两种固定液对鸭小肠肥大细胞染色效果的比较

为了探讨不同固定液对鸭小肠肥大细胞甲苯胺蓝染色效果的影响及鸭小肠内肥大细胞的数量和分布情况，试验选择5只100日龄的健康淮南麻鸭公鸭为研究对象，取鸭只十二指肠、空肠和回肠组织样品，均分为两份，分别置于10%中性福尔马林固定液和卡恩氏(Carnoy)固定液中固定，常规制作石蜡切片，切片经甲苯胺蓝染色后，观察小肠肥大细胞染色效果和肥大细胞形态、数量及分布，并进行统计分析。结果表明：Carnoy固定液对肥大细胞的染色效果优于10%中性福尔马林固定液，染色评分极显著高于10%中性福尔马林固定液(P<0.01);Carnoy固定液固定的十二指肠、空肠、回肠肥大细胞数量均极显著高于10%中性福尔马林固定液(P<0.01)。鸭十二指肠、空肠和回肠中肥大细胞形态和数目不同，在黏膜固有层血管、腺管周围的结缔组织中分布较多；空肠中肥大细胞数量最多，形态多样；十二指肠和回肠中肥大细胞数量递减，形态多为圆形。说明与10%中性福尔马林固定液相比，经Carnoy固定液固定的鸭小肠组织染色后，可清晰显示肥大细胞的形态分布。     

雏鸡免疫器官与消化器官发育中肥大细胞的观察

本试验通过Carony's液固定,阿尔新蓝-藏红O复染(AB/SO)法,对1~7日龄雏鸡免疫器官和消化器官中肥大细胞(mast cells,MC)的形态、分布及数量变化进行观察分析.结果表明,免疫器官中MC集中分布在胸腺髓质内、脾脏红白髓交界处、法氏囊的淋巴小结周围组织内;消化器官中MC密集分布于腺胃固有层和胃腺周围、肠的固有层及黏膜下层、肝脏窦状隙和中央静脉周围.雏鸡主要免疫器官与消化器官MC数量随日龄增长均呈上升趋势.     

贵州白香猪的育种原理与方法

(上接2012年第7期125页)6杂种猪的生长发育测定1997我们对剑白香猪作正、反交试验,其F1代作生长发育测定结果,用其判断剑白香猪基因型。结果见表1。由表1说明:杂种猪2～6月龄体重、体尺均大于纯种剑白香猪,而小于大约克猪,虽表现了杂种优势,但杂种猪的体尺、体重小于大约克同龄猪的体尺体重,说明杂种猪受矮小型基因影响而控制其体型增大,进一步说明剑白香猪是小型猪。正交F1代的平均体重、体尺均大于反交,因大约克母猪的体型大,哺乳期储备的营养多,可能与母体效应有关;反交杂种猪的体尺、体重偏向剑白香猪。反交后,不同月龄杂种猪体尺变化趋向于剑白香猪纯繁后代的体尺参数,这些参数与从江香猪相近,更说明剑白香猪是小型猪。     

不同日龄久仰香猪、剑白香猪与长白猪空肠粘膜组织学观察

应用组织学方法分别对14、28日龄贵州久仰香猪、剑白香猪和长白猪空肠前段的形态变化进行比较研究.结果表明久仰香猪的绒毛最长,绒毛长度/隐窝深度的比值最高.同一日龄不同品种间比较.在宽度上14日龄剑白香猪和长白猪之间与28日龄剑白香猪和久仰香猪之间差异不显著(P＞0.05);绒毛数量为14日龄久仰香猪和剑白香猪之间差异不显著(P＞0.05);隐窝深度为28日龄剑白香猪和久仰香猪之间差异不显著(P＞0.05).同一品种不同日龄之间比较,3种猪从14日龄到28日龄绒毛的长度都变短,且差异显著(P＜0.01);绒毛数量从14日龄到28日龄均有增加,但剑白香猪差异不显著(P＞0.05);剑白香猪和长白猪绒毛宽度出现增加,而久仰香猪绒毛宽度降低,但差异不显著(P＞0.05);隐窝深度从14日龄到28日龄均出现加深,但久仰香猪加深显著(P＜0.01).久仰猪的绒毛长度/隐窝深度的比值最高(14日龄为9.39±3.65;28日龄为5.42±1.83).     

