UV-B胁迫下紫花苜蓿qRT-PCR内参基因的筛选

[目的]在植物代谢通路关键调控基因表达的相关研究中,筛选各种条件下合适的内参基因至关重要。[方法]以UV-B为主要胁迫,运用荧光定量PCR技术以及geNorm和NormFinder软件,对不同取样时间（处理后0、1、2和5d）的紫花苜蓿（MedicagosativaL.）幼苗根、茎、叶组织中Actin2、GAPDH、MSC27、18SRNA、β-tublin、bZIP、UBQ、PPPrep、Ms03₅0f03和Ms03₆9f07等候选内参基因表达的稳定性进行研究。[结果]geNorm软件显示:紫花苜蓿幼苗根部UV-B胁迫下MSC27和UBQ的稳定值（M）较小,增加第3个内参基因后变异值（V）基本不变,表明选用2个内参基因即可;茎部则是MSC27和Actin2的M值较小,同时相应的V值也满足要求;而使用M值较小的Actin2和GAPDH为内参,在研究叶片基因表达时可以获得更加准确的结果,当增加第3个内参基因时,V值变大,反而影响结果。同时发现,18SRNA和β-tublin在根和茎叶中的稳定性均较差,因此不适宜作为内参基因使用。NormFinder的结果与上述结果相似,结果差异部分的原因可能是因为算法不同。[结论]在UV-B胁迫下,紫花苜蓿幼苗根部中MSC27和UBQ的表达较为稳定,而在茎部则以MSC27和Actin2为宜,使用Actin2和GAPDH为内参在研究叶片基因表达时可以获得更加准确的结果。本研究对UV-B胁迫下紫花苜蓿中关键基因的定量表达分析具有重要的实用价值。     

免疫刺激后小鼠肝脏内参基因稳定性研究

实时定量PCR技术现已广泛应用于细胞或组织mRNA转录水平的检测和半定量。选择合适的内参基因可以消除不同标本在RNA的产量、质量以及逆转录效率上可能存在的差别,从而获得目标基因特异性表达的真正差异。本试验应用实时定量PCR技术,研究小鼠在经过免疫刺激后,B2M、ACTB、GAPDH、SDHA、HPRT1和ARBP共6个内参基因在肝脏中的表达情况。结果表明,这6个内参基因表达存在差异。经过geNorm程序统计学分析,确定了ACTB、GAPDH两个看家基因适用于校正目标基因的表达量,为研究小鼠免疫刺激后肝脏目标基因的表达奠定基础。     

幼龄小鼠小肠组织内参基因的选择

选择B2 M、ACTB、GAPDH、SDHA、HPRT1和ARBP共6个内参基因,研究其在幼龄小鼠小肠组织内的表达情况.结果表明:6个内参基因均可获得特异性扩增产物;经geNorm程序和NormFinder分析,6个内参基因稳定度由高到低为SDHA=HRPT1>ARBP>ACTB>GAPDH>B2 M;基因表达的稳定值分别为0.006(SDHA)、0.006(HRPT1)、0.007(ARBP)、0.018(ACTB)、0.029(GAPDH)、0.111(B2 M),最终筛选出SDHA和HRPT1 2个内参基因适合用于校正目的基因的表达.     

实时荧光定量PCR筛选鸡基因表达最佳内参基因

为筛选在鸡基因表达时稳定表达的内参基因,本试验以6、14、22及30周龄的地方品种固始鸡与6周龄的商业品种罗斯308肉鸡为试验动物,以B2M、28S、GAPDH、β-actin及HSP70为候选内参基因,利用qRT-PCR对这5个候选内参基因的相对表达量进行测定,通过独立评价软件geNorm、NormFinder、SP...     

