百合LfMADS基因植物表达载体的构建及其功能分析

 为了分析百合LfMADS1和LfMADS3基因的功能，分别将其正、反义基因插入到植物组成型双元载体pBin438中，并通过根癌农杆菌LBA4404介导转化烟草。PCR和PCR-Southern杂交结果均证明外源基因已经插入到烟草基因组中。转LfMASD1反义基因植株中1朵花的雄蕊极短、花药缺失；转LfMASD1正义基因植株中发现1个花萼变瓣的突变体。在转LfMASD3反义基因植株中发现1个植株的苞叶部分瓣化，花柄变短，另外1个植株上发现1朵花缺失1枚雄蕊；而转LfMASD3正义基因植株中没有发现变异。作者认为LfMASD1是百合花器官发育的B功能基因，LfMASD3是百合花器官发育的SEP基因，这些基因在烟草中的表现说明百合的花器官特性基因的表达模式与模式植物有所不同。     

柑橘冷诱导基因及其启动子表达载体构建与瞬时表达分析

【目的】以YFP为报告基因,构建柑橘冷诱导基因及其启动子的植物表达载体。【方法】克隆获得枳冷诱导基因Ptcor8及其启动子p Ptcor8,柠檬中同源基因Clcor8及其启动子p Clcor8;双酶切含启动子的克隆载体和植物表达原始载体p1D4,连接获得含启动子的中间载体;再双酶切含冷诱导基因的克隆载体和中间载体,连接后获得重组质粒;通过冻融法将重组质粒导入农杆菌EHA105中。【结果】构建了p1D4/p Ptcor8-Ptcor8::YFP,p1D4/p Ptcor8-Clcor8::YFP和p1D4/p Clcor8-Ptcor8::YFP 3个融合表达载体,瞬时表达发现3个融合基因均可在冰糖橙叶片中表达。【结论】3个融合表达载体的成功构建为下一步转化柠檬,分析枳冷诱导基因Ptcor8及其启动子p Ptcor8的功能奠定了基础。     

枇杷LFY同源基因植物表达载体构建及其功能分析

为研究枇杷LFY同源基因的功能,构建了含枇杷LFY同源基因ejLFY的植物表达载体pBI121-ejLFY,并转入到农杆菌GV3101中。利用花序侵染法将该基因导入拟南芥,经抗性筛选、PCR检测表明获得了25个转化株系。与对照相比,大部分转基因植株明显早花,成花时间可提早1周左右,莲座叶数目减少2-3片;部分植株侧生花序全部转变成单独的花,从莲座叶中抽出的花枝也全部转变为单独的花;少量转化株系花器官异常,不能形成种子。这表明枇杷LFY同源基因在其成花过程中起重要作用,为了解枇杷的成花分子机制奠定了基础。     

银杏GinNdly基因的植物表达载体构建

未知功能的植物基因一般需要通过转基因植物来研究和验证。银杏(Ginkgo biloba L．)是一种童期很长的古老植物，LEAFY基因是一个花分生组织特征基因，调控着植物开花的时间。用植物双元表达载体质粒pCAMBl-Al301构建了开花基因，LEAFY的银杏同源基因GinNdly的反义与正义植物表达载体。因pCAMBlAl301质粒的多克隆位点处没有启动子和终止子，将pB1121的35S启动子和nos终止子引入该质粒。通过PCR检测和酶切验证，证明质粒构建正确，为研究银杏花分生组织特征基因GinNdly奠定了基础。     

桃ACC氧化酶基因的克隆和植物表达载体的构建

以‘玉露’桃叶片基因组ＤＮＡ为模板,用ＡＣＣ氧化酶基因特异寡聚核苷酸为引物进行ＰＣＲ扩增,得到１．３ｋｂ左右的扩增产物,将其克隆到ｐＵＣ１９加Ｔ载体上,组建亚克隆并进行序列测定,结果表明,该基因全长有１２８８个碱基,由４个外显子和３个内含子组成。外显子由９５７碱基组成,编码３１９个氨基酸。该基因与桃、番茄、矮牵牛、康乃馨、苹果ＡＣＣ氧化酶ｃＤＮＡ氨基酸序列同源性分别为９９．３％,８３．０％,７６．８％,７４．０％,７５．０％。ＲＮＡ点杂交表明,该基因在未成熟果实检测不到杂交信号,随着成熟度增加,硬度下降,基因表达增强。将ＡＣＣ氧化酶基因分别正向和反向克隆到植物表达载体ｐＢＩ１２１中,并通过酶切分析,ＰＣＲ和点杂交鉴定重组质粒正确。将重组表达质粒导入根癌农杆菌中,经ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定证实质粒已被导入。     

草菇开伞相关基因反义表达载体构建

以质粒pCAMBIA1301和pBI121为基础构建草菇表达载体pCB。把已克隆的草菇开伞相关基因DNA片段正反向插入pCB,获得pCB—opn15和pCB—opn39,经测序证实,pCB—opn15为正向插入,pCB—opn39为反向插入。     

携带黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因的双元载体构建

以黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因为目的基因,以大肠杆菌DH5α为表达载体体外操作寄主菌,农杆菌LBA4404为最终双元载体寄主菌。将RT-PCR获得的目的基因片段连接到pMD18-Tsi mple Vectoer上,冻融法转化到大肠杆菌扩繁后,经限制性核酸内切酶酶切插入表达载体适宜酶切位点上,重组质粒DNA经冻融法转化到只含辅助质粒的根癌农杆菌中得到工程菌,完成含目的基因的双元载体构建,为培育抗CMV病毒的番茄品种打下基础。     

