绵羊体内外受精胚胎玻璃化冷冻保存

用 EFS4 0溶液对绵羊体内外受精的早期囊胚进行了玻璃化冷冻保存的研究。经卵母细胞体外成熟、体外受精和体外培养获得的早期囊胚 ,分别作如下处理 :( A) 1 0 %EG中预处理 5min后 ,在 EFS4 0平衡 3 0 s(两步法 ) ;( B) EFS4 0中平衡 1 min(一步法 ) ;( C) EFS4 0中平衡 2 min(一步法 )。然后投入液氮中冷冻保存 ,解冻胚胎的继续发育率分别为 80 %、78%和 50 %,A、B2组的结果与对照组 ( 88%)无显著性差异 ( P >0 .0 5)。经超数排卵获得的体内受精早期囊胚用两步法冷冻保存 ,解冻后胚胎发育继续率为 89%,与对照组( 93 %)也无显著性差异 ( P >0 .0 5)     

小鼠胚胎的玻璃化冷冻研究

用不同冷冻载体(玻璃管、塑料管和0.25 mL细管)及不同冷冻方法(程序化冷冻和玻璃化冷冻)对小鼠3.5 d~4 d桑椹胚和囊胚进行冷冻保存,并与不做任何冷冻保存处理直接培养进行对比。结果表明,使用玻璃管、塑料管和0.25 mL细管作为胚胎的承载材料进行玻璃化冷冻,效果差异不显著;采用程序化冷冻与OPS玻璃化冷冻法,对小鼠胚胎进行冷冻保存可以取得较好的结果。从而得出,用不同材质的冷冻载体进行玻璃化冷冻,可以获得与程序化冷冻相同的良好效果。     

胚胎玻璃化冷冻的实验研究

用小鼠胚胎分别在甘油、丙二醇、乙二醇不同浓度比例的10组玻璃化1液中平衡,每组均分室温和低温平衡,共20个组合。研究表明,提高甘油浓度、降低丙二醇及乙二醇浓度,可明显提高玻璃化冷冻后的胚胎体外培养发育率。低温平衡优于室温平衡。15%甘油 5%丙二醇 5%乙二醇的PBS液,是较为理想的第1冷冻液组合。室温平衡的培养发育率为37.5%（18/48）,低温平衡的培养发育率为71.4%（30/42）,差异极显著（P<0.01）;采用2步低温平衡,优选上述第1冷冻液,玻璃化冷冻200枚小鼠胚胎,解冻后培养至膨胀发育率为82.5%（165/200）。     

不同载体冷冻小鼠胚胎的效果比较

为了比较冷冻叶片(Cryoleaf)、冷冻帽(Cryotop)、自制半麦管(hemi-straw)三种冷冻载体的冻存效果,试验采用玻璃化冷冻方法冻存昆明小鼠8-cell胚胎。结果表明,Cryoleaf组、Cryotop组和hemi-straw组胚胎复苏率分别为92.3%、89.2%和86.2%,三组比较差异不显著(P0.05)。Cryoleaf组、Cryotop组及hemi-straw组胚胎的囊胚形成率分别是95.0%、91.4%和80.4%,三组比较差异显著(P0.05);新鲜对照组囊胚形成率为98.5%,与Cryoleaf组、Cryotop组分别比较差异不显著(P0.05),与自制hemi-straw组比较差异显著(P0.05)。结论:采用玻璃化冷冻方法冻存小鼠8-cell期胚胎,使用Cryotop和Cryoleaf作为冷冻载体,可以获得更高的复苏率和囊胚率,优于自制hemi-straw,可以很好地用来冻存人类的胚胎。     

OPS玻璃化冷冻对小鼠四倍体胚胎体外发育的影响

为探究开放式拉长细管(OPS)玻璃化冷冻对四倍体胚胎发育的影响,本实验利用2-细胞胚胎电融合法制备四倍体胚胎,再对四倍体胚胎进行OPS玻璃化冷冻,分别观察记录二倍体胚胎、四倍体胚胎以及冷冻解冻后四倍体胚胎的发育情况。结果表明:2-细胞胚胎电融合效率为96.1%;二倍体胚胎组与电融合后四倍体胚胎组的囊胚率和孵化囊胚率差异不显著;冷冻解冻后四倍体胚胎的囊胚率(100%)与四倍体新鲜组(93.3%)差异不显著,其孵化囊胚率(72.3%)较新鲜组(64.9%)显著增高(P<0.05);四倍体冷冻解冻组的囊胚细胞数(31.96)与新鲜组(32.54)无显著差异;冷冻解冻后的四倍体早期囊胚进行体外培养时其发育速度比对照组更快。可见,冷冻对小鼠四倍体胚胎的囊胚率和囊胚细胞数均无显著影响,但孵化囊胚率显著提高,且OPS玻璃化冷冻后使四倍体胚胎的发育速度更快。     

