应用基因工程创造抗黄矮病毒转基因小麦新种质

应用花粉管通道法和基因枪法将大麦黄矮病毒ＧＰＶ株系外壳蛋白基因导入小麦栽培品种，获得了抗大麦黄矮病毒ＧＰＶ株系的转基因小麦株系（文献检索证明世界上无任何其它抗病毒转基因小麦报道）。转基因植株经ＰＣＲ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ检测，证明ＣＰ基因可稳定遗传到Ｔ３代；经Ｗｅｓｔｅｒｎ测定，证明ＣＰ基因在转基因小麦中已经得到表达；经带毒蚜温室和田间人工接种试验，获得了一些抗病性明显的后代，并得到了ＥＬＩＳＡ验证     

应用基因枪法获得抗大麦黄矮病毒转基因小麦

 以我国特有的大麦黄矮病毒GPV株系的外壳蛋白(CP)基因为材料,设计合成了分别含有Act启动子或Emu启动子的植物表达载体pPPI2、pPPI3和pPPI5。采用基因枪法分别转化小麦幼胚和愈伤组织。诱导成苗后进行PCR检测,T₀代阳性率为18%。对转基因苗的后代进行进一步检测,部分转基因苗阳性株至T₃代PCR检测阳性率为100%,PCR结果CP探针杂交呈阳性反应,序列测定结果与GPV CP基因序列一致,表明GPV CP基因已整合到小麦基因组中。室内抗病性鉴定结果,虽然转基因植株全部发病,但对大麦黄矮病毒GPV株系具有一定的延迟发病作用。     

大麦黄矮病毒GPV株系ORF4基因在大肠杆菌中的表达及特异抗血清的制备

 根据已报道的大麦黄矮病毒GPV株系(BYDV-GPV)相关基因序列设计合成引物,利用RT-PCR方法获得ORF4基因,并将其克隆到原核表达载体pET-5a中。经IPTG诱导、SDS-PAGE分析,结果表明:ORF4基因在大肠杆菌BL21(DE3) pLysS中获得了高效表达,分子量为17 kDa。以回收的表达产物为抗原免疫家兔,制备了BYDV-GPV 17kDa蛋白的特异性抗血清。Western blot检测结果,制备的抗血清可用于检测BYDV-GPV侵染后在燕麦体内表达的17 kDa蛋白。     

兼抗麦长管蚜和大麦黄矮病毒的小麦种质田间鉴定筛选

为鉴定筛选兼抗麦长管蚜和大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf virus, BYDV)的小麦种质,采用自然感蚜/感病系数法,对36个外引和远缘杂交选育的小麦种质材料进行了2年的田间鉴定,并分析了感虫性与感病性的相关关系。结果表明,2年中均兼抗麦长管蚜和BYDV的种质仅有KOKIPPCAS、KOK、Amigo-3和PI137739共4个材料,占总鉴定材料的11.11%;对二者均敏感的有98-10-35q-9、186Tm39、Tam200e12-14a、Tam200(27)7、小偃22、西农1376和小偃6号共7个材料,占19.44%。其它材料仅抗虫或仅抗病,或仅在一年中表现抗病或抗虫,如材料98-10-30和98-10-35a8抗麦长管蚜,但对BYDV敏感;材料Tam200(13)G和PIG23(2)C感蚜,但对BYDV有抑制作用。BYDV发生普遍率(发病株率)和严重度(病情指数)与有蚜株率显著相关,严重度还与感蚜指数显著相关,但感病植株的病级均值与有蚜株率无显著相关性。表明自然界长期的进化和选择使许多抗病虫基因得以保存下来,但较多抗性基因只在抗病或抗虫的某一方面表现有效,需给予更多关注。     

