巴西橡胶树胶乳转化酶HbNIN基因家族物理定位的研究

胶乳转化酶(Invertase,Inv)是控制橡胶树胶乳蔗糖代谢和影响胶乳(橡胶)产量的关键酶。已有研究证实了胶乳转化酶属于中性/碱性转化酶。本研究以热研7-33-97(2n=36)为材料制备叶片细胞染色体标本,采用荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization,FISH)对胶乳转化酶基因HbNIN1、HbNIN2和HbNIN3进行了染色体物理定位的初步研究。结合核型分析,初步确定HbNIN1基因位于5号染色体的长臂上,其信号位点到着丝粒的百分距离为33.1;HbNIN2基因位于2号染色体的长臂上,其信号位点到着丝粒的百分距离为35.7;HbNIN3基因位于3号染色体的短臂上,其信号位点到着丝粒的百分距离为40.42。由此揭示了该基因家族在染色体上的位置和分布特点。     

橡胶树蛋白激酶HbBIN2基因的克隆、蛋白表达纯化及酶活分析

橡胶树是天然橡胶的唯一材料来源。寒害是橡胶树面临的主要自然灾害之一,严重限制了橡胶树的生长发育和种植区域分布,克隆和鉴定橡胶树低温应答基因尤为重要。蛋白激酶BIN2（brassinosteroid insensitive 2）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在调控植物应对低温胁迫中发挥重要作用,但橡胶树蛋白激酶HbBIN2还未被克隆与鉴定。本研究从橡胶树cDNA中成功克隆出HbBIN2,序列分析表明：HbBIN2的开放阅读框为1143 bp,编码380个氨基酸,蛋白的分子量为42.9 kDa,理论等电点为8.74,是亲水性蛋白且无跨膜结构域。将HbBIN2构建到原核表达载体pET28a上,转化大肠杆菌BL21（DE3）表达菌株,摸索合适的诱导条件后成功诱导表达出HbBIN2蛋白。比较HbBIN2在不同的诱导温度（16、28、37℃）、诱导时间（3、6、12 h）和IPTG浓度（0.1、0.3、0.5 mmol/L）下的表达量,结果表明,HbBIN2在37℃,0.3 mmol/L IPTG诱导12 h的表达量最大。对HbBIN2蛋白体外纯化条件进行探索,结果表明,100 mmol/L咪唑能将目的蛋白完全洗脱。纯化HbBIN2蛋白并进行激酶活性鉴定,结果表明,该蛋白具有激酶活性。该研究为后续HbBIN2蛋白功能分析和橡胶树应对低温胁迫的调控机制研究提供参考,为橡胶树耐寒品种分子育种提供重要的基因资源。     

橡胶树中碱性转化酶基因 HbNIN8 的克隆与表达分析

蔗糖是高等植物光合产物的重要存储方式，而转化酶和蔗糖合酶是水解蔗糖的主要酶。研究基于橡胶树的基因组和转录组数据，采用 RT-PCR 技术克隆到一个中碱性转化酶基因 HbNIN8 的全长 cDNA。该基因预测编码 630 个氨基酸。同源和亚细胞定位分析表明，HbNIN8 属于 α 类中碱性转化酶，叶绿体定位。应用毕赤酵母真核表达获得其重组蛋白，分析了其酶活性特点，HbNIN8 在毕赤酵母中重组蛋白的最适 pH 为 7.5，最适温度为 45 ℃。实时荧光定量 PCR分析表明，HbNIN8 主要在叶片中表达，其表达量随着叶片的成熟而逐渐增加，在稳定期叶片中达到最大，在成熟叶片中，HbNIN8 的表达呈现明显的昼夜差异，晚上的表达水平相对高于白天。因此，HbNIN8 很可能是负责将叶绿体中的蔗糖水解为单糖，从而调控橡胶树叶绿体内蔗糖和淀粉的分配。     

大豆GmERF6基因的原核表达及重组蛋白纯化

将大豆中已克隆的一个新的ERF转录因子基因(GmERF6)构建到原核表达载体pET28上,导入大肠杆菌Rosetta(DE3)中,对其进行IPTG诱导.结果表明:在IPTG浓度为0.3 mol·L-1,诱导时间为3h时,重组蛋白得到表达,分子量大约为30 kDa.SDS-PAGE电泳结果表明重组蛋白主要以包涵体形式存在...     