小鼠卵母细胞和胚胎不同冷冻方法的比较研究

探讨程序化冷冻与玻璃化冷冻对小鼠GV期卵母细胞及二细胞期胚胎的复苏率及其发育潜能的影响。通过小鼠的卵母细胞与早期胚胎的不同冷冻方法的比较,为后续阿旺绵羊的胚胎冷冻保存提供参考。采用程序化冷冻与玻璃化冷冻技术,分别冷冻小鼠GV期卵母细胞及二细胞期胚胎,复苏后培养,比较不同冷冻处理后的复苏率、成熟率与囊胚率。小鼠GV期卵母细胞程序化冷冻复苏率(48.00%±5.29%)显著低于玻璃化冷冻复苏率(65.00%±5.00%),有统计学差异(P=0.0147<0.05);而程序化冷冻后复苏卵母细胞的发育成熟率略高于玻璃化冷冻组,但无统计学意义。小鼠二细胞期胚胎程序化冷冻组复苏率(76.00%±2.00%)显著高于玻璃化冷冻组复苏率(70.00%±2.00%),有统计学差异(P=0.0213<0.05);冷冻后复苏胚胎发育的囊胚率程序化冷冻略低于玻璃化冷冻及对照组,但无统计学意义。     

短期培养对玻璃化冷冻小鼠2-细胞胚胎低渗抵抗力的修复作用

为研究短期培养对玻璃化冷冻小鼠2-细胞胚胎低渗抵抗力的修复作用,对玻璃化冷冻小鼠2-细胞胚胎解冻后进行短期(2～4 h)培养,然后使用20%的低渗PBS液于25℃条件下处理20 min,观察48 h发育率、囊胚率和移植后妊娠率、产仔率.获得93%的48 h发育率和48%的囊胚率,显著高于低渗处理前未培养组(47%和9%)(P＜0.05).证明解冻后的短期培养中可以有效修复玻璃化冷冻对小鼠2-细胞胚胎低渗抵抗力的损伤.     

小鼠4-细胞胚胎OPS法冷冻保存技术

在25℃室温和37℃恒温台条件下，利用玻璃化冷冻溶液EFS30、EFS40、EDFS30或EDFS40，对小鼠4-细胞胚胎进行玻璃化冷冻保存．以解冻后培养72h的囊胚发育率为其体外发育能力的考核指标，同时对解冻后培养1～3h的胚胎进行移植以判定其体内发育潜力。开放式拉长塑料细管（OPS）二步法冷冻保存，即胚胎首先移入预处理液（10％EG或10％EG＋10％DMSO）中平衡30s，再移入玻璃化溶液中洗涤后吸入OPS管中，分别经35、30或25s后直接投入液氮中冷冻保存。一步法冷冻保存则无需预处理液处理。结果表明，小鼠胚胎4-细胞一步法和二步法冷冻后囊胚最高发育率分别为87．7％和88.6％，与对照组（93.0％）差异不显著（P〉0．05）。利用最佳冷冻组获得的143枚胚胎移植于12只假妊娠50～60h的受体母鼠，结果有4只妊娠产仔17只，妊娠产仔率为42．5％（17／40），与对照组59．4％（19／32）差并不显著（P〉0.05）。     

和牛体外受精胚胎玻璃化冷冻与解冻孵化试验

用添加5％犊牛血清(FCS)的TCM-199进行卵母细胞成熟,BO液进行体外受精后,在5％犊牛血清的CR1aa液进行体外培养获得和牛体外受精胚胎。经玻璃化冷冻保存后解冻,进行孵化试验,解冻后透明带完整率为100％,解冻后存活率为90％。用含20％和5％犊牛血清(FCS)的TCM-199培养孵化,经24h、48h存活率分别为77．8％、74．1％;51．9％、49．1％。两者差异不显著。     

