草鱼呼肠孤病毒诱导ＦＨＭ细胞发生凋亡的研究

为探究草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)能否引起细胞凋亡,采用GCRV分别感染草鱼肾细胞(Ctenopharyngodon idellus kidney cell,CIK)和胖头鲤细胞(Fathead minnow cell,FHM),在不同时间观察细胞病变效应.结果表明,GCRV能感染这2种细胞并引起细胞病变,且CIK细胞对GCRV更为敏感;GCRV感染可以导致CIK细胞的快速融合并裂解,而FHM细胞感染后则很少有细胞融合;利用DAPI、Annexin V-FITC染色和末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP原位切口末端标记[terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT) dUTP nick end labeling,TUNEL]技术进一步证实GCRV能够诱导FHM细胞发生凋亡,但不诱导CIK细胞发生凋亡.本研究发现GCRV可以诱导FHM细胞发生凋亡,并推测GCRV在感染不同类型的细胞时,可以通过不同机制促使细胞死亡,从而为进一步研究GCRV的致病机制提供线索.     

草鱼miR-23a在嗜水气单胞菌感染过程中的调控机制

为探索嗜水气单胞菌感染后草鱼肾脏细胞(Ctenopharyngodon idella kidney,CIK)中miR-23a的调控机制,实验通过实时荧光定量PCR(qPCR)测定了嗜水气单胞菌感染CIK细胞后miR-23a的表达量变化,使用RNAhybrid软件预测miR-23a的靶基因并用双萤光素酶报告基因检测系统进...     

草鱼核因子E2相关因子2基因克隆分析及其对呼吸爆发的调控作用

呼吸爆发过程可以产生大量的活性氧,核因子E2相关因子2(Nrf2)在此过程中起着重要作用。本文克隆和分析了草鱼的Nrf2基因,随后制备了Nrf2蛋白的多克隆抗体,研究了其和呼吸爆发的关系。草鱼Nrf2基因cDNA长度为1994 bp,开放阅读框为1782 bp,编码593个氨基酸(aa)。氨基酸序列比对发现,草鱼Nrf2基因与鲤鱼的同源性最高,为87%;草鱼Nrf2基因含有6个进化过程中保守的Neh(Nrf2-Epoxy chloropropane(ECH)homology)区。实时定量PCR(qRT-PCR)和蛋白印迹法(WB)检测结果表明,Nrf2基因在检测的草鱼8个组织中均有表达。Nrf2激活剂叔丁基对苯二酚(t BHQ)处理草鱼肾细胞(CIK)后,CIK细胞总抗氧化力显著上调,产生的活性氧下调,Nrf2及其下游的HO-1和GST基因的mRNA表达上调。WB和免疫荧光(IF)检测结果表明,tBHQ处理CIK后,Nrf2的蛋白表达也上调,并伴随着入细胞核现象。综上结果表明,保守的草鱼Nrf2基因在机体中广泛表达,能通过上调自身及其下游抗氧化基因的表达下调细胞活性氧的产生,从而参与调控呼吸爆发过程。     

草鱼核因子E2相关因子2基因克隆分析及其对呼吸爆发的调控作用

呼吸爆发过程可以产生大量的活性氧,核因子E2相关因子2(Nrf2)在此过程中起着重要作用。实验克隆和分析了草鱼的Nrf2基因,随后制备了Nrf2蛋白的多克隆抗体,研究了其和呼吸爆发的关系。草鱼Nrf2基因cDNA长度为1994 bp,开放阅读框为1782 bp,编码593个氨基酸(aa)。氨基酸序列比对发现,草鱼Nrf2基因与鲤的同源性最高,为87%;草鱼Nrf2基因含有6个进化过程中保守的Neh[Nrf2-Epoxy chloropropane(ECH)homology]区。实时定量PCR(q RT-PCR)和蛋白印迹法(Western blot)检测结果表明,Nrf2基因在检测的草鱼8个组织中均有表达。Nrf2激活剂叔丁基对苯二酚(t BHQ)处理草鱼肾细胞(CIK)后,CIK细胞总抗氧化能力显著上调,产生的活性氧下调,Nrf2及其下游的HO-1和GST基因的m RNA表达上调。Western blot和免疫荧光(IF)检测结果表明,t BHQ处理CIK后,Nrf2的蛋白表达也上调,并伴随着入细胞核现象。研究表明,保守的草鱼Nrf2基因在机体中广泛表达,能通过上调自身及其下游抗氧化基因的表达下调细胞活性氧的产生,从而参与调控呼吸爆发过程。     