大豆GmPM13基因的克隆及原核表达

通过对大豆(Glycine max)油体钙蛋白(caleosin)基因GmPM13的克隆及原核表达,为今后利用基因工程方法检测转GmPM13基因提供抗体。运用RT-PCR技术克隆得到大豆油体钙蛋白GmPM13基因,构建原核表达载体,命名为p ET-28a-pm13。并转化到Ecdi和Rosetta中,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,SDS-PAGE分析GmPM13蛋白的表达情况。大豆GmPM13基因全长c DNA序列为738 bp,包括一个720 bp的开放阅读框,编码239个氨基酸,油体钙蛋白的分子量为27.1 k Da,诱导表达产物的大小与预计蛋白大小相符。在28℃,1.5 mol·L~(-1)IPTG浓度下,诱导12 h蛋白的表达量最高,占总蛋白的39.25%。     

橡胶树中碱性转化酶基因 HbNIN8 的克隆与表达分析

蔗糖是高等植物光合产物的重要存储方式,而转化酶和蔗糖合酶是水解蔗糖的主要酶。研究基于橡胶树的基 因组和转录组数据,采用 RT-PCR 技术克隆到一个中碱性转化酶基因 HbNIN8 的全长 cDNA。该基因预测编码 630 个氨 基酸。同源和亚细胞定位分析表明,HbNIN8 属于 α 类中碱性转化酶,叶绿体定位。应用毕赤酵母真核表达获得其重组 蛋白,分析了其酶活性特点,HbNIN8 在毕赤酵母中重组蛋白的最适 pH 为 7.5,最适温度为 45 ℃。实时荧光定量 PCR 分析表明,HbNIN8 主要在叶片中表达,其表达量随着叶片的成熟而逐渐增加,在稳定期叶片中达到最大,在成熟叶片 中,HbNIN8 的表达呈现明显的昼夜差异,晚上的表达水平相对高于白天。因此,HbNIN8 很可能是负责将叶绿体中的 蔗糖水解为单糖,从而调控橡胶树叶绿体内蔗糖和淀粉的分配。     

短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX几丁质酶基因(chiD)的克隆与原核表达

以短短芽胞杆菌FJAT-0809-GLX基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到几丁质酶基因chiD序列,再将chiD序列连接到pMD18-T克隆载体上,形成重组载体pMD18-T-chiD,转化大肠杆菌DH5ɑ并测序,经过核苷酸和氨基酸序列分析获得几丁质酶基因chiD的序列片段为1 524 bp,编码507个氨基酸,理论蛋白质分子量约54.55 ku,其等电点约为5.77,表明该几丁质酶为酸性几丁质酶。将重组质粒pMD18-T-chiD双酶切后与表达载体pET-28a连接,构建重组表达载体pET28a-chiD,并转入大肠杆菌BL21中进行IPTG诱导表达,结果表明:重组蛋白质的分子量约55 ku,与预测的蛋白分子量结果一致。为了提高重组蛋白的表达量,对培养时间、IPTG浓度和温度3个参数进行优化,并将表达产物进行SDS-PAGE分析,最后得出重组载体pET28a-chiD的最佳诱导表达参数分别为8 h、0.5 mmol/L和28℃。这为短短芽胞杆菌来源的几丁质酶的进一步研究奠定了良好基础。     

小麦热激蛋白WHSP90基因的原核表达及多克隆抗体制备

为了进一步研究HSP90基因的功能,将WHSP90基因构建到原核表达载体pET-28a(+)中,得到His-WHSP90融合表达载体,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,发现1 mmol/L IPTG诱导4 h蛋白表达量最大;经过蛋白标记亲和层析柱(HisTrapTMHP)纯化得到的纯化蛋白浓度达到0.4 mg/mL.免疫家兔制备抗体,用间接ELISA法检测免疫后家兔抗血清效价大于125 000,满足后续试验要求的效价值,为在蛋白水平上研究WHSP90基因功能提供了基础.     

