨基酰基- tRNA合成、核糖体合成和rRNA加工相关通路表达增强。结果表明,sst1-/-突变体蛋白质生物合成和代谢过程更加活跃。RT-qPCR验证结果显示,随机选取的10个基因mRNA表达变化趋势与转录组测序结果一致,说明转录组测序结果真实可靠。6月龄突变体体重体长和野生型相比并无显著差异。本研究结果为进一步挖掘生长抑素基因家族的潜在功能奠定基础。     

DNA去甲基化酶对拟南芥Laccase家族基因甲基化及转录模式的影响

植物Laccase家族蛋白,是铜蓝氧化酶超家族的重要成员,具有包括抗病性在内的多种生物学功能。利用拟南芥野生型及ros1、rdd和dme突变体的全基因组甲基化测序(BS-SEQ)数据,分析了拟南芥Laccase蛋白家族基因(AtLACs)的DNA甲基化模式。结果表明:在野生型和不同DNA去甲基化酶突变体中,该家族少数成员在基因上游区和转录区存在较高水平的甲基化修饰现象。转录组测序(RNA-SEQ)数据分析结果显示,在野生型和不同突变体中,AtLAC家族基因的转录水平普遍较低。而AT5G48100基因在拟南芥胚乳细胞中剧烈表达,DME突变后,其表达水平进一步剧烈增强。综合而言,在野生型和不同DNA去甲基化酶突变体中,AtLAC基因家族大部分成员的DNA甲基化修饰与转录调控关联不强,但有些基因的DNA甲基化程度与转录水平之间有密切联系。     

3种杀菌剂对日本青鳉的急性毒性研究

[目的]探讨多菌灵及三唑类杀菌剂对水生生物的毒性.[方法]以不同鱼龄的日本青鳉(Oryzias latipes)为研究对象,采用半静态暴露法,测定了多菌灵、三唑醇、三唑酮3种杀菌剂对日本青鳉的急性毒性.[结果]多茵灵、三唑醇、三唑酮3种杀菌剂对日本青鳉成鱼、幼鱼、仔鱼的LC50(96 h)值分别为:0.749 8、0.4646、0.0512 mg/L;20.5415、14.4866、1.4735 mg/L;12.4707、11.0202、0.3536mg/L.单一杀菌剂对日本青鳉不同鱼龄毒性高低依次为:仔鱼＞幼鱼＞成鱼;3种杀菌剂之间毒性高低依次为:多菌灵＞三唑酮＞三唑醇.[结论]为相关部门制定3种杀菌剂的使用标准提供了理论依据.     

牛心甘蓝蜡粉缺失突变体410M特征的研究

[目的]本文旨在探索牛心甘蓝蜡粉缺失突变体410M的特征和实际应用价值,以丰富甘蓝种质资源,加速新品种创制和改良。[方法]调查牛心甘蓝野生型材料410W和蜡粉缺失突变体410M的农艺性状,测定其营养品质;扫描电镜观察其叶表超微结构;以蜡粉缺失突变体材料410M(P1)与其野生型410W(P2)为亲本分别配制6世代群体,分析410M蜡粉缺失性状的遗传规律;筛选出14个在拟南芥中参与蜡粉合成、转运的基因,并利用实时荧光定量PCR对其在410W和410M中的表达模式进行分析。[结果]蜡粉缺失甘蓝叶色亮绿,突变体410M球叶和外叶的维生素C含量显著高于野生型;其他表型及主要营养成分与野生型无明显差异。叶表超微结构观察显示,突变体叶表面光滑,蜡粉严重缺失;野生型叶表蜡粉分布致密,晶体结构主要为片状和线状。对6世代群体分离比例进行χ~2检测,结果表明410M蜡粉缺失性状为隐性单基因遗传。在参与拟南芥蜡粉生物合成、转运的14个基因中,共有7个基因在野生型中的表达显著高于突变体。[结论]蜡粉缺失突变体410M遗传稳定,商品性好,为育种和蜡粉分子基础研究的优良材料。     