小鼠2-细胞胚胎细管法和OPS法玻璃化冷冻保存技术的研究

本试验在室温 (2 0℃和 2 5℃ )条件下 ,利用不同浓度的玻璃化溶液 (EFS和EDFS) ,对小鼠 2 细胞胚胎进行细管法和OPS法玻璃化冷冻保存。在 2 0℃室温条件下 ,用EFS4 0平衡 1min细管一步法冷冻 ,解冻后囊胚发育率仅为35 .0 % ,和新鲜 2 细胞体外培养的对照组 (6 5 .0 % )的差异极显著 (P <0 .0 1)。当 2 细胞胚胎在 10 %EG +10 %D溶液中预处理 5min ,再移入EDFS中平衡 30s二步法冷冻保存 ,解冻后囊胚发育率达 4 7.8%～ 4 8.8% ;当室温升至2 5℃时 ,二步法冷冻保存后 2 细胞的囊胚发育率达到 5 2 .2 % ,与对照组无显著差异 (P >0 .0 5 )。改用OPS二步法EFS30冷冻组保存后的 2 细胞胚胎的囊胚发育率高达 6 2 .2 % ,为试验中的最佳组。用最佳细管法和OPS法冷冻组解冻后培养至囊胚移植给受体母鼠均获得产仔     

小鼠胚胎常规冷冻和玻璃化冷冻效果的比较

将小鼠胚胎分别用常规冷冻法和OPS法冷冻，结果用常规冷冻法和OPS法冷冻小鼠桑葚胚，解冻后培养24h胚胎的发育率分别为87．32％、86．67％（P〉0．05）；用两种方法冷冻小鼠囊胚的结果分别为81．43％、83．56％（P〉0．05），结果表明用OPS法冷冻保存小鼠胚胎能达到用常规冷冻法的效果。     

小鼠胚胎常规冷冻和玻璃化冷冻效果的比较

将小鼠胚胎分别用常规冷冻法和OPS法冷冻,结果用常规冷冻法和OPS法冷冻 小鼠桑葚胚,解冻后培养24 h胚胎的发育率分别为87．32％、86．67％(P>0．05);用两种方 法冷冻小鼠囊胚的结果分别为81．43％、83．56％(P>0．05),结果表明用OPS法冷冻保存小 鼠胚胎能达到用常规冷冻法的效果。     

ε-聚赖氨酸在牛胚胎玻璃化冷冻中的保护作用

通过研究ε-聚赖氨酸(ε-PL)对牛胚胎玻璃化冷冻的影响,探讨ε-PL在牛胚胎玻璃化冷冻中的保护作用,为优化牛胚胎玻璃化冷冻技术提供依据。单独以ε-PL作为冷冻保护剂,其质量浓度为20、35、50g/L,分别进行胚胎冷冻,结果均不能取得成活胚胎,说明ε-PL不能单独作为冷冻保护剂使用。在传统玻璃化冷冻剂中分别添加质量浓度为10、20、30g/L的ε-PL进行胚胎冷冻,结果发现添加ε-PL之后的冷冻保护液具有更好的保护效果,且ε-PL质量浓度为20g/L时效果最好,囊胚解冻孵化率可达42.37%。进一步探索了用该冷冻保护剂,缓冲时间分别为5、7.5、10min进行胚胎冷冻的效果,结果发现缓冲时间为7.5 min取得最高孵化率,孵化率为46.58%。结果表明,ε-PL对牛胚胎玻璃化冷冻具有一定的保护作用,且适当延长缓冲时间可取得更好的冷冻效果。     

小鼠8-细胞期胚胎和囊胚制备嵌合体的比较

嵌合体是指由2个或2个以上具有全能性或多能性的细胞系发育而成的复合体。随着发育生物学理论和胚胎干细胞技术的发展,将胚胎干细胞导入小鼠植入前胚胎制备嵌合体逐渐成为研究细胞分化机制的有效工具[1]。经基因修饰胚胎干细胞来源的可遗传的嵌合个体,也成为基因功能研究的重要实     

小鼠胚胎冷冻后线粒体损伤的研究

为了研究玻璃化冷冻后小鼠胚胎线粒体的损伤,试验将V1冷冻的囊胚和V2冷冻的扩张囊胚解冻后在体外进行培养,分别在培养0,4,8,12,18,24 h后观察线粒体的损伤情况.结果表明:无论是用V1还是用V2对胚胎进行玻璃化冷冻,线粒体的正常聚集率随着培养时间的延长均呈现出下降的趋势;V1冷冻的囊胚在培养0,4 h后的线粒体正常聚集率极显著高于培养8,12,18,24 h后的正常聚集率(P<0.01),V2冷冻的扩张囊胚在培养0 h后线粒体的正常聚集率极显著高于培养4,8,12,18,24 h后的正常聚集率(P<0.01).     