鸡胚发育中免疫器官肝素阳性细胞的观察

本试验通过NBF液固定,阿尔新蓝—藏红O复染(AB/SO)法与吖啶橙染色(Acridine-Orange,AO),对不同日龄鸡免疫器官中肥大细胞(MC)及肝素阳性细胞的形态、分布及数量变化进行观察分析.结果显示,NBF溶液固定,AO染色可以清晰地显示肝素阳性细胞,其呈圆形、椭圆形和不规则形,大小不一;胸腺中肝素阳性细胞主要分布在髓质;法氏囊中肝素阳性细胞多分布于淋巴小结周围;脾脏中肝素阳性细胞分布在实质,血窦、血管周围偶见;肝素阳性细胞与AB/SO染色显示的MC的分布十分相似;18日胚龄前,免疫器官中肝素阳性细胞的数量与胚龄呈正相关,18日胚龄后肝素阳性细胞数量下降是否与肥大细胞脱颗粒有关,尚不清楚.     

绒山羊肥大细胞类胰蛋白酶的免疫组化及图像分析研究

[目的]探讨绒山羊肥大细胞中是否存在类胰蛋白酶及不同固定液对其常规染色和免疫组化染色结果的影响。[方法]采用兔抗羊肥大细胞类胰蛋白酶多克隆抗体间接免疫过氧化物酶技术检测由Carnoy液和中性福尔马林液(NBF)固定的绒山羊空肠、瓣胃和肺等组织肥大细胞中是否存在类胰蛋白酶。同时采用Image-ProPlus图像分析软件和人工计数法对结果进行分析,比较经常规染色和免疫组化染色后不同固定液固定组织中肥大细胞的形态及数量,进而判断Carnoy液和中性福尔马林液(NBF)对该检测技术的影响。[结果]兔抗羊多克隆抗体与绒山羊肥大细胞中的类胰蛋白酶具有良好的交叉反应,证实绒山羊肥大细胞胞浆颗粒中存在类胰蛋白酶。同时,与Carnoy液相比较,NBF液固定组织能较好地反映肥大细胞在组织中的数量和形态变化。[结论]绒山羊肥大细胞中存在类胰蛋白酶,且与Carnoy液相比较,NBF液是一种更为适合绒山羊肥大细胞常规染色和免疫组化染色的固定剂。     

CYP7B1和CYP4B1基因mRNA在不同毛色贵州剑白香猪皮肤组织中的表达分析

为了分析CYP7B1、CYP4B1基因在剑白香猪的黑色和白色皮肤组织中的表达差异,试验通过提取剑白香猪黑色和白色皮肤组织的RNA,分别逆转录合成相应的cDNA;以GAPDH基因作为内参,采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测CYP7B1、CYP4B1基因mRNA在黑色和白色皮肤组织中的相对表达量。结果:CYP7B1、CYP4B1基因在剑白香猪黑色皮肤中表达量较高,在白色皮肤组织中表达量很少甚至几乎不表达。结论:推测CYP7B1、CYP4B1基因可能与剑白香猪黑色皮肤的形成有关,为进一步研究CYP7B1、CYP4B1基因在香猪的黑色和白色皮肤组织中的功能提供数据基础。     

贵州香猪不同发育阶段睾丸组织肥大细胞观察

为了解贵州香猪不同发育阶段睾丸肥大细胞(MC)数量的变化情况,试验采用外科手术法取出30,40,50,60,90,110日龄(每个日龄段3～4头)香猪右侧睾丸,卡洛氏液固定,石蜡包埋处理并作5μm厚连续切片,用改良甲苯胺蓝(MTB)染色法观察睾丸发育过程中MC的形态和数量变化。结果表明:90日龄前香猪睾丸MC数量随日龄增加而增多,到90日龄时MC数量达到最多,而110日龄时MC数量减少,极显著低于50,60,90日龄睾丸中MC数量(P<0.01)。说明性成熟(90日龄)前香猪睾丸MC数量增多,而性成熟后MC数量减少,这种变化规律有利于睾丸的发育和精子的生成,但其作用机制还需进一步研究。     