小西葫芦黄花叶病毒外壳蛋白基因植物表达载体的构建

小西葫芦黄花叶病毒(Zucchiniyellowmosaicvirus,ZYMV)是危害中国葫芦科作物主要病毒之一。试验以该病毒中国分离物外壳蛋白基因的克隆载体pZCP-87(含ZYMV的CP基因)为材料,经SalⅠ和BamHⅠ双酶切,从胶上回收目的基因,与经过同两种酶酶切的植物表达载体pBIN438连接,转化感受态的大肠杆菌细胞,提取质粒,经PCR和SalⅠ/BamHⅠ双酶切验证,已将该病毒外壳蛋白基因克隆到植物表达载体上(重组质粒命名为pBZCP5),采用冻融法完成了对pBZCP5质粒的农杆菌转化。该工作是通过转基因获得抗ZYMV病毒研究的基础。     

番茄microRNA基因沉默载体的构建方法

该试验提出了一种简单且快速构建番茄中人工miRNA表达载体的方法,以包含miR319a前体骨架的质粒pRS300为模板,以重叠PCR技术来扩增miR1917的前体。miR1917的靶基因是LeCTR1,是乙烯反应中的一种负调控因子。含有miR1917的重组前体成功地转化到表达载体pGreen0029-35s中,通过植物根癌农杆菌C58介导的叶盘法成功获得了转基因植株。此种方法可为番茄中miRNA的作用机理研究提供一定的理论基础。     

LEAFY基因植物表达载体的构建

本研究采用植物中间表达载体pBll21构建拟南芥花分生组织特性基因-LEAFY基因的植物表达载体。LEAYY基因带有植物组成型启动子-CαMV35S。该表达载体的构建为利用LEAFY基因进行木本果树遗传转化创造了条件。     

Construction of a Plasmid and a Standard Curve for Real-time Quantitative PCR of the Cold-induced Cor3 Gene from Volvariella volvacea

A plasmid containing target DNA and a standard curve for real-time quantitative PCR of the coldinduced Cor3 gene of Volvariella volvacea were constructed. These will provide the basis for further research on Cor3 gene expression at low temperature, and ultimately for assigning a role for the gene in the low temperature autolysis of V. volvacea.     

草菇冷诱导Cor3基因实时荧光定量PCR标准品质粒和标准曲线的构建

A plasmid containing target DNA and a standard curve for real-time quantitative PCR of the cold-induced Cor3 gene of Volvariella volvacea were constructed. These will provide the basis for further research on Cor3 gene expression at low temperature, and ultimately for assigning a role for the gene in the low temperature autolysis of V. volvacea.     

东方百合“元帅”查尔酮合酶基因表达载体构建

利用Genbank中公布的东方百合"元帅"查尔酮合酶cDNA序列,从东方百合"元帅"花瓣中扩增CHS1的cDNA开放阅读框,正向插入植物表达载体pBI121,并采用液氮冻融法将其转化到根癌农杆菌EHA105中。结果表明:经酶切和菌液PCR分析鉴定,获得与预期大小相符的1 200 bp片段,得到含有目的片段表达载体pBI121-CHS1的农杆菌菌株,可用于新铁炮百合的遗传转化。     

刺激植物响应蛋白基因TatEpl1的克隆及原核表达载体构建

以深绿木霉(Trichoderma atroviride)ACCC30153为试材,采用PCR技术克隆到刺激植物响应蛋白基因TatEpl1,并构建TatEpl1的原核表达载体。结果表明:经测序得到的cDNA和DNA序列长度分别为417bp和487bp,接受号分别为JN695780和JN695781。以cDNA为模板进行PCR获得TatEpl1基因片段,并将目的片段插入原核表达载体pGEX-4T-2的相应位置,获得重组表达载体pGEX-TatEpl1,并将其转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中获得重组菌株BL21-TatEpl1,经检测均呈阳性。     

黄瓜脂氧合酶基因CsLOX2 的原核表达载体 的构建及表达分析

以先前克隆到的黄瓜脂氧合酶基因CsLOX2 全长的cDNA 为模板,用含有特异性酶切位点
的Yh1、Yh2 为引物,通过PCR 方法将黄瓜脂氧合酶基因CsLOX2 的ORF 区构建到大肠杆菌表达载体
pGEX-4T-1 上获得原核表达载体p4t-LOX2,将该表达载体p4t-LOX2 转化到大肠杆菌菌株BL21（DE3）
中,获得相应的重组工程菌。在IPTG 诱导下,通过SDS-PAGE 电泳,得到一条约115 kD 的融合蛋白条带,
除去pGEX-4T-1 自身诱导的约26 kD 大小的GST 标签蛋白后,CsLOX2 编码一个约89 kD 的蛋白。 经过
融合蛋白表达体系的优化分析,表明该融合蛋白在 37℃,0.80 mmol·L^-1 IPTG 诱导表达 10.5 h,可获得
融合蛋白的最大表达量。     

牡丹ACC氧化酶基因的克隆与反义载体的构建

根据报道的牡丹ACC氧化酶基因(DQ337251)cDNA序列,设计一对特异引物,以牡丹品种"洛阳红"基因组DNA为模板,用PCR扩增方法克隆出牡丹ACC氧化酶基因的部分片段,并将其连接到pMD18-T载体上进行测序.结果表明,克隆的序列全长为467 bp,其中包括一个长度为157 bp的序列,推测它可能是一个内含子,其它序列与已报道序列同源性为98.2%;用SacⅠ和XbaⅠ对重组质粒和载体pBI 121酶切、连接,构建牡丹ACC氧化酶基因的反义表达载体.