冷冻后小鼠卵母细胞的透明带和质膜对体外受精的影响

以冷冻保存后的小鼠卵母细胞为实验材料,研究其膜对体外受精效果的影响。在室温(25±0.5)℃条件下,以10%乙二醇(EG)+10%二甲基亚砜(DMSO)为预处理液,EDFS30为玻璃化溶液。将卵母细胞于10%EG+10%DMSO溶液中预处理30s,然后再移入EDFS30中处理25s,以开放式拉长细管(OPS)为承载器投入液氮中,即两步法玻璃化冷冻保存。结果表明:冷冻卵母细胞受精后的卵裂率(46.67%)显著低于新鲜组的(86.06%)(P<0.05)。冷冻卵母细胞去透明带后质膜上的平均精子结合数(10.70)与对照组(10.81)无显著性差异(P>0.05),形成雌雄原核数也无显著性差异(2.49vs.2.59)(P>0.05)。冷冻卵母细胞透明带打孔后,其体外受精后卵裂率与新鲜组差异不显著(84.73%vs.91.19%)(P>0.05)。因此玻璃化冷冻保存小鼠卵母细胞透明带的变化是影响体外受精效果的主要因素之一。     

OPS法与细管法冷冻小鼠胚胎的研究

用0.25 mL细管和OPS(open pu lled straw)管,对小鼠囊胚进行玻璃化冷冻,以比较2种方法的冷冻效果。结果表明,冷冻-解冻胚胎体外培养24 h后,2组的发育率分别为63.3%(31/49)和71.4%(55/77);OPS法在冻胚发育率上稍优于细管法,但无统计学差异(P>0.05);2组冷冻胚胎的培养发育率均显著低于鲜胚培养组94.3%的发育率(P<0.05)。采用OPS法冷冻小鼠8-细胞胚,其冻后培养发育率为55.6%,似乎要低于囊胚冷冻后的培养发育率,但差异不显著(P>0.05)。     

去脂对猪卵母细胞和胚胎玻璃化冷冻的影响

卵母细胞和胚胎冷冻保存技术在动物种质资源保存、濒危动物保护等方面具有独特的作用。本文综述了猪卵母细胞和胚胎的玻璃化冷冻及去脂技术,以期为后续研究提供参考,提高冷冻成功率。     

玻璃化冷冻对小鼠GV期卵母细胞发育能力的影响

试验首次采用OPS法玻璃化冷冻小鼠GV期卵母细胞(不带卵丘细胞,下同),同时尝试用EDFS30对小鼠卵巢进行细管法玻璃化冷冻,以研究GV期卵母细胞冷冻后的发育潜力。首先,利用MEM培养和MEM-腔前卵泡培养新鲜GV期卵母细胞,并把较好的培养方式用于冷冻后培养试验。2种培养方式培养24h后新鲜GV期卵母细胞成熟率无显著性差异;OPS法冷冻的GV期卵母细胞解冻后成熟率及体外受精后卵裂率与对照组差异不显著(P>0.05)。细管法冷冻卵巢组织的GV期卵母细胞成熟率极显著低于对照组(P<0.01),其受精后未获得受精卵。结果表明:OPS法可有效地冷冻保存小鼠GV期卵母细胞,而细管法冷冻小鼠卵巢对GV期卵母细胞损伤较大。     

黄芩苷、川芎嗪对小鼠体外培养胚胎冷冻-解冻及移植效果的研究

将中药有效成分黄芩苷(Baicalin,Bai)和川芎嗪(Ligustrazine,Lig)添加到小鼠2-细胞胚胎培养液中进行体外培养,比较其体外发育能力,并将体外发育的桑椹胚、囊胚进行2种程序常规冷冻.解冻后形态正常的桑椹胚、囊胚分别培养8～14 h、6～8 h,比较各组胚胎的冷冻-解冻发育效果及冷冻胚胎移植妊娠率和产仔率等.结果各试验组胚胎孵化率,Bai组(80.6%)、Lig组(78.3%)极显著高于对照组(51.8%)(P＜0.01).孵化胚胎细胞计数结果显示, Bai组(81.9±6.2)和Lig组(83.9±7.7)与对照组(77.4±5.6)差异极显著(P＜0.01);程序1和2的桑椹胚解冻囊胚发育率,以Bai、Lig组显著高于对照组;其囊胚解冻存活率,2个试验组均好于对照组.受体妊娠率、产仔率以及初生仔鼠、离窝仔鼠平均体重、离窝成活率等指标,各组间均无显著差异(P＞0.05),但以中药有效成分各组别均好于对照组.结果表明中药有效成分Bai和Lig能显著地提高小鼠 2-细胞胚胎体外发育能力,并有利于提高冷冻-解冻后移植胚胎的发育潜力.