贵州剑河久仰香猪繁殖性状研究

1.1 试验动物 用剑河引进的久仰香猪、贵州大学香猪育种场饲养的剑白香猪以及贵州省畜禽良种场的提供长白猪进行饲养、繁殖及测定。     

雏鸵鸟中枢淋巴器官的形态学观察

采用H.E和甲苯胺染色,对育雏期鸵鸟胸腺和腔上囊的解剖结构、组织学特点及肥大细胞在中枢淋巴器官的分布进行了观察,并用图像分析系统对肥大细胞的数量及形态特征进行了分析。结果显示：雏鸵鸟胸腺分叶少,仅分布在颈部后段两侧,且聚集在一起,髓质内有典型的Hassall小体;胸腺内肥大细胞分布较广,其中髓质和皮-髓交界处数量最多。腔上囊前部形成盲端,覆盖于泄殖道和粪道后段背侧,后部构成肛道背外侧壁,不形成真正的囊,其内表面皱褶上有密集分布的乳头;腔上囊小结单个分布并凸出于黏膜上皮;黏膜上皮为复层柱状上皮,移行至腔上囊小结处变为单层柱状上皮;腔上囊内肥大细胞主要分布在黏膜上皮。以上结果表明,雏鸵鸟中枢淋巴器官与其他禽类的同类淋巴器官存在明显的差异,且中枢淋巴器官内肥大细胞数量较多,不同器官或同一器官不同部位肥大细胞的形态、大小和颗粒染色深浅均有所不同。     

巴马香猪VRTN基因克隆、表达及其多态性与繁殖性状的关联分析

旨在研究VRTN（vertebrae development homolog）基因在巴马香猪群体中的编码区序列特征、组织表达情况、脊椎数性状因果突变位点ins291的等位基因频率及其与乳头数和产仔数性状的关联。本研究采集3头0日龄巴马香猪组织,利用cDNA克隆技术获得VRTN基因编码区全长序列并进行生物信息学分析,利用荧光定量PCR技术检测VRTN在心、肝、脾、肺、肾、背最长肌和皮下脂肪组织中的表达情况;采集279头经产巴马香猪母猪血液,检测ins291位点在该群体中的频率分布,并与乳头数、产仔数性状进行关联分析。结果表明,巴马香猪VRTN基因编码区全长2 097 bp,其编码的氨基酸序列在不同物种间存在大量保守区域;VRTN基因编码698个氨基酸,预测为亲水性蛋白质,存在1个螺旋转角螺旋域超家族结构功能区、2个低复杂度区域和2个内部重复结构,并与核受体辅抑制子1（NR6A1）、果蝇同源框基因Prospero的脊椎动物同源蛋白2（PROX2）和富亮氨酸重复序列74亚基（LRRC74A）等蛋白具有相互作用;VRTN基因在0日龄巴马香猪各组织中均有表达,其中在背最长肌组织中表达量最高;巴马香猪保种群体中VRTN基因有利突变位点ins291的等位基因频率为21.15%,不同基因型个体之间平均产仔数、总乳头数、左侧乳头数、右侧乳头数和单侧最大乳头数性状均无显著差异（P>0.05）,但纯合突变型（ins/ins）个体的乳头数性状均高于其他基因型个体。结果提示,在巴马香猪产业化生产中可通过分子育种手段提高VRTN ins291有利等位基因频率,但不影响其产仔数性状。     