橡胶树HbJAZ3突变体蛋白的原核表达及纯化

植物JAZ蛋白是茉莉酸信号调控途径的关键环节之一。HbJAZ3基因是橡胶树乳管细胞中编码JAZ蛋白的基因家族成员之一。本文采用原核表达和定点突变技术,构建了pET28a（+）-JAZ3、pET28a（+）-JAZ3-ZIM-mut（缺失ZIM结构域中TIFY基序）和pET28a（+）-JAZ3-Jas-mut（缺失Jas结构域的保守氨基酸FLEKRK）的His标签融合蛋白表达载体,并成功转化大肠杆菌Rosetta（DE3）。在37 ℃条件下,用1 mmol/L IPTG诱导2 h能够诱导目的蛋白以包涵体的形式大量表达。通过镍柱纯化了目的蛋白,获得了HbJAZ3及其ZIM结构域和Jas结构域的突变体蛋白,为进步一鉴定乳管细胞茉莉酸信号途径的关键环节打下了良好基础。     

HARDY基因的克隆、原核表达及其植物表达载体的构建

为了给转HARDY(HRD)基因小麦研究奠定基础,利用PCR技术从拟南芥中克隆HRD基因,进行生物信息学分析,预测其编码的蛋白质结构与功能,构建原核表达载体pET28a(+)-HRD,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导蛋白的表达,同时构建pBin-HRD植物表达载体。测序分析结果表明,克隆的HRD与NCBI发布的拟南芥核苷酸序列的同源性为99%,其开放阅读框长555bp,可编码184个氨基酸,具有许多重要功能位点;成功构建了原核表达载体pET28a(+)-HRD和植物表达载体pBin-HRD,诱导表达出大小约为23.3kD的蛋白,与理论值相近。     

小麦Rht3基因对萌发籽粒α—Amy1表达和抗穗发芽的影响

以小麦赤霉酸反应不敏感的Rht3矮秆基因近等基因系及其分离群体为材料，分析了Rht3对α-淀粉酶同功酶的影响。结果表明Rht3主要对α-Amy1的表达起作用，高矮亲本间α-Amy1等电聚焦同功酶谱带有明显差异，高秆轮回亲本在pH5.0-5.3区域具特异带，分离群体中高秆与矮秆之间的α-Amy1同功酶谱带差异明显，但酶谱较为复杂。Rht3主要通过影响α-Amy的表达而增强了穗发芽抗性。     