白藜芦醇对脂多糖诱导草鱼肾脏细胞炎症的抑制作用

为评价白藜芦醇(resveratrol)对脂多糖诱导损伤草鱼(Ctenopharyngodon idella)肾脏细胞(CIK)的保护作用,本研究通过脂多糖(LPS)诱导细胞炎症损伤,测定和分析白藜芦醇对CIK细胞抗氧化因子活性和抗氧化、炎症相关基因表达变化的影响。结果表明,与对照组相比,LPS处理导致CIK细胞活力降低(P<0.05),乳酸脱氢酶(LDH)活性升高(P<0.05),降低了细胞内过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性,并导致还原型谷胱甘肽(GSH)浓度降低(P<0.05)和丙二醛(MDA)含量升高(P<0.05)。此外,LPS处理能引起CIK细胞的CAT、TNF-α、IFN-γ、IL-1基因表达显著上调(P<0.05),而对IL-10和SOD基因的转录表达无显著影响(P>0.05)。通过向培养基中添加白藜芦醇(4μg/mL)可以显著减弱LPS对CIK细胞造成的损伤,维系细胞抗氧化能力,抑制TNF-α等炎症相关基因的表达(P<0.05),促进CAT基因的表达(P<0.05)。研究认为白藜芦醇对LPS造成的CIK细胞损伤有明显的干预作用,主要原因可能是由于白藜芦醇对CIK细胞的抗氧化能力的改善以及对促炎因子表达的抑制。本研究可为白藜芦醇应用于鱼类炎症、氧化损伤相关疾病的防治提供理论依据。     

草鱼miR-462通过靶向cx32.2、slc9a3.1和tbk1调控嗜水气单胞菌感染诱导的免疫应答

为探究miR-462在嗜水气单胞菌感染草鱼肾脏细胞(Ctenopharyngodon idella kideny,CIK)后的调控机制,实验利用荧光定量技术检测了CIK细胞感染嗜水气单胞菌后miR-462表达水平的变化;运用RNAhybrid软件预测miR-462的靶基因,利用双荧光素酶报告基因系统进行确定;此外还分析了miR-462对靶基因下游基因的调控作用。结果显示,在CIK细胞感染嗜水气单胞菌的过程中,miR-462的表达发生显著变化;cx32.2、slc9a3.1和tbk1的表达先降低后升高,与miR-462的表达模式呈负相关。双荧光素酶报告系统显示,miR-462可靶向cx32.2、slc9a3.1和tbk1的3′非编码区抑制其表达,过表达miR-462可以显著抑制cx32.2、slc9a3.1和tbk1的表达。转染miR-462模拟物后,下游slc4a4a、tnfrsf5、cxcl9和cxcl11基因的表达受到抑制。研究表明,miR-462参与调控嗜水气单胞菌感染后草鱼CIK细胞中的免疫应答。cx32.2、slc9a3.1和tbk1被鉴定为miR-462的靶基因。miR-462可通过靶向slc9a3.1和tbk1影响下游基因的功能。     

微载体规模化培养草鱼细胞与病毒的工艺及优化

研究了在悬浮培养系统中使用微载体Cephodex规模化培养草鱼肾脏组织细胞CIK和草鱼呼肠孤病毒(GCRV)的条件并进行了优化。结果表明,Cephodex是一种适合CIK细胞贴壁生长的微载体,搅拌方式(搅拌时间/静止时间)及血清浓度(0%、5%、10%、15%)对CIK细胞在Cephodex微载体上的贴附效率有影响。贴附期以转速35 r/min、每静置45 min搅拌2 min的间歇搅拌方式最佳,8 h后细胞贴附率可达90%以上;细胞贴附期培养基中的血清浓度为5%。当Cephodex微载体用量10 mg/mL、细胞初始接种密度2.5×105cells/mL、连续搅拌速度40 r/min时可获得最佳的细胞生长效能。用优化的最佳工艺条件大规模培养CIK细胞,接种感染复数为0.1的GCRV病毒3 d后,培养细胞出现典型细胞病变效应,病毒滴度(lgTCID50/mL)为8.5。本项研究为草鱼出血病疫苗规模化制备技术研究奠定了基础。     