应用农杆菌介导法获得转大麦黄矮病毒GPV株系复制酶基因ORF1的小麦植株

 以生产用4种基因型小麦为材料,利用农杆菌介导法将大麦黄矮病毒GPV株系复制酶基因ORF1分别转化愈龄40d的幼胚愈伤组织,经过G418筛选后,共再生出15株抗性植株,拓宽了小麦农杆菌转化的受体基因型。PCR及Southern杂交分析证实大麦黄矮病毒复制酶基因ORF1已经整合到小麦基因组中,共获得14株转基因植株。抗病性初步检测结果显示,转基因植株对GPV株系具有抗性。研究结果还表明,对于不同的基因型小麦进行转化时,需选择适合本基因型的菌株。     

河北省春小麦黄矮病的主要介体和病毒株系研究

１９９２￣１９９５年的研究结果表明,河北省春麦区麦长管蚜是传播小麦黄矮病毒的优势种群,占张家口坝上、坝下及承德麦蚜发生总量的９４．７５％￣１００％。有翅蚜迁入麦田的时期和数量是影响春麦黄矮病发生程度的重要因素。张家口坝上小麦黄矮病毒株系以麦二叉蚜、麦长管蚜株系（ＧＡＶ）占绝对优势,张家口坝下及承德地区的株系种类较为复杂,除以ＧＡＶ株系为主外,存在禾缢管蚜、麦长管蚜、麦二叉蚜株系（ＰＡＧＶ）及麦二叉     

水稻感染小麦黄矮病毒(BYDV)初步研究

 小麦黄矮病是我国北方小麦的主要病毒病。寄主范围较广,人工接种可侵染水稻,近几年发现大田水稻发生类似于小麦黄矮病的症状特征。     

小麦黄矮病毒4种株系对小麦7个品种的影响

筛选抗耐小麦黄矮病的种质资源是选育抗耐小麦优良品种的前提。小麦黄矮病的GPV株系由麦二叉蚜和禾缢管蚜传播,是我国黄矮病流行区的主流株系,它是我国特有的株系(周广和等,1987)。     

大麦黄矮病毒PAV中国分离物外壳蛋白基因的克隆及同源性分析

 大麦黄矮病毒PAV株系由麦长管蚜和禾谷缢管蚜传毒。本研究通过RT-PCR、克隆和序列测定后,确认所得到的我国小麦PAV分离物的外壳蛋白基因片段由600个核苷酸组成,编码199个氨基酸。序列同源性比较结果显示,与BYDV的其它株系典型分离物的外壳蛋白基因同源性最高为74.5%,而与国外发表的PAV 8个分离物的CP基因核苷酸同源性为81%左右,且同源性比较的分值也较其它株系高。氨基酸序列的比较中,仅在46到60位氨基酸差别较大。     

感染大麦黄矮病毒的小麦中vsiRNA特征分析

 RNA沉默是植物中一种保守的抗病毒机制,其以大量病毒来源的小干扰RNA(virus-derived small interfering RNAs,vsiRNAs)的产生为标志,病毒在侵染寄主过程中可通过vsiRNAs靶向寄主转录本以对抗这种防御机制。BYDV-GAV引起的小麦黄矮病导致小麦黄化和矮化症状,对小麦生产构成严重威胁。通过深度测序技术,分析了感染BYDV-GAV的感病小麦品种‘小偃6号’中vsiRNAs的特征,共得到11 384个vsiRNAs,并预测到37 784个寄主靶基因。发现来源于BYDV-GAV基因组的正义和反义链的vsiRNAs的数量分布大致相等,在5’末端具有A和C偏好性,长度主要在21nt~22nt。靶基因的功能分析表明这些靶基因参与了广泛的生物学功能,尤其是在寄主-病原物互作中占的比重最大。选取25个参与寄主-病原互作的抗性相关基因进行定量验证,发现接种BYDV-GAV后有15个明显下调,6个上调,4个微弱下调,表明测序结果和靶基因预测可靠。推测BYDV-GAV可以通过vsiRNAs干扰寄主抗性基因表达和信号转导,从而实现对感病寄主的侵染。研究结果对揭示BYDV-GAV与小麦互作的分子机制具有重要意义。     