调控香猪繁殖候选miRNA筛选

研究旨在从香猪卵巢small RNA测序数据中挖掘调控香猪繁殖的microRNA （miRNA）,解析miRNA调控香猪卵巢功能及繁殖性状的分子机制,对于猪的遗传选育具有重要意义。研究选取发情期和间情期的香猪各4头,屠宰后取其卵巢组织,提取总RNA进行small RNA测序,利用生物信息学方法检测miRNA表达谱,筛选差异表达的miRNA,预测差异表达miRNA靶基因,并对靶基因进行GO功能富集和KEGG通路富集分析。结果显示,香猪卵巢组织中miRNA在染色体上呈不均匀分布,主要分布于1号染色体和X染色体上。香猪卵巢中共有627个已知猪miRNAs表达,其中有34个差异表达miRNAs,表达量前五的分别是miR-23、let-7i-5p、miR-103、miR-30e-5p和miR-1271-5p。GO功能分析结果显示,靶基因主要参与的生物学过程是细胞过程（cellular process）,主要分布于细胞（cell）,主要分子功能是结合（binding）;KEGG显著富集通路中,促性腺激素释放激素受体通路（gonadotropin-releasing hormone receptor pathway）、胰岛素样生长因子通路（IGF pathway）和表皮生长因子受体信号通路（EGF receptor signaling pathway）与卵母细胞的发育成熟相关,因此推测miR-23b、let-7i-5p、miR-103、miR-30e-5p和miR-1271-5p可能参与了香猪繁殖调控。本研究初步筛选出5个可能调控香猪繁殖性能的miRNAs,可为从分子水平提高香猪产仔数提供理论基础。     

Morphological and immunocytochemical investigations on mast cells in porcine ureter

Morphological, morphometric, histochemical and immunocytochemical investigations on mast cells, located in the wall of ureter of 8 months aged pigs were performed. Mast cells were found in all three layers of ureteral wall, but their distribution was irregular and the number unequal. It was established that alcian blue (AB)-positive mast cells were significantly more than toluidine blue (TB)-positive mast cells. A statistically significant smaller number of both AB and TB-stained mast cells were observed in the tunica mucosa. The largest number of mast cells was found in the tunica muscularis. In the adventitia, mast cells were higher in number in the main connective tissue than in the connective tissue near the blood vessels. Mast cells stained with TB showed variably expressed gamma-metachromasia, which was best visible in those situated in the lamina propria of the mucosa. The prevailing parts of mast cells, however, were AB-positive after AB-safranin staining. This was mostly found in mast cells of the tunica muscularis and in mast cells of perivascular location in the tunica adventitia. Immunocytochemically, mast cells were found to be positive for histamine and vasoactive intestinal polypeptide in the muscle coat, and to histamine in the adventitia, as well. On the basis of obtained results it was presumed that the mast cells in porcine ureter most probably took part not only in keeping of local homeostasis, but played also an important role of mobility of smooth muscle cells in the middle layer of ureter on one hand, and, on the other, in the adventitial blood vessels.     

从江香猪生精上皮周期及睾丸发育的形态学分析

试验旨在探究初情期前后生精上皮周期差异及睾丸发育过程中的形态学变化。通过测定15、30、60和90 d睾丸相关指数，结合睾丸组织形态学特征，判断香猪初情期，划分从江香猪生精上皮周期。结果显示，30 d的睾丸指数较15 d极显著升高（P<0.01），睾丸重、长轴及短轴的增长率分别为298.05%、66.42%和65.45%，60和90 d两个阶段睾丸重增长率相对稳定。形态学观察表明，从江香猪30 d时生精小管出现游离精子，完成第一次生精并进入初情期；与15 d相比，30 d生精小管面积和生精上皮厚度极显著增加（P<0.01），增长率分别为136.12%和40.19%，在60和90 d均处于稳定增长状态。睾丸细胞数统计显示，日龄增加不影响支持细胞（setoli cells，SC）数量（P>0.05），而30 d生殖细胞数（germ cells，GC）较15 d极显著增加（P<0.01）。相关分析结果发现，生殖细胞数量增加与生精小管面积增大、生精上皮厚度变化之间呈明显正相关（r=0.994；0.96）。根据生殖细胞组合形式差异，将初情期前后生精上皮分为3和8个阶段。初情期前生殖细胞以第一次减数分裂前期为主，A、B型精原细胞、SC、初级精母细胞（primary spermatocyte，Ps）、前细线期（preleptotene，PI）、细线期（leptotene，L）等生殖细胞在初情期前后生精上皮中均存在，而圆形精子（round spermatids，R）、延伸精子（elongating spermatid，E）、精子细胞（spermatozoa，S）仅存在于初情期后的生精上皮。本研究结果表明，从江香猪30 d初情，睾丸发育以生殖细胞和生精小管面积的迅速增加为主，该结果对从江香猪早熟性状挖掘、种猪选育及开发利用等有重要的指导意义。     