牙鲆纤维蛋白原相关蛋白(FREP1)基因的克隆和表达分析

利用RACE-PCR技术获得了牙鲆FREP1(fibrinogen-related protein)基因1 131 bp cDNA全长序列,其中开放阅读框786 bp,所编码的蛋白C端含有纤维蛋白样结构域标签(WWYSRCGSAGLNG).RNA整体原位杂交检测发现只在孵化后2d和5 d(2 dph、5 dph)仔鱼的肠道中有FREP1基因表达,而在9 dph和13 dph仔鱼胸鳍、肠道、鳃和皮肤中均有表达.荧光定量PCR检测显示该基因主要在成鱼的肠、鳃、皮肤和鳍条上表达,而脾脏、心脏、肾脏、肝脏和肌肉表达量很低或没有表达.鳍条和皮肤较其他组织均有极显著差异(P＜0.01),鳃和肠相比其他组织具有显著差异(P＜0.05).由于该基因主要在鳍条、皮肤、肠和鳃中表达,提示FREP1基因可能和牙鲆先天性免疫相关.研究亮点:FREP在鱼类免疫方面的报道很少,本研究所克隆的牙鲆FREP1,不管是牙鲆仔鱼还是成鱼,其仅在与外界直接接触的皮肤、鳃、肠道等组织中表达,提示其与牙鲆的先天免疫相关.     

甘蓝黑腐病菌XC3374基因功能的初步探究

【目的】初步探究XC₃374基因在甘蓝黑腐病菌Xcc8004中的功能,为深入研究甘蓝黑腐病菌Xcc8004中L-天冬酰胺酶的功能奠定基础。【方法】从KEGG数据库内获取XC₃374基因的旁侧序列,通过常规PCR对其进行克隆,同时利用自杀质粒pK18mobSacB通过同源双交换的方法构建了其缺失突变体DM3374并检测其表型。【结果】以引物D3374L-F/D3374R-R扩增,野生型菌株能够扩增出1789bp的DNA片段,而候选突变体菌株能扩增出1367bp的片段;以内部引物3374F/3374R扩增,野生型菌株能扩增出332bp的片段,而候选突变体菌株不能扩增出任何片段,表明目标基因已缺失,缺失突变体DM3374构建成功。平板检测法结果表明,XC₃374基因突变后不影响胞外多糖及胞外酶的合成与分泌。在MMX基本培养基上,突变体菌株能够正常生长,形成的菌落大小与野生型菌株基本相同,表明缺失突变体不是营养缺陷性。游动平板检测结果表明,XC₃374缺失突变体的运动能力比野生型稍强,但差别不明显。采用剪叶法检测缺失突变体的致病性,结果表明,野生型Xcc8004和缺失突变体DM3374病斑平均长度分别为13.000和11.983mm,两者致病性无显著差异。【结论】XC₃374基因突变体在胞外多糖、几种胞外酶的合成与分泌、致病性等各种表型与野生型基本一致。     