感染大麦黄矮病毒的小麦中vsiRNA特征分析

 RNA沉默是植物中一种保守的抗病毒机制,其以大量病毒来源的小干扰RNA(virus-derived small interfering RNAs,vsiRNAs)的产生为标志,病毒在侵染寄主过程中可通过vsiRNAs靶向寄主转录本以对抗这种防御机制。BYDV-GAV引起的小麦黄矮病导致小麦黄化和矮化症状,对小麦生产构成严重威胁。通过深度测序技术,分析了感染BYDV-GAV的感病小麦品种‘小偃6号’中vsiRNAs的特征,共得到11 384个vsiRNAs,并预测到37 784个寄主靶基因。发现来源于BYDV-GAV基因组的正义和反义链的vsiRNAs的数量分布大致相等,在5’末端具有A和C偏好性,长度主要在21nt~22nt。靶基因的功能分析表明这些靶基因参与了广泛的生物学功能,尤其是在寄主-病原物互作中占的比重最大。选取25个参与寄主-病原互作的抗性相关基因进行定量验证,发现接种BYDV-GAV后有15个明显下调,6个上调,4个微弱下调,表明测序结果和靶基因预测可靠。推测BYDV-GAV可以通过vsiRNAs干扰寄主抗性基因表达和信号转导,从而实现对感病寄主的侵染。研究结果对揭示BYDV-GAV与小麦互作的分子机制具有重要意义。     

大麦黄矮病毒PAV血清型免疫电镜检测

用免疫电镜技术对大麦黄矮病毒PAV 血清型进行了检测。病毒粗提液经过抗体IgG 的诱捕、修饰后,在电镜下观察到病毒粒体。病毒在抗体的诱捕下,产生了明显的聚集效应。单个病毒粒体周围有抗体环,病毒二聚集体之间有抗体桥存在。病毒粒体表面结构清晰,而且能够清楚地看到抗体分子与病毒表面突起的结合     

花粉管通道法介导的抗大麦黄矮病毒转基因小麦研究

构建了大麦黄矮病毒GPV株系串联结构复制酶基因植物表达载体pPPI29,通过花粉管通道法转化了CA8686小麦,对T₀代种子进行了分子检测,获得6株转基因小麦,转化率达到0.45%;对获得的T0代转基因小麦进行了田间抗病性鉴定,结果表明4株转基因小麦对GPV株系表现为高抗,可以推迟发病23 d。     

大麦黄矮病毒GPV株系外壳蛋白基因在E.coli中的表达及抗血清制备

 病毒外壳蛋白基因经适当引物逆转录成cDNA后,应用聚合酶链反应(PCR)扩增,得到大麦黄矮病毒(BYDV)GPV株系的外壳蛋白(CP)基因。将此基因克隆至表达载体pMal,转化E.coli TB1,诱导表达了携带外壳蛋白的融合蛋白,表达量约占菌体总蛋白量的7%,此融合蛋白的分子量约为60kD,经亲和层析纯化后免疫家兔,获得BYDV-GPVCP的抗血清。     

大麦黄矮病毒-GAV在燕麦植株体内运动规律的初步研究

 利用RT-PCR方法研究了大麦黄矮病毒-GAV在燕麦植株内的移动规律。先将介体麦二叉蚜(Schizaphis graminum)在BYDV-GAV新鲜病叶上饲毒,再将获毒蚜虫放置到二叶期的健康燕麦植株接种48h,随后分期提取接种植株的第1~6片叶和根组织的总RNA,利用特异引物扩增BYDV-GAV的外壳蛋白(CP)基因以检测病毒在燕麦植株内的复制和移动。结果表明,在接种5d后,接种叶片(第2片叶)呈现阳性,接种7d后,植株新生的第4片叶被侵染,接种9d后,部分的第3片叶呈现阳性,至接种16d,几乎所有的叶片均呈现阳性。仅在接种的第5、7和9d收集的根组织呈现阳性,而所有的第1片叶均为阴性,可能是由于这些组织内病毒含量太低所致。本研究初步揭示了BYDV-GAV长距离运动的规律并且发现该病毒在燕麦根部从接种到系统发病都没有进行大量增殖,为今后进一步研究病毒运动机制选取适当的植物材料提供了基本信息。     