皱皮香猪3个基因组拷贝数变异的多态性分布

为探究皱皮香猪个体产生皮肤变异的根本原因,本文基于重测序数据,采用生物信息学分析皱皮香猪基因组中的拷贝数变异(CNV),通过荧光定量 PCR 方法检测皱皮香猪中 3 个 CNVs 的拷贝数变异规律,并与香猪和大白猪进行比较。结果表明:3 个 CNVs 在猪群中的拷贝数变异呈现出多态性变化,皱皮香猪中CNV1以拷贝数缺失型为主,其中的 MPC1和 RSK3基因可能与脂肪沉积有关;皱皮香猪 CNV2和 CNV3以拷贝数增加型占优势,其中的 CCL17和 CX3CL1基因参与皮肤等组织的炎症反应,可能通过剂量效应引起香猪皮肤产生褶皱。     

ZBED6基因对巴马香猪脾发育的作用机制分析

ZBED6基因作为一个转录因子,能够与IGF2结合进而调节肌肉的生长发育。但其在脾生长发育中的作用尚不清楚,本研究利用RNA-seq测序技术比较ZBED6基因敲除巴马香猪（ZBED6-KO）和同日龄野生型巴马香猪（WT）的脾组织转录组,探究ZBED6基因对巴马香猪脾组织的发育影响。利用t检验对ZBED6-KO猪和WT猪脾组织大小的表型差异及ZBED6直接调控的靶基因IGF2的表达量进行显著性分析。提取ZBED6-KO猪和WT猪脾组织的总RNA,在Illumina Hiseq 2500平台进行RNA-seq分析。以猪Sus scrofa11.1为参考基因组,用转录组分析的标准流程筛选ZBED6-KO猪和WT猪脾组织中的差异表达基因。用DAVID在线网站对差异表达基因进行GO和KEGG富集分析。然后,随机选取7个差异表达的基因,利用实时荧光定量PCR技术验证测序结果的准确性与可靠性。结果显示,与WT猪相比,ZBED6-KO猪脾的重量和IGF2基因表达量均显著增加（P<0.05）,表明ZBED6基因的敲除对巴马香猪脾组织的生长发育有一定的促进作用。测序结果显示,各样本至少获得4G的数据量,每个样本的Clean Ratio及Q30比率均在90%以上,83.94%以上的reads可比对在猪的参考基因组上,表明测序数据质量良好,真实可靠;对测序数据进行转录组分析,共筛选到161个差异表达基因,其中上调基因90个,下调基因71个;差异表达基因的层次聚类分析显示,ZBED6-KO猪的3个个体（spleen1、spleen3、spleen6）的表达模式相似,WT的3个个体（spleen2、spleen4、spleen5）的表达模式相似,进一步证明测序数据的准确可靠;GO和KEGG富集分析中,富集到10条显著的GO条目以及5条显著的信号通路,2条与肌肉发育相关的通路;实时荧光定量PCR试验随机检测7个差异表达基因的表达模式与RNA-seq分析结果相一致,证实了测序数据的可靠性。以巴马香猪为模型,利用RNA-seq技术研究ZBED6基因的敲除对中国地方猪脾发育的作用影响,为挖掘ZBED6基因的更多功能提供了基础。     

