香蕉分生小球体途径胚性细胞悬浮系的建立

 以7 个香蕉品种未成熟雄花为外植体均获得了分生小球体(meristematic globules) 。分生小球体的诱导率因基因组型和品种而异, 为15 %～81 % , 分生小球体的特点及开始出现的时间也受基因组型和品种的影响。以分生小球体为起始材料, 建立了‘广东2 号’、‘华农7 号’及‘河口龙牙’3 个品种的胚性细胞悬浮系, 并通过体胚发生途径获得了前两个品种的再生植株。     

番木瓜均质胚性细胞悬浮系的建立和高效植株再生

【目的】提高番木瓜体细胞胚发生的同步性及其植株再生率,为番木瓜大量快繁、细胞工程和分子育种技术研发提供技术基础。【方法】以紫晖110～120 d果实的未成熟合子胚为外植体,经胚性愈伤组织诱导、液体悬浮培养和体细胞胚发生过程,建立均质胚性细胞悬浮系和高效植株再生技术体系,重点比较了不同质量浓度2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid,2,4-D)对胚性愈伤组织诱导、不同质量浓度6-苄基氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine,6-BA)+萘乙酸(1-naphthlcetic acid,NAA)组合和活性炭(activated carbon,AC)对子叶期体细胞胚萌发与生根的影响。【结果】4 mg·L^-12,4-D可诱导62.86%未成熟合子胚形成胚性愈伤组织。经5个继代周期的筛选培养,可建立由单细胞和小细胞团组成的均质胚性细胞悬浮系。采用液体培养方式能诱导大量球形胚的形成,被转移至含5 g·L^-1AC的半固定培养基成熟培养30 d后,可获得大量子叶期体细胞胚。在含0.4 mg·L^-1<...     

利用未成熟种子建立野生阿宽蕉胚性细胞悬浮系和植株再生的研究

以纵切的野生阿宽蕉60d龄未成熟种子为外植体,在MI1愈伤组织诱导培养基(MS大量和微量元素及铁盐+MorelandWetmore维生素+0.1mmol/LKH2PO4+87mmol/L蔗糖+4.5μmol/L2,4-D+1g/LGelrite)中培养60d后开始出现浅黄色松散的胚性愈伤组织,150d后愈伤组织诱导率为(15.11±1.95)%。该类愈伤组织被转移到含18μmol/L2,4-D的MI2培养基中继代60d后,可获得状态均一的理想的胚性愈伤组织。胚性愈伤组织悬浮培养后,通过2个月的筛选和继代培养,可得到均质的胚性细胞悬浮系。理想的胚性愈伤组织在体细胞胚诱导培养基中培养10d后可见到白色半透明体细胞胚的发生,体细胞胚诱导率为7.70×105个/gFW。成熟体细胞胚的萌发率为(33.33±3.37)%,植株再生率为(20.83±1.68)%。     

芹菜胚性细胞悬浮系原生质体分离及再生植株

利用芹菜胚性细胞悬浮系成功分离得到大量原生质体, 获得芹菜大量原生质体的最佳反应体系为: 酶液组成为3.0%纤维素酶Onozuka R210、1.0%离析酶R210、11%甘露醇、0.5% CaCl₂ ·2H₂O和0.1% MES; 摇床转速为80 r/min, 温度(25 ±2) ℃, 酶解时间5～6 h; 原生质体产量为25.00 ×10⁶ /g, 原生质体活力83.41%。原生质体浅层培养, 培养基为1 /2 MS + 1 mg/L 2, 4-D + 0.5 mg/L KT + 11%甘露醇+ 500 mg/L水解络蛋白, 两天后, 重新再生细胞壁之后进行第1次分裂, 逐步降低渗透压至甘露醇3% ,大约30 d形成小细胞团。小愈伤组织经增殖培养后在1 /2MS + 500 mg/L CH + 0.25 mg/L KT固体分化培养基诱导出不定芽, 30 d后再转入MS基本培养基, 获得完整的再生植株。     

四川‘竹根姜’胚性细胞悬浮系的建立与植株再生

 选用四川省地方品种‘竹根姜’的茎尖组织建立了体细胞胚性细胞悬浮系, 并通过悬浮培养获得了姜再生植株。结果表明悬浮细胞干质量受pH影响。接种量和AgNO₃ 对悬浮细胞的生长都有影响:最佳接种量为1.0% , 最适AgNO₃浓度为6.0 mg·L ^{- 1}。胚性细胞悬浮系增殖后, 接种到前期筛选的成熟分化培养基上获得了再生植株。     