桑树MaUBC-C基因的表达模式分析及原核表达

泛素结合酶E2（ubiquitin-conjugating enzyme, UBC）在植物中具有重要的作用，参与植物的生长发育、逆境胁迫、免疫响应等生理活动。本课题组前期通过分析桑脉带相关病毒（Mulberry vein banding-associated virus, MVBaV）侵染的桑树品种‘桂桑优62号’（Morus atropurpurea）转录组获得了上调表达的基因MaUBC-C。为探究泛素结合酶MaUBC-C基因的功能，本研究以‘桂桑优62号’桑树为材料，克隆MaUBC-C的CDS序列进行生物信息学和表达模式分析，并对其进行原核表达获得该蛋白。结果显示，MaUBC-C编码区全长为567 bp，编码蛋白含188个氨基酸，大小为21.03 kDa，属于亲水、酸性、不稳定的核定位蛋白，具有保守的UBC结构域。将其氨基酸序列与其他物种的UBC氨基酸序列进行比对和进化分析，发现MaUBC-C与川桑MnUBC-C的相似性最高为98.40%，且具有最近的进化亲缘关系。荧光定量PCR分析MaUBC-C基因表达模式，结果显示MaUBC-C在桑苗的根、茎、叶中均有表达，其中在根部表达量最高，分别是茎和叶的1.24倍和1.71倍；对外源激素（ABA、GA、MeJA、SA）和非生物胁迫（低温、高温、高盐、干旱）处理均产生响应，且在ABA和MeJA处理下表现出显著上调，在24 h时的表达量分别为正常水平的29.55、9.05倍，推测MaUBC-C在桑树的生长发育中具有广泛的调控作用，参与桑树的激素信号转导和对非生物胁迫的防御反应。利用无缝克隆技术构建MaUBC-C原核表达载体pET-30a-MaUBC-C并转化大肠杆菌BL21，0.5 mmol/L IPTG在37℃条件下进行诱导，获得约为25 kDa的融合蛋白，与预期大小相符，为今后进行MaUBC-C基因功能研究提供了基础材料。本研究为进一步探究桑树泛素蛋白酶体途径的作用机制奠定了基础。     

马蓝IGPS基因的克隆、表达分析及原核表达

吲哚-3-甘油磷酸合酶（indole-3-glycerol phosphate synthase,IGPS）是广泛参与生物体内色氨酸、生长素等吲哚化合物合成途径中重要的关键酶之一。为了研究BcIGPS在马蓝吲哚类生物碱合成中的作用,基于马蓝转录组数据,通过RT-PCR技术从马蓝中克隆得到IGPS基因序列,命名为BcIGPS;利用生物信息学分析BcIGPS序列特性;运用qPCR分析BcIGPS在马蓝不同器官及外源诱导处理下的时空表达情况;构建pET-32a-BcIGPS原核表达载体,并优化诱导表达条件。结果表明：BcIGPS（GenBank登录号：MT210517）全长为1176 bp,包含1个开放阅读框（ORF）,编码392个氨基酸,具丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）、酪氨酸（Tyr）磷酸化位点31个,无跨膜结构,无信号肽,亚细胞定位于叶绿体中。BcIGPS含有product（indole）活性结构域和IGPS、TrpC特异性位点。qPCR分析结果显示,BcIGPS基因在不同器官的相对表达丰度依次为：叶>茎>花>根;其响应茉莉酸甲酯（MeJA）、脱落酸（ABA）、水杨酸（SA）、乙烯利（ETH）外源诱导信号的诱导,经MeJA和ETH处理后,分别在24 h和36 h最高,为初始水平的5.53、6.87倍;在SA处理下,BcIGPS表达响应最为强烈,呈先骤升后骤降的变化趋势,在12 h最高达初始水平的33.13倍;ABA处理后,其表达量变化不显著。所构建的pET-32a-BcIGPS原核表达载体在大肠杆菌BL21中表达,其最适条件为37 ℃、0.4 mmol/L IPTG培养3 h,BcIGPS重组蛋白主要以包涵体形式存在,且蛋白分子量与预测相符。     

水稻叶绿体基因组定点表达载体的构建及增强型绿色荧光蛋白原核表达分析

分别克隆了水稻叶绿体基因组同源重组片段trnI和trnA、具有3种不同核糖体结合位点(RBS)序列的增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)、来自烟草叶绿体的16S rRNA基因启动子Prrn和psbA基因终止子TpsbA,将上述元件通过酶切位点依次连接到质粒pUC19上,构建了3种能编码增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的水稻叶绿体基因组定点整合表达载体pIA - EGFP1、pIA - EGFP2和pIA - EGFP3.进行分子检测验证后,对上述载体进行了大肠杆菌EGFP原核表达检测,结果携带来源于λ噬菌体T7基因10的5′端非翻译区的载体pIA - EGFP3荧光最强,适合用于水稻叶绿体转化.     