应用农杆菌介导法获得转大麦黄矮病毒GPV株系复制酶基因ORF2小麦植株

以生产用5种基因型小麦为材料,利用农杆菌介导法将大麦黄矮病毒GPV株系复制酶基因ORF2转化愈龄40d的幼胚愈伤组织,经过G418筛选后,共再生出9株抗性植株,拓宽了小麦农杆菌转化的受体基因型。PCR及Southern杂交分析证实大麦黄矮病毒复制酶基因ORF2已经整合到小麦基因组中。初步抗病性检测结果显示转基因植株对GPV株系具有抗性。研究结果还表明,受体基因型、外植体的生理状态对农杆菌侵染起着至关重要的作用。     

大麦黄矮病毒GPV与GAV株系间异源装配现象的初步研究

 以我国麦区的大麦黄矮病毒GPV、GAV株系为材料,利用它们的蚜传特异性,将由禾谷缢管蚜传播的GPV和由麦长管蚜传播的GAV混合侵染到岸黑燕麦上,并进行继代传毒。混合侵染后代蚜传表现型的变化初步表明存在异源装配现象,且表现型混合发生的比例较高。用DAS-ELISA和RT-PCR法对混合侵染后代进行了测定,进一步证明了异源包装现象的存在。部分基因的核苷酸序列分析初步显示所测定的混合侵染后代中没有发生基因重组。     

6种病毒抑制剂对西藏青稞上大麦黄矮病的防治效果

通过田间小区试验,开展了6种病毒抑制剂对西藏青稞上大麦黄矮病防治效果的研究.采用带毒蚜虫人工接种法,于青稞起身拔节期每株接种10～15头带毒麦长管蚜,7 d后灭蚜,灭蚜后3d喷施病毒抑制剂,在成株期出现黄矮病症状后调查病株率、病情指数、防治效果,以及长势和产量.结果表明,6种病毒抑制剂对青稞上大麦黄矮病有不同程度的防治...     

大麦黄矮病毒PAV青海分离物运动蛋白抗血清制备及其与同属BYDVs的血清学关系

 大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf viruses, BYDVs)属于黄症病毒科,主要以蚜虫为介体进行传播,引发多种作物减产或绝收。本文将BYDV-PAV青海分离物的运动蛋白(MP)克隆到原核表达载体pDB-MBP-His上,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),在IPTG诱导下表达蛋白分子量约为61 kDa的融合蛋白。将纯化后的蛋白作为抗原免疫‘新西兰’大白兔制备抗血清,Western blot检测本生烟瞬时表达带标签的MP蛋白,结果显示该抗血清效价为1∶32 000,灵敏度达1∶256,且该抗血清可与相差34个氨基酸的PAV015株系以及隶属于黄症病毒属其他的BYDVs(PAS、MAV、KerⅡ和KerⅢ)MP均能发生强烈的血清学反应,具有血清学相关性。本研究制备的大麦黄矮病毒PAV青海分离物运动蛋白多克隆抗体为探索BYDV-PAV运动蛋白的功能以及作用机制打下了基础。     

晋南冬麦区大麦黄矮病毒流行株系监测及防治策略探讨

连续5年(1996～2000年)采集晋南冬麦区小麦黄矮病标样,采用生物学和血清学(酶联免疫吸附法)相结合的诊断方法对该地区的大麦黄矮病毒流行株系进行了鉴别。结果表明,该小麦黄矮病流行区近五年以GAV株系为主流株系,兼有少量GPV、PAV和混合株系存在。同时对小麦抗黄矮病新品种“临抗1号”进行了GPV和GAV两种株系的抗性测定,明确了该品种兼抗GPV和GAV两种株系。根据小麦黄矮病发生现状,提出了一套以选育推广抗耐病品种为主,以药剂防治为辅的综合防治措施。以期为当地小麦生产服务。