香蕉茎尖的玻璃化法超低温保存及其植株再生

 以香蕉(Musa spp. ) 为试材, 对其离体培养茎尖玻璃化法超低温保存影响因素进行研究。结果表明, 不定芽在MS + 3.0～5.0 mg/L 6-BA + 0.1 mg/L NAA的培养基上分化较好。香蕉茎尖超低温保存较佳体系是: 2.0～3.0 cm的茎尖在含0.4 mol/L蔗糖培养基上预培养2 d, 剥取带1～2个叶原基的茎尖(长1.0～1.5 mm) , 室温(25℃) 下装载液(MS + 2 mol/L甘油+ 0.4 mol/L蔗糖) 装载20～30 min, 然后用玻璃化溶液( PVS2 ) 于0℃下处理40 min, 换1次PVS2后迅速投入液氮。保存至少1 h后, 在40℃水浴中化冻90 s, 用1.2 mol/L蔗糖培养液洗涤2次, 每次10 min, 然后转入含0.3 mol /L蔗糖的MS培养基上,暗培养10～15 h后转移到含0.5 mg/L 62BA的MS培养基中, 暗培养1周后转移到正常光下, 3个香蕉品种(巴西蕉、广东香蕉2 号、广东粉蕉1 号) 的成活率分别为75.9%、40.0%和69.6% , 再生率分别为63.4%、35.0%和63.4%。再生植株生长和分化正常, 生根后可移栽成活。     

多花蔷薇胚性细胞悬浮系原生质体分离及再生植株

利用多花蔷薇‘无刺3号’假珠芽诱导的胚性愈伤细胞悬浮系分离得到原生质体,并培养获得再生植株。酶种类和浓度, 酶解时间及悬浮细胞继代时间对原生质体分离有重要影响,最佳酶液组成是2.0%纤维素酶,0.5%离析酶,5.0 mmol·L^-1 MES, 0.5 mol·L^-1甘露醇,0.5% CaCl₂·2H₂O。采用继代3 d的悬浮细胞系,酶解10 h,原生质体产量达到26.67×10⁶g^-1,原生质体活力为92.21%。采用液体浅层培养,肌醇比蔗糖更有利于纯化后的原生质体分裂和生长。愈伤组织形成增殖培养基为1/2MS + 2,4-D 1.0 mg·L^-1+ EBR 0.2 mg·L^-1 + 10 g·L^-1 Ficoll + 500 mg·L^-1谷氨酰胺 + 20 mg·L^-1甘氨酸 + 20 mg·L^-1天冬氨酸,分化培养基为1/2MS + 10 mg·L^-1 TDZ + 500 mg·L^-1谷氨酰胺+ 20 mg·L^-1甘氨酸+ 20 mg·L^-1天冬氨酸,后转入1/2MS培养基上获得完整植株。     

五叶草莓超低温保存及遗传稳定性分析

【目的】为了找出野生种质资源五叶草莓(Fragaria pentapylla)的超低温保存方法和分析超低温保存后五叶草莓的遗传信息稳定性,【方法】运用玻璃化法对五叶草莓离体茎尖超低温保存技术进行了研究,并采用AFLP和MSAP技术对其遗传稳定性作了探讨。【结果】结果表明,不同的低温锻炼时间、预培养时间、预处理时间、玻璃化溶液(PVS2)处理时间和液氮保存时间对五叶草莓超低温保存后成活率的影响各不相同,经优化后,低温锻炼3周,预培养3 d,预处理30 min,PVS2处理60 min时,超低温保存的最高成活率可达79.7%,液氮处理时间对成活率影响不明显;运用AFLP技术对超低温后成活生长120 d的材料及对照材料基因组DNA进行了分析,超低温前后带型一致,未发现明显差异片段;进一步用MSAP技术分析了超低温保存后成活的材料和对照材料DNA甲基化水平差异,结果表明超低温保存后五叶草莓DNA甲基化与去甲基化分别为5.70%和12.43%。【结论】玻璃化法超低温保存技术可以有效的保存五叶草莓种质资源,超低保存前后的五叶草莓基因组DNA没有发生多态性变化,但DNA甲基化水平降低。     