桂花组织基因表达中荧光定量PCR内参基因的筛选

为了筛选桂花Osmanthus fragrans不同组织基因表达分析中适合的内参基因,以桂花‘堰虹桂’O. fragrans‘Yanhong Gui’花蕾、盛开花序、嫩叶、成熟叶和1年生茎等5个不同组织为材料,利用实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测7个候选内参基因的表达水平,并利用geNorm,NormFinder和BestKeeper软件对各候选内参基因的表达稳定性进行评价,最后利用桂花不同组织中OfCRTISO1基因相对表达水平验证筛选的内参基因的可靠性。结果表明:综合3个软件的评价排序,确定不同组织中最佳内参基因为OfRAN1和OfUBC2,而Of18S是最差内参基因。OfCRTISO1基因相对表达水平分析证实,不同组织中qRT-PCR分析使用OfRAN1和OfUBC2等2个表达最稳定的基因组合,即可获得更为精确的基因表达结果。旨在为桂花组织间重要基因的定量表达分析提供科学依据。图 4 表 4 参34     

利用geNorm、NormFinder和BestKeeper软件进行内参基因稳定性分析的方法

实时荧光定量PCR(RT-qPCR)由于具备灵敏度高、重复性好、特异性强及高通量等优点,已经成为研究基因表达分析的常用方法,但其结果的准确性取决于内参基因。在任何试验条件下都能稳定表达的内参基因几乎不存在,科研工作者为了获得精准的试验结果,首先必须从众多的内参基因中筛选出稳定的内参基因。geNorm、NormFinder和BestKeeper等是专门用于筛选稳定性内参基因的软件,但这3种软件使用方法差异很大,为了让更多的科研人员了解这些软件、节省时间,笔者结合自己的科研经验详细介绍了这3种软件的使用方法,以期为相关科研人员利用这些软件筛选内参基因提供便利。     

杜鹃红山茶实时定量PCR 内参基因筛选及验证

【目的】实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）以高灵敏度和特异性等优点,成为基因表达分析的主要工具,而选择适合不同条件下工作的内参是qRT-PCR分析的前提。筛选得到适用于杜鹃红山茶不同器官、不同时期花瓣的qRT-PCR分析的内参基因,为后续相关基因功能研究提供可用的内参基因。【方法】选择转录延伸因子编码基因（EF1α）、α-tubulin（TUA）、β-tubulin（TUB）、Ubiquitin（UBQ）、肌动蛋白（Actin）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）6个看家基因,使用2种不同的计算程序GeNorm和NormFinder评估了6个基因表达的稳定性。进一步通过CaGASA3基因的表达模式验证了所选内参基因的适用性。【结果】在不同器官中通过GeNorm和NormFinder筛选出稳定性最好的基因,排名前2位的均为TUA和GAPDH,GAPDH基因在两种计算程序评估中稳定性均最佳。而在不同时期花瓣中,通过2种程序得出排名前2位的内参基因均为TUB和UBQ;UBQ基因在GeNorm程序评估中稳定性最好,TUB基因在NormFinder程序的评估中稳定性最佳。【结论】杜鹃红山茶不同器官中最佳内参基因为TUA和GAPDH,不同时期花瓣中最适内参基因为TUB和UBQ。     

不同组织及干旱胁迫下黄薇内参基因的筛选与验证

【目的】为黄薇Heimia myrtifolia不同组织及不同干旱胁迫下基因表达分析筛选最适内参基因。【方法】选取黄薇盛花期的根、茎、叶、花,以及5种不同干旱处理的叶片作为实验材料,借助RT-qPCR技术对黄薇转录组数据筛选的9个候选内参基因进行分析,并利用软件geNorm、BestKeeper、NormFinder和RefFinder综合评价候选基因的表达稳定性。最后选取2个与胁迫相关的基因CSLD和SOD,对所选内参基因进行验证。【结果】geNorm、BestKeeper和NormFinder分析得出的候选内参基因排序存在一定差异。利用RefFinder对上述3个软件的结果综合分析得出：在不同组织中,最稳定的内参基因为GAPDH,最不稳定的内参基因为TUA;在干旱胁迫中,最稳定的内参基因为GAPDH,最不稳定的内参基因为TUB。在全部样本中,最稳定的内参基因为GAPDH,最不稳定的内参基因为18S RNA。对不同组织和干旱胁迫下的CSLD和SOD基因表达模式进行验证表明：上述2个基因与筛选所得内参基因的表达量和变化趋势均较为一致。【结论】在不同组织和干旱处理后,GAPDH是最适合黄...     

