烟夜蛾气味受体OR18基因克隆及组织特异性表达

应用RT-PCR和实时荧光定量PCR技术,从烟夜蛾雄虫触角中克隆气味受体目的基因,分析鉴定了其在烟夜蛾不同组织的特异性表达情况.序列分析结果表明,目的基因为新的烟夜蛾气味受体基因,命名为HassOR18(GenBank登录号:HM750915).该基因阅读框架全长1 197 bp,编码398个氨基酸,推测编码蛋白质的相对分子质量为46.6 kD,等电点为5.82.氨基酸序列比对表明,烟夜蛾气味受体HassOR18与其他夜蛾科昆虫OR18的氨基酸序列一致性均达80％以上.实时荧光定量PCR结果显示,HassOR18仅在雌雄虫触角中和雌虫喙内表达,而且在雄虫触角内的表达量远高于在雌虫触角和喙内的表达量,推测该基因可能参与性信息素的识别.     

麦蛾气味受体OrCo基因的克隆及其表达模式分析

采用RT-PCR和RACE技术,克隆了麦蛾OrCo基因全长序列,并将该基因命名为ScerOrCo。序列分析结果显示,ScerOrCo全长为1 876bp,开放阅读框长1 422bp,编码473个氨基酸,序列中有7个跨膜区。ScerOrCo基因的氨基酸序列与粘虫Mythimna separate嗅觉受体的同源性高达87%。qRT-PCR检测结果表明ScerOrCo只在麦蛾触角中特异性表达,且雌雄虫间表达量无显著差异。     

紫大麦草中DREB类转录因子基因Hvi917DREB2的克隆、原核表达及序列分析

DREB类转录因子是一类与植物逆境胁迫响应相关的重要蛋白,本研究利用同源克隆方法和RACE技术从紫大麦草(Hordeum violaceum)中分离到1个DREB类转录因子基因,命名为Hvi917 DREB2。序列分析表明Hvi917 DREB2基因含有1个792bp的开放阅读框,编码264个氨基酸残基,含有1个保守的AP2结构域,属于AP2大家族。该基因编码的氨基酸序列与Genebank中短芒大麦草AP2蛋白HbDREB2、DREB1(登录号分别为:AAU29412.1和AER42620.1)具有99%的氨基酸序列一致性。将该基因构建成原核表达载体,经IPTG诱导表达了1个分子量为34.5kD的蛋白。     

不结球白菜BrCBF基因cDNA全序列克隆及结构特征分析

运用RT-PCR和RACE技术从不结球白菜中克隆到1个抗寒相关基因,命名为BrCBF,基因登陆号为DQ402470.其cDNA全长1 003 