草鱼呼肠孤病毒湖州分离株的分离及鉴定

2008年6月从湖州某患病草鱼池塘采集草鱼出血病疑似病样,将除菌过滤后的患病鱼肝、脾、肾组织滤液,注射健康的8～10 cm的草鱼鱼种.5d后草鱼开始发病,且症状与原发病症状一样,死亡率为57%,对照组未有死亡.将无菌处理的病样滤液接种草鱼肾细胞(CIK),连续接5代均出现明显的细胞病变(CPE),并与草鱼呼肠孤病毒参考株所产生的CPE一致.该株病毒的TCID50为10-8/0.1ml.内脏组织经超薄切片,电子显微镜观察,发现组织内有大量的病毒颗粒,大小均一,近似球形,直径约70～75 nm.理化鉴定表明,氯仿、乙醚处理组病毒的感染力和对照组相比并没有多大变化,说明该株病毒对氯仿和乙醚有一定的抗性.经草鱼呼肠孤病毒特异性的RT-PCR检测,获得阳性的目的片段,测序的结果与草鱼呼肠孤病毒相应序列的同源性达99%以上.上述鉴定结果表明所分离的病毒为草鱼呼肠孤病毒,将其命名为HZ2008.     

草鱼肾组织细胞系CIK的建立及其生物学特性

作者于1982年1月开始进行草鱼肾组织单层细胞培养，至今已连续培养32个月，传至120多代，建立了细胞系，定名为草鱼肾组织细胞系(CIK)。本文介绍了原代和传代培养、细胞形态、细胞生长速度和分裂指数、细胞的保存和对温度的适应性、细胞染色体分析以及细胞系对病毒敏感性的试验和研究结果。CIK生长迅速、适应性强、以20℃-38℃生长较好，28℃左右生长稳定，pH为6．5时仍能保持致密单层，染色体数为非整倍体，众数为55。对草鱼出血病左右病毒FRV具敏感性。     

稳定表达草鱼LamR鱼类细胞的建立及对基因Ⅱ型GCRV增殖的影响

通过构建草鱼LamR(Ctenopharyngodon idella LamR,CiLamR)真核表达质粒,转染GCRV非敏感细胞系鲤鱼上皮细胞(EPC)和敏感细胞系草鱼肾细胞(CIK),利用G418筛选获得稳定表达CiLamR的细胞,经Western Blot验证CiLamR稳定表达细胞系的构建.采用Ⅱ型GCRV分别...     

使用廉价培养基培养草鱼CIK细胞系

使用一种廉价的培养基 CAS 替代昂贵的 Eagle′S MEM 培养草鱼 CIK 细胞系,细胞生长迅速而稳定,在1.5—2天内可长成汇合单层。CAS 的最佳培养浓度为0.1%。     

草鱼出血病细胞培养灭活疫苗的研究——细胞和病毒的扩大培养

旋转培养优于静置培养,它不仅表现在可形成细胞单层的面积大,单层细胞的产量高,单位面积所需的培养液(维持液)少,而且细胞生长的速度较快,细胞形成单层的时间较短,接种病毒后收获的病毒滴度也相应较高,它适宜于疫苗工厂化生产。     

草鱼出血病病毒854株在CIK细胞系上的繁殖动态研究

采用微量细胞培养系统测定草鱼出血病病毒854株在草鱼肾脏组织细胞系(CIK)上的繁殖动态。病毒在感染后12小时滴度开始上升,24～72小时呈对数上升,84小时病毒滴度达到最高点,以后渐趋平稳。     

(‐)‐Epicatechin gallate,a metabolite of (‐)‐epigallocatechin gallate in grass carp,exhibits antiviral activity in vitro against grass carp reovirus

(‐)‐Epigallocatechin gallate (EGCG), a catechin found in green tea, has been demonstrated to exhibit activity against grass carp reovirus (GCRV). In the current study, we found that EGCG is partially transformed in vivo into (‐)‐epicatechin gallate (ECG), which differs from EGCG only by the absence of a hydroxyl group, and exhibits similar pharmacokinetic behaviour to that of EGCG. ECG is also a major catechin in green tea, but little information on its antiviral activity is available. Therefore, we assessed whether ECG affects GCRV in vitro. We incubated grass carp (Ctenopharyngodon idellus) kidney (CIK) cells with ECG and GCRV‐JX01 at different concentrations, and typical cytopathogenic effect (CPE) values were observed for 5 and 10 µg/ml ECG. However, the CPE in 20 µg/ml ECG treatment group was low; no significant CPE was observed for 40 µg/ml ECG treatment; and a high ECG concentration (80 µg/ml) led to stress response in the CIK cells. Western blot results also revealed that ECG suppresses GCRV replication in CIK cells. Thus, the data indicate that ECG, as well as EGCG, exhibits potential as an antiviral agent for aquaculture.     