苹果光响应转录因子MdHY5表达及蛋白互作分析

【目的】克隆苹果光响应过程中关键的bZIP（basic-leucine zipper）转录因子MdHY5,并进行表达分析及蛋白互作检测,为阐述苹果中MdHY5在光信号过程中的功能及作用机制奠定基础。【方法】对苹果中具有bZIP保守结构的基因设计半定量引物进行表达分析,筛选具有光响应的bZIP转录因子。对光响应的bZIP家族基因进行BLAST比对,根据同源比对分析将目的蛋白命名为MdHY5,同时对cDNA序列设计引物进行克隆;利用MEGA5软件将MdHY5蛋白与拟南芥基因组中所有的bZIP转录因子家族成员进行聚类分析,同时对蛋白进行保守结构域分析;取苹果各组织材料进行MdHY5时空表达分析;通过对MdHY5启动子序列进行预测分析,并结合拟南芥同源基因芯片数据,进一步利用RT-PCR与半定量PCR检测MdHY5对不同光质的表达响应。将MdHY5连接到原核表达载体PGEX-4T-1上,利用IPTG对转化的大肠杆菌BL21融合蛋白进行诱导表达、蛋白杂交检测,并进行蛋白纯化;利用pull down试验验证MdHY5与MdCOP1蛋白的互作。【结果】通过光响应分析,在苹果中筛选到一个bZip转录因子家族成员,聚类分析显示MdHY5基因与拟南芥AtHY5同源性最高,该基因位于苹果基因组12号染色体上,基因编号为MDP0000586302,与拟南芥AtHY5结构相似,MdHY5也含有4个外显子,3个内含子。该基因cDNA序列长度为1 112 bp,其中5′非编码区长度为214 bp,3′非编码区长度为403 bp,开放阅读框长度为495 bp,编码一个含有164个氨基酸残基的蛋白。蛋白保守域分析显示,MdHY5蛋白C端含有一个典型的亮氨酸拉链结构（bZIP domain）,其中在bZIP结构域的N端含有一个核定位信号区域（NLS domain）。时空表达分析显示MdHY5在各组织中均表达,其中叶片中表达水平最高,花和种子中表达水平较低。利用PLACE对启动子进行了顺式作用元件分析发现,MdHY5启动子上含有G-box、GT-1-box、I-box等多个光响应的作用元件,而定量表达分析显示MdHY5能够被白光、蓝光、紫外光诱导,而红光对MdHY5表达没有明显影响。将构建好的融合蛋白表达载体转化BL21并进行蛋白诱导,菌体经超声波破碎后显示,融合蛋白主要在上清中存在。将诱导的MdHY5-GST蛋白分别与MdCOP1-HIS及pET-HIS蛋白孵育进行pull down试验,结果显示,MdHY5在体外能够与MdCOP1蛋白互作。【结论】MdHY5为光诱导的bZIP转录因子,是拟南芥光形态建成关键转录因子AtHY5的同源基因,与AtHY5具有类似的基因与蛋白结构,在叶中表达量最高,同时对多种光质具有表达响应,能够与MdCOP1互作。     

Parallel association of Fos and Jun leucine zippers juxtaposes DNA binding domains

The protein products of the fos and jun proto-oncogenes form a heterodimeric complex that participates in a stable high affinity interaction with DNA elements containing AP-1 binding sites. The effects of deletions and point mutations in Fos and Jun on protein complex formation and DNA binding have been examined. The data suggest that Fos and Jun dimerize via a parallel interaction of helical domains containing a heptad repeat of leucine residues (the leucine zipper). Dimerization is required for DNA binding and results in the appropriate juxtaposition of basic amino acid regions from Fos and Jun, both of which are required for association with DNA.     

红笛鲷LITAF基因的克隆与表达分析

通过同源克隆和RACE PCR技术从红笛鲷脾脏中鉴定得到了脂多糖诱导的肿瘤坏死因子(LITAF)基因,命名为Ls-LITAF。该基因c DNA全长815 bp,开放阅读框为447 bp,编码148个氨基酸,理论分子量为15.7 ku。序列分析显示Ls-LITAF蛋白具有保守的LITAF结构域,其中包含一个CXXC基序与一个(H)x Cxx C基序。Ls-LITAF蛋白与其他鱼类LITAF蛋白相似度较高,在系统进化树中也与其他鱼类该蛋白聚为一支。Ls-LITAF基因在健康鱼体多种组织均有表达,其中鳃、脾脏、皮肤与头肾的表达量较高;且哈氏弧菌刺激鱼体后,Ls-LITAF在脾脏和头肾中的表达量显著上调。以上研究结果为进一步了解Ls-LITAF在红笛鲷免疫反应中的作用提供了参考。     