茶愈伤组织实时定量PCR分析中内参基因的选取

为了选取合适的内参基因来分析培养基中前体物诱导及对照的茶愈伤组织中茶氨酸代谢相关基因的差异表达,利用GenBank上登录的茶树基因序列以及通过构建文库测序所得的基因（具有完整的阅读框）共7个持家基因设计引物。在分析这些引物的扩增效率和特异性后,测定了它们在茶愈伤组织生长过程中（对照和愈伤培养基中添加含氮外源物的情况下）的表达水平。利用geNorm 和NormFinder软件分析了这些持家基因的稳定性,确定在该条件下合适的内参基因为β-actin和GAPDH。     

猪睾丸组织定量PCR分析中内参基因的选择

【目的】采用实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)对基因表达进行分析时,选择适当的内参基因是获得准确分析结果的关键。在猪睾丸分子生物学研究中,表达稳定的蛋白编码内参基因和micro RNA(miRNA)内参基因均有哪些目前尚不清楚。本研究旨在筛选出合适的内参基因,为准确定量不同时期猪睾丸组织中目的基因的表达提供可靠依据。【方法】选用8个不同发育时期(E 90、D 1、D 30、D 60、D 90、D 120、D 150、DM)的猪睾丸组织为材料,采用Trizol裂解法提取各样品的总RNA,利用Nan Drop ND-2000分光光度计检测总RNA的浓度和纯度。设计并合成已报道的猪其他组织中表达相对稳定的5个编码内参基因(GAPDH、TBP、β-actin、SDHA和B2M)以及5个miRNA内参基因(U6、ssc-miR-17-5p、ssc-miR-26a、ssc-miR-27a和ssc-miR-103)的特异性引物序列,逆转录得到cDNA模板后,按1:10梯度稀释为7个浓度梯度进行qRT-PCR反应以构建标准曲线。并对10个候选内参基因在各时期睾丸组织中的表达情况进行实时荧光定量全面检测,采用Ge Norm法对定量结果进行综合分析,最后根据内参基因稳定性值(M值)的大小筛选出最稳定的参考基因;M值越小,表明内参基因的稳定性越好,反之则越差。【结果】对GAPDH、TBP、β-actin、SDHA、B2M、U6、ssc-miR-17-5p、ssc-miR-26a、ssc-miR-27a和ssc-miR-103 10个候选内参基因的熔解曲线进行分析发现,均无非特异扩增及引物二聚体,说明各内参基因特异性良好,qRT-PCR反应的专一性高;以Ct值为纵坐标,相对拷贝数的对数为横坐标进行标准曲线分析可知,各内参基因在系列稀释的浓度梯度内具有良好的线性关系;通过对10个候选内参基因在不同时期猪睾丸组织中的表达稳定性分析发现,蛋白编码基因中,最稳定的为TBP,最不稳定的是GAPDH;miRNA候选内参中,最稳定的为U6,最不稳定的是ssc-miR-26a。【结论】成功筛选出猪睾丸组织基因表达分析中稳定表达的内参基因TBP和U6,可作为猪睾丸组织基因表达研究中最佳内参基因候选者。     