中国对虾上皮样细胞培养研究

１９８９年８月起进行了中国对虾上皮细胞的原代和传代细胞培养。对取自甲壳，步足等部位的对虾上皮组织培养研究，共培养６批，获得传代细胞１１株，其中１株传至２５代，传代细胞形态为梭形和下沉上皮细胞形态相似。生长率测定结果，第４天细胞增殖达高峰，倍增时间为４８．７２ｈ。     

草鱼干扰素3蛋白多克隆抗体制备及其应用

为探讨干扰素3(Interferon 3,IFN3)在抗病毒免疫应答中的作用,以草鱼(Ctenopharyngodon idella)巨噬细胞cDNA为模板,PCR扩增IFN3成熟肽基因序列,制备草鱼IFN3蛋白的多克隆抗体,同时研究了IFN3在草鱼不同免疫组织中的蛋白表达,以及草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)感染草鱼肾细胞系(Ctenopharyngodon idella kidney,CIK)后不同时间点的表达。结果显示,细菌表达的重组IFN3大小约为45 kD,主要以包涵体形式存在;抗体效价约为1∶3 200,制备的多克隆抗体既能识别原核表达的重组蛋白,也能识别个体水平上和细胞水平上的内源蛋白。草鱼主要免疫组织中,肝胰腺和皮肤检测到相应条带。CIK细胞感染病毒后12 h开始检测到IFN3蛋白,随感染时间的延长,IFN3蛋白表达量有所增加。蛋白水平上检测IFN3的表达,为深入研究草鱼的抗病毒免疫机制奠定了基础。     

鲤病毒病原的感染性测定

为查明养殖鲤（Cyprinus carpio）突然大批发病死亡的原因，对鲤病样品进行了细胞攻毒、空斑测定、电镜观察，以及鱼体感染等实验。先以患病鲤的组织匀浆液，经过滤后，分别接种到草鱼鳍条细胞（GCF）、鲤上皮瘤细胞（EPC）等14种培养细胞中。利用倒置显微镜观察显示，在1-2d内，该病鱼组织匀浆液可使其中9种细胞出现典型的细胞病变。收集出现病变的细胞液（即病毒悬液），进一步进行病毒滴度检测、空斑测定和鱼体感染实验。结果显示，在GCF细胞上的病毒滴度为10^7.3TCID50／mL；在FHM，TSB和GCO等细胞中可产生直径1～4mm的圆形空斑，空斑的大小与宿主细胞的种类和接种的病毒浓度有关。通过对感染细胞制备的超薄切片和病毒负染样品进行电镜观察，显示这是一类呈典型子弹头样的弹状病毒颗粒。感染了病毒悬液的鲫和鲤先后在第2天和第3天开始出现病症，间隔1～2d后发病的鱼开始死亡，至第14天，两种感染鱼的死亡率均达到83．3％。收集人工感染后濒死的鲫和鲤，分别制备组织匀浆液，回接感染鱼类培养细胞，24h内能使其出现与原发病鲤组织匀浆液所引起的类似的细胞病变。因此证实患病鲤是由病毒病原感染所致。[中国水产科学，2006，13（4）：617—623]     

草鱼mst2在免疫应答中的作用机制

为了初步阐明草鱼哺乳动物STE20样蛋白激酶2基因(mammalian sterile 20-like kinase 2, mst2)在机体免疫中的作用机制,实验采用RNA-Seq技术对干扰mst2后经脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)应激的草鱼肾细胞系(Ctenopharyngodon idella kidney cell lines,CIK)进行了转录组测序与验证分析。测序原始数据经De novo拼接与组装后共获得22 374个独立功能基因(unigenes),其中已知功能基因为21 199个,预测的新基因为1 175个。干扰mst2后经LPS应激的unigenes表达差异分析表明,对照组与实验组之间共存在38个差异基因(differentially expressed genes,DEGs),其中上调基因16个,下调基因22个。利用实时荧光定量PCR技术(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)对38个DEGs的RNASeq结果进行验证,结果显示,qRT-PCR和RNA-Seq分析一致,说明RNA-Seq分析结果可靠。采用RNA干扰技术干扰mst2后经LPS处理,CIK细胞转录组中DEGs参与免疫代谢的途径主要有MAPK信号通路、内吞作用途径、自噬途径和细胞因子受体相互作用途径。凋亡相关基因检测结果显示,干扰mst2并经LPS处理后,促凋亡基因(fas、bad1、bad2、caspase-3、caspase-8和caspase-9)转录水平上调,抗凋亡基因(bcl2)转录水平下调,证明干扰mst2后经LPS处理会诱发细胞发生凋亡。综上所述,mst2可通过调控凋亡相关过程参与机体免疫反应。本研究结果初步阐明了草鱼mst2参与机体免疫应答的分子机理,可为草鱼细菌性疾病防控提供一定的基础理论参考。