神经坏死病毒对卵形鲳鲹的致病性及外壳蛋白基因序列分析

2008年5月,湛江市某网箱养殖场的卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)幼鱼发生大规模死亡,调查发现病鱼呈现体色发黑、反应迟钝、呈螺旋状或旋转游动等典型的病毒性神经坏死症症状,在鱼体没有发现寄生虫或细菌感染,PCR检测发现病鱼感染了鱼类神经坏死病毒(NNV)。利用已经发表的NNV核酸序列设计引物,克隆外壳蛋白基因并测序,根据同源性比较和系统进化分析,该病毒与斜带石斑神经坏死病毒(ECNNV)碱基相似率达99.2%,属于赤点石斑鱼神经坏死病毒基因型(RGNNV)。同时进行人工感染试验,采用4种方法感染该病毒,累计死亡率均达100%,并对感染样品进行克隆测序鉴定,证明导致此次湛江卵形鲳鲹大规模死亡的病原为神经坏死病毒。     

红鳍东方鲀gsdf基因的克隆及表达模式分析

为研究红鳍东方鲀Takifugu rubripes的性别决定因子(gonadal soma derived factor,GSDF),利用c DNA末端快速扩增技术(RACE)首次克隆了红鳍东方鲀gsdf基因(Trgsdf)的c DNA全长序列(Gen Bank登陆号:KR914667)。结果表明:Trgsdf c DNA序列全长为1734 bp,其中5'端非编码区144 bp,开放阅读框648 bp,3'端非编码区942 bp,共编码215个氨基酸;预测的氨基酸序列中存在1个长度为19个氨基酸的信号肽和相同长度的跨膜区,1个N-糖基化位点NST,1个TGF-β家族成员特有的保守结构域;BLAST同源性分析结果显示,红鳍东方鲀GSDF氨基酸序列与其他鱼类的相似性为26%~58%;系统发育分析结果显示,鱼类GSDF单独聚为一支,与TGF-β超家族内的其他成员分开,红鳍东方鲀与青鳉Oryzias latipes GSDF的亲缘关系最近,先聚为一支,后与三斑海猪鱼Halichoeres trimaculatus聚在一起,与矛尾鱼Latimeria menadoensis的GSDF亲缘关系最远;应用RT-PCR技术检测Trgsdf mRNA在雌性和雄性红鳍东方鲀成鱼不同组织中的表达,结果显示,Trgsdf mRNA在卵巢和精巢中高表达,在皮肤和肌肉组织中微量表达,在其他组织中无表达;采用相对实时荧光定量PCR方法比较了成鱼卵巢和精巢中Trgsdf mRNA的表达量,结果显示,Trgsdf mRNA在精巢中的表达量显著高于卵巢(P0.05),约为卵巢表达量的6倍。研究表明,gsdf基因可能在红鳍东方鲀的性腺尤其是精巢的分化和发育过程中起着重要的作用。     