磷胁迫下羊草的响应及磷响应相关基因表达分析

【目的】磷是植物生长发育所必需的大量营养元素,研究无机磷酸盐（inorganic phosphate,Pi）胁迫下羊草的响应,筛选不同浓度Pi胁迫下的内参基因,并分析Pi响应相关基因的表达,为羊草Pi胁迫响应的分子机制研究提供基础数据。【方法】以羊草幼苗为材料,进行不同浓度Pi处理培养,对羊草的株高和根长进行检测,利用钒钼黄比色法检测羊草植株中Pi的含量。根据羊草转录组数据选取7个候选内参基因,从NCBI核酸序列数据库选取1个候选内参基因,对羊草不同处理材料进行总RNA提取和cDNA合成,利用qRT-PCR对候选内参基因的表达进行检测,并通过geNorm、NormFinder和Bestkeeper软件对其稳定性进行评估。根据筛选获得的较稳定内参基因,对Pi响应基因的qRT-PCR检测数据进行相对定量分析。【结果】表型观测结果显示,无论是低Pi还是高Pi胁迫都使得羊草的生长减缓;株高对低Pi或缺Pi胁迫较为敏感,根长对高Pi胁迫较为敏感;并随着处理浓度的增加羊草中Pi的含量也增加。qRT-PCR溶解曲线分析显示8个候选内参基因均具有单一的溶解峰,基因表达谱分析表明8个候选内参基因的CT值范围是17.16—26.61,其中,LcGAPDH的表达丰度最高为17.16—20.22,Lc18SrRNA的表达丰度最低为23.28—26.61,CT值变异系数最小的为LcARPT（2.09%）,最大的为LcTUA（6.8%）。综合geNorm、NormFinder和Bestkeeper稳定性排名,通过计算几何平均数,获得8个候选内参基因综合稳定性排名,其中排名靠前的3个基因分别为Lc18SrRNA、LcCAP和LcEF1α,排名最后的2个基因为LcTUA和LcTUB。分别以Lc18SrRNA、LcCAP和LcEF1α作为内参基因,qRT-PCR相对定量表达分析结果显示,与对照相比,LcPHO1-2的表达受低Pi或者缺Pi诱导;LcPAP2的表达受高Pi诱导;而LcPAP27的表达同时受低Pi和高Pi下调。【结论】低Pi和高Pi胁迫均使羊草生长受阻,羊草地上组织与地下组织对Pi胁迫响应的模式不同。筛选出3个表达较为稳定的内参基因Lc18SrRNA、LcCAP和LcEF1α。LcPHO1-2和LcPAP2分别参与了羊草对低Pi和高Pi的应答响应,LcPAP27同时参与了羊草对低Pi和高Pi的响应进程。     

Validation of Reference Genes for Quantitative Real-Time PCR in Laodelphax striatellus

The normalization of quantitative real-time PCR （qPCR） is important to obtain accurate gene expression data, and the most common method for qPCR normalization is to use reference genes. However, reference genes can be regulated under different conditions, qPCR has recently been used for gene expression study in Laodelphax striatellus, but there is no study on validation of the reference genes. In this study, five new housekeeping genes （LstrTUB1, LstrTUB2, LstrTUB3, LstrARF and LstrRPL9） in L. striatellus were cloned and deposited in the GenBank with accession numbers of JF728809, JF728810, JF728811, JF728807 and JF728806, respectively. Furthermore, mRNA expressions of the five genes and β-actin were measured by qPCR with insect samples of different instar at nymph stage, and the expression stabilities were determined by the software geNorm and NormFinder. As a result, ARF and RPL9 were consistently more stable than β-actin, while three TUB genes were less stable than β-actin. To determine the optimal number of reference genes used in qPCR, a pairwise variations analysis by geNorm indicated that two references ARF and RPL9 were required to obtain the accurate quantification. These results were fiarther confirmed by the validation qPCR experiment with chitinase gene as the target gene, in which the standard error of the mRNA quantification by using binary reference ARF-RPL9 was much lower than those by ARF, RPL9 or β-actin alone. Taken together, our study suggested that the combination of ARF-RPL9 could replace β-actin as the reference genes for qPCR in L. striatellus.     

用于荔枝qPCR分析的内参基因克隆及稳定性分析

利用基因克隆和测序,从‘妃子笑’荔枝果皮中获得了β-Actin、GAPDH和18S rRNA 3个qPCR分析常用的内参基因全长序列,其长度分别为1 273、1 368和1 712 bp;3个基因与其他物种高度同源,氨基酸序列相似性均超过了98%.在此基础上,结合已报道的UBQ、eEF和25S rRNA 3个常用的内参基因,对β-Actin、GAPDH、18S rRNA,UBQ、eEF和25S rRNA 6个常用内参基因在荔枝果实发育不同阶段和外源生长调节剂处理后表达稳定性进行了分析,同时比较了geNorm、Norm Finder和BestKeeper 3种不同算法的差异.结果表明:以上6个基因中,β-Actin基因在3种不同算法下均保持了较好的表达稳定性.     

JR蛋鸭血型基因的测定

用 1 2个抗鸭红细胞抗原单价血清 ,对JR蛋鸭的两个品系进行了血型测定和血型基因群体遗传学分析。结果表明 :JR蛋鸭A、B两个品系的遗传结构、种质特性和选育水平都比较接近 ,而与南昌商品蛋鸭和北京鸭的遗传结构明显不同 ,遗传差异较大 ,说明JR蛋鸭是独立形成的一个新类群 ,具有自己特殊的种质特性