番茄中一个F-box/FBA基因的表达分析及载体构建

通过生物信息学分析从番茄基因数据库中筛选出一条全长cDNA序列,命名为SlFbf（GenBank登录号:AK326236.1）。通过设计特异引物克隆该基因。SlFbf全长1 464 bp,编码381个氨基酸,N端含有F-box结构域,C端含有FBA₁结构域,在基因组序列中无内含子。半定量及定量RT-PCR分析结果表明,该基因在番茄的根、茎、叶、花蕾、花、青果、黄果及红果中均有表达,且在开花当天的雄蕊中表达最强,推测该基因在雄蕊发育中起着重要作用。同时构建了番茄SlFbf基因的正、反义植物表达载体,为深入研究该基因功能奠定了基础。     

斑茅SAMDC基因的克隆及其原核表达分析

以斑茅(Erianthus arundinaceus)samdc基因的cDNA为基础,采用基因重组技术,将该基因按正确的阅读框架定向克隆于原核表达载体pET-29a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE分析.结果表明:重组斑茅samdc基因在大肠杆菌中获得高效表达,其分子量约为43.281kDa.斑茅samdc基因原核表达载体的成功构建和重组斑茅SAMDC蛋白在大肠杆菌中的高效表达,为进一步研究其生物学功能奠定了基础.     

水稻OsWRKY7基因的表达研究

WRKY蛋白是植物中一类重要的转录因子,不仅参与植物生长发育的调控,还参与植物对各种生物和非生物胁迫的响应。本研究从水稻日本晴中分离OsWRKY7基因的编码序列(CDS),并克隆其启动子序列进行表达研究。首先通过实时定量PCR的方法检测不同组织中OsWRKY7基因的相对表达量,结果表明,OsWRKY7在叶片中的表达水平较高,且开花期的剑叶中表达量高于7 d苗龄的幼叶。进一步将OsWRKY7启动子与GUS报告基因融合,构建了植物表达载体pOsWRKY7-GUS,并将此载体转化日本晴。转基因植株不同组织染色分析结果显示,该启动子在植株的主根尖、叶片、颖壳中有GUS活性,其中叶片上可见全叶范围分布的大量蓝色斑点,这些染色结果与实时定量PCR的结果一致。进一步的接菌和激素处理还显示,OsWRKY7启动子在根和叶中的表达均受水稻白叶枯病菌[Xanthomonas oryzae pv. Oryzae(Xoo)]P10生理小种侵染的诱导,同时还受外源施加的细胞分裂素和生长素诱导,而水杨酸则会抑制其在根和叶中的表达。此外,我们还将OsWRKY7基因的CDS序列分别与绿色荧光蛋白和酵母GAL4的DNA结合域融合,对该基因进行水稻茎原生质体亚细胞定位分析和酵母自激活检验,结果显示该基因定位于细胞核中并具有转录自激活活性。上述结果表明OsWRKY7具有明显的转录激活因子特征,其很可能参与了水稻对白叶枯菌的防御反应以及对多种激素信号的转导过程。     

花生AhFUSCA3基因的原核表达及在非生物胁迫下的表达分析

根据本实验室已获得的花生AhFUSCA3基因(NCBI登录号JX420284)序列,设计特异引物,构建原核表达载体,进行了重组蛋白表达分析,获得了分子量为42KD左右的目的蛋白条带;利用荧光定量PCR(Quantitative Real-time RT-PCR)方法,检测了AhFUSCA3基因在低温、高盐和干旱胁迫条件下的表达情况。结果显示,AhFUSCA3基因在低温和高盐处理的花生叶片中表达量明显上调,但在干旱处理的叶片中表达量则有明显下降。以上结果表明AhFUSCA3基因可能参与了花生对低温、高盐和干旱的抗性调控。     

甘薯脱毒苗生产力表现研究

试验研究了金山57和岩薯5号脱毒苗产量形成特性,结果两个品种脱毒苗比对照增产分别达显著和极显著水平,生物产量和经济系数均高于对照。