烟草NbbZIP28突变体的创建及其对病毒侵染胁迫的响应

【目的】bZIP类转录因子参与植物的生长发育、激素信号、抗病性及抗逆性等多种生物胁迫过程。前期研究表明黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)或烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)侵染本氏烟(Nicotiana benthamiana)上调内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERs）因子NbbZIP28;NbbZIP28沉默导致病毒积累量上升,本研究旨在验证NbbZIP28对病毒侵染胁迫的响应机制。【方法】通过CRISPR/Cas9基因编辑技术和烟草遗传转染创建NbbZIP28基因突变植株,以野生型植株为对照,分别浸润接种侵染性克隆TMV-GFP、摩擦接种TMV-GFP或CMV接种液,检测突变体植株对病毒侵染胁迫的敏感性变化,接种CMV后0-48 h,采用qRT-PCR检测内质网应激相关的未折叠蛋白反应（unfolded protein response,UPR)基因的表达。本氏烟接种TMV 24 h、接种CMV 48 h后,在接种叶上浸润融合蛋白NbbZIP28-GFP,瞬时表达48 h后,采用Western blot检测病毒诱导NbbZIP28蛋白的水解激活;采用在线搜索工具PlantCARE分析NbbZIP28启动子区域中参与防卫和应激反应的顺式作用元件。【结果】CRISPR/Cas9定点敲除NbbZIP28后,目的基因靶位点缺失了10个碱基,导致翻译错误、蛋白功能变化。在正常生长条件下,转基因阳性植株与野生型无显著的表型差异。植株接种TMV-GFP后4-8 d,突变体中的病毒浸润斑亮度或初侵染点数目均显著高于野生型,扩展至新叶的速度较快。接种CMV后12-48 h,突变体中UPR相关基因BiP、PDI、CAM及NbbZIP28下游基因NF-YC2的表达量显著低于野生型;5-7 d突变体中的病毒外壳蛋白（coat protein,CP）基因表达量显著高于野生型,花叶及皱缩症状更显著。蛋白质序列比对分析显示NbbZIP28具有与拟南芥AtbZIP28相同的S1P和S2P蛋白酶水解位点。Western blot检测发现,与接种清水对照相比,TMV或CMV侵染显著促进了全长的融合蛋白NbbZIP28-GFP在S1P和S2P位点发生裂解。NbbZIP28启动子序列中包含5个参与热应激反应的顺式作用元件（heat stress response element,HSE）、3个参与低温反应的顺式作用元件（low temperature response element,LTR）、1个参与防卫和应激反应的顺式作用元件（TC-rich repeats）。【结论】病毒侵染促进NbbZIP28的水解激活并上调相关的UPR基因;NbbZIP28敲除导致植株对病毒的敏感性上升,病毒诱导的UPR基因表达被抑制。NbbZIP28为病毒侵染胁迫下的UPR调控因子,在病毒侵染早期通过上调UPR信号和提高寄主基础防卫反应而延缓病毒的侵染和增殖。     

七彩神仙鱼Vasa基因cDNA的克隆及表达分析

源自DEAD-box家族的Vasa基因是生殖细胞的分子标记之一.本研究克隆了七彩神仙鱼(Symphysodon haraldi)Vasa基因的全长序列,并进行了不同组织的表达分析.结果表明:七彩神仙鱼Vasa基因cDNA序列共2 370 bp,其中5'UTR占123 bp,3'UTR为279 bp,ORF编码655个氨基酸,长1 968 bp.氨基酸序列同源性分析表明七彩神仙鱼的Vasa基因与尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)的同源性最高.半定量分析表明,Vasa基因在成熟七彩神仙鱼的性腺中特异表达,在其它组织中无表达信号.qRT-PCR结果显示,Vasa在七彩神仙鱼早期胚胎发育阶段及出膜后50日内均有表达.在受精卵至囊胚期阶段,Vasa基因表达持续增加,在囊胚期至孵化期阶段,表达持续降低.在仔鱼阶段,Vasa分别在25日龄和40日龄出现了最低和最高表达量.繁殖前后比较发现,繁殖前的精巢组织中Vasa表达量比繁殖后的表达量低,而卵巢恰好相反.本研究结果可为研究七彩神仙鱼的性分化、生殖细胞分子标记及其发育提供参考.     

太平洋鳕神经坏死病毒衣壳蛋白(CP)的原核表达及条件优化

为深入研究太平洋鳕Gadus macrocephalus神经坏死病毒(Pacific cod nervous necrosis virus,PCNNV)衣壳蛋白(capsid protein,CP)的功能,将PCNNV cp基因连接到p ET-32a原核表达载体中,构建原核表达重组载体p EVCP,将其转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)表达系统中进行融合表达,对诱导剂IPTG浓度、诱导时间和温度等诱导表达条件进行优化,采用SDS-PAGE及质谱技术鉴定表达产物。结果表明:本研究中成功构建了重组载体p EVCP,表达的目的蛋白相对分子质量约为55 000;目的蛋白经质谱鉴定,有6个肽段的氨基酸序列与预期一致;对重组菌株p EVCP/BL21的最佳诱导条件为IPTG浓度0.1 mmol/L、最佳诱导时间3 h、温度30℃。本研究结果可为后续冷水鱼类病毒疫苗的研制及病毒快速检测试剂盒的研发奠定基础。