树莓茎尖玻璃化法超低温保存及植株恢复培养研究

对离体树莓茎尖的玻璃化法超低温保存进行了研究。结果表明,离体树莓茎尖超低温保存程序为在含0.8mol/L蔗糖的固体MS培养基预培养4天,低温驯化21天,再经玻璃化液PVS2处理60分钟后浸入液态氮。保存结束,茎尖在40℃水浴5分钟解冻,存活率达80%,植株再生率达75%。     

银条茎尖玻璃化法超低温保存及其植株再生

 为长期稳定保存银条种质, 建立了玻璃化法超低温保存其茎尖的技术体系。选择继代4次的 银条无菌壮苗, 5 ℃低温驯化14 d; 剥取5 mm的茎尖, 在含有0.5 mol·L ^{- 1}蔗糖的MS (无Ca^{2 +} ) 液体培养基预培养1 d; 25 ℃条件下经改良MS + 2PVS₂装载20 min; 在- 20 ℃, 95%乙醇浴中以PVS₂脱水处理4h; 更换新鲜的PVS₃后投入液氮, 保存24 h后取出冷冻管在40 ℃水浴中化冻1 min; 以含有1.2 mol·L ^{- 1}蔗糖的改良MS (无Ca^{2 +} ) 溶液洗涤2 次, 每次10 min; 冻存后的茎尖相对存活率超过70%。将冻存后的茎尖转接到再生培养基上, 暗培养20 d后转入正常光照条件下培养, 存活率达63.7%; 继续培养得到正常分化和生长的再生植株, 生根后可移栽成活。     

白姜花胚性愈伤组织的诱导与植株再生体系的建立

将白姜花（Hedychium coronarium）未成熟花丝接种在MS + 4 mg ? L^-1 2,4-D + 4 mg ? L^-1 NAA + 1 mg ? L^-1 6-BA的培养基上,经过180 d的培养,诱导出3种愈伤组织：Ⅰ,浅黄色松散易碎;Ⅱ,白色疏松半透明水渍状;Ⅲ,黄色致密颗粒状。对愈伤组织继代培养基中的2,4-D、NAA和6-BA浓度进行优化,结果表明培养基中含有1 mg ? L^-1 2,4-D、0.25 mg ? L^-1 NAA、0.25 mg ? L^-1 6-BA时可获得胚性状态良好的愈伤组织。胚性愈伤组织在MS无机盐 + 0.25 mg ? L^-1 NAA + 0.5 mg ? L^-1 TDZ + 维生素B₅ + 100 mg ? L^-1谷氨酰胺 + 230 mg ? L^-1脯氨酸 + 100 mg ? L^-1麦芽提取物 + 45 g ? L^-1蔗糖的体胚诱导培养基中培养20 d后,转移到MS基本培养基上培养30 d,1 g胚性愈伤组织可获得50 ~ 60个体胚。成熟体胚在MS + 0.2 mg ? L^-1 IAA + 0. 5 mg ? L^-1 6-BA的萌发培养基上培养20 d时,体胚萌发率为85%。萌发的体胚转移到1/2 MS + 1 g ? L^-1活性炭的成苗培养基中可发育成正常植株,植株室外栽培成活率达90%。对100株再生植株的染色体数进行分析,发现3株三倍体（2n = 3x = 51）、6株四倍体（2n = 4x = 68）和2株六倍体（2n = 6x = 102）。     

马铃薯茎尖小滴玻璃化法超低温保存及其再生植株的遗传稳定性

以马铃薯试管苗为试材,对其茎尖小滴玻璃化法超低温保存的影响因素进行了研究,并对再生植株进行了遗传稳定性检测。结果表明,马铃薯茎尖依次在含有0.3 mol · L-1和0.5 mol · L-1蔗糖的液体MS培养基中预培养各1 d后,在0 ℃下PVS2处理30 min,转到铝箔条上PVS2小滴上（约15 μL）,将粘有茎尖的铝箔条在液氮里蘸一下,然后直接装入盛满液氮的冷冻管中,投入液氮至少保持1 h。室温下用含有1.2 mol · L-1蔗糖的MS液体培养基解冻并洗涤30 min后,接种到MS + 0.5 mg · L-1 Zeatin + 0.1 mg · L-1 NAA＋1.0 mg · L-1 GA3恢复培养基上,存活率和再生率最高达79.91%和62.52%。通过SSR分子标记检测,再生植株的遗传稳定性没有发生改变。     