猪淋巴器官内肥大细胞的研究

自从1877年Ehrlich氏在疏松结缔组织内发现并描述了肥大细胞以后,肥大细胞作为疏松结缔组织中的细胞成分,已为世界各国动物学界和医学界的广大学者所公认。但近年来笔者在组织学研究中发现,在生理状态下,猪的淋巴组织和淋巴器官内却分布着比疏松结缔组织多5～20倍的肥大细胞。同时还发现肥大细胞与T淋巴细胞的关系极为密切,它们总是结伴相处,分布于胸腺的皮质与髓质、脾脏和淋巴结的胸腺依赖区及全身各处的弥散淋巴组织内。因此,我们认为肥大细胞可能是机体免疫系统的重要细胞成分。     

贵州香猪染色体核型研究

以贵州香猪(久仰香猪、剑白香猪、从江香猪)为试验组,长白猪为对照组,用外周血淋巴细胞培养对其染色体核型进行研究。结果表明,各香猪类型及长白猪淋巴细胞染色体数均为2n=38;香猪染色体核型组成为10sm 4st 12m 12t,长白猪则为8sm 4st 14m 12t;性染色体雌性均为XX,雄性均为XY,X、Y属中着丝粒染色体,Y是中着丝粒染色体相对长度最短的一条;3,5,6,7和9号染色体的臂比值各香猪类型与长白猪相比,差异显著(P<0.05)或极显著(P<0.01);1,5,6,8,9和11号染色体的相对长度各香猪类型与长白猪相比,差异显著(P<0.05)或极显著(P<0.01);香猪类型间也存在一定差异。     

Effect of orally administered probiotic E. coli strain Nissle 1917 on intestinal mucosal immune cells of healthy young pigs

Several beneficial effects of probiotics have been described in studies using rodent disease models and in human patients; however, the underlying mechanisms remained mostly unclear. Only a few studies focused on the effects of probiotics on the intestinal mucosal immune system. Here, we studied the effect of the probiotic strain E. coli Nissle 1917 (EcN) administered orally to young pigs at two concentrations (10(9) and 10(11)CFU/d for 21 days) on the gut-associated lymphatic tissue. This probiotic strain was shown recently to reduce recurrence of inflammation in ulcerative colitis patients. We quantified the number and distribution of intestinal immune cells (granulocytes, mast cells, CD4+, CD8+, CD25+, IgA+ lymphocytes) and the mucosal mRNA expression of cytokines (IFN-gamma, TNF-alpha, TGF-beta, IL-10) and antimicrobial peptides (PR-39, NK-lysin, prepro-defensin-beta 1, protegrins). The number and distribution of cells were highly different between small intestinal and colon segments in all groups, but were not influenced by EcN, except high dose EcN fed pigs (10(11) CFU/d) showing an increase in mucosal CD8+ cells in the ascending colon. The mRNA analysis revealed no changes associated with EcN feeding. In conclusion, according to our analyses EcN has only minor effects on the distribution of mucosal immune cells in the gut of healthy individuals. The well-established preventive effects of EcN might therefore be relate to other mechanisms than simple modulation of immune cell distribution.     

Tissue distribution and genetic typing of porcine circoviruses in pigs with naturally occurring congenital tremors.

Congenital tremors (CT) type A2 is associated with porcine circovirus (PCV) and deficient and abnormal myelin. The aim of this study was to determine the tissue distribution and genetic type of PCV in 1-2-day-old pigs with naturally occurring CT type A2 using in situ hybridization, polymerase chain reaction (PCR), and indirect fluorescent antibody tests on frozen tissue sections. CT-affected and clinically normal pigs were selected from 4 farms in the midwestern USA that were undergoing outbreaks of CT type A2. All CT and most normal pigs were infected with PCV. PCV was widely distributed in tissues of infected pigs and was most common in tissues of the central nervous system and liver. In all infected pigs, there were more PCV-infected cells in brain and spinal cord than in nonneural tissues. CT pigs had many more PCV-infected cells in the brain and spinal cord than did clinically normal pigs because of a more diffuse distribution and a larger proportion of infected cells. The cells most commonly infected with PCV in brain and spinal cord were large neurons. In nonneural tissues, macrophages were the most frequent cell type infected. PCR analysis demonstrated only PCV type 2 and not PCV type 1 in all PCV-infected pigs on all 4 farms.