红姜花体细胞胚胎发生及植株再生的研究

以红姜花（Hedychium coccineum）的花丝和花药为外植体,通过体细胞胚胎发生途径建立了植株再生体系。结果表明：外植体在MS + 4 mg ? L-1 2,4-D + 4 mg ? L-1 NAA + 1 mg ? L-1 6-BA + 30 g ? L-1 蔗糖 + 7 g ? L-1 琼脂的培养基上经过120 d诱导出愈伤组织,愈伤组织在MS + 1 mg ? L-1 2,4-D + 0.25 mg ? L-1 NAA + 0.25 mg ? L-1 6-BA + 30 g ? L-1 蔗糖 + 7 g ? L-1琼脂的培养基上经过继代筛选,获得浅黄色松散易碎的胚性愈伤组织。胚性愈伤组织在MS无机盐 + B5维生素+ 100 mg ? L-1谷氨酰胺 + 230 mg ? L-1 脯氨酸 + 100 mg ? L-1麦芽提取物 + 0.02 mg ? L-1 NAA + 0.02 mg ? L-1 TDZ + 0.5 ~ 1.0 mg ? L-1 2,4-D + 45 g ? L-1蔗糖的培养基中通过3个月的悬浮培养,可得到均质稳定的胚性细胞悬浮系（ECS）。胚性悬浮细胞在SH无机盐 + B5维生素 + 100 mg ? L-1谷氨酰胺 + 230 mg ? L-1脯氨酸 + 100 mg ? L-1麦芽提取物 + 0.25 mg ? L-1 NAA + 0 ~ 0.20 mg ? L-1 TDZ + 45 g ? L-1蔗糖 + 7 g ? L-1琼脂的体胚诱导培养基中培养10 d,可见到白色半透明体胚发生,20 d后体胚发育成熟。当TDZ浓度为0.15 mg ? L-1时,体胚诱导率高达4 500个 ? mL-1 PCV ECS（PCV：细胞密实体积）。在SH无机盐 + B5维生素 + 0.20 mg ? L-1 IAA + 0.25 ~ 1.0 mg ? L-1 6-BA + 30 g ? L-1蔗糖 + 7 g ? L-1琼脂的体胚萌发培养基上,体胚萌发率高达100%。将萌发的体胚转移到1/2MS + 1 g ? L-1活性炭成苗培养基中,进一步发育成正常的再生植株,植株室外栽培成活率达90%。     

苹果体细胞悬浮培养及植株再生研究

以苹果试管苗叶片的再生不定芽嫩叶为试材,对苹果体细胞悬浮系的建立及植株再生的影响因素进行了研究.结果表明:在MS+NAA 0.5 mg/L+BA 2.0 mg/L培养基上可诱导获得高活力的愈伤组织.将该愈伤组织转入MS+2,4-D 2.0 mg/L+BA 1.0 mg/L液体培养基中培养,采用无菌筛网分离获得含单个细胞和少于8～10个细胞的小细胞团进行继代培养,建立体悬浮细胞培养系.将悬浮细胞转到MS+2,4-D 2.0 mg/L+BA 1.0 mg/L的固体增殖培养基上暗培养25 d后,可形成微型愈伤组织,将该愈伤组织转到MS+BA 5.0 mg/L+IAA 0.5 mg/L的植株再生培养基上暗培养30 d后转入光下,光照培养30 d后53％的愈伤组织可再生植株.该研究建立的苹果体细胞悬浮培养技术,不仅可用于细胞融合及遗传转化过程中杂种细胞和转化细胞的分离及植株再生研究,而且对于利用组织培养技术筛选变异株系也具有重要意义.     

怀地黄玻璃化和包埋玻璃化法超低温保存

比较了玻璃化与包埋玻璃化超低温保存怀地黄（Rehmannia glutinosa(Gaertn.) Libosch）‘85-5’带芽茎段的效果。结果表明：4 ℃低温锻炼5 d,在添加二甲基亚砜（DMSO）和乙酰胺的预培养基中预培养3 d,60 % PVS₂室温装载25 min,PVS₂ 0 ℃脱水30 min时,玻璃化和包埋玻璃化两种保存方法均达到本试验条件下最佳结果;两种方法相比,玻璃化法的存活率和再生率均较包埋玻璃化法高,前者的存活率（88.92 %）和再生率（64.29 %）分别是后者的1.38倍和2.41倍。可见,采用超低温保存怀地黄种质资源是可行的,且玻璃化法优于包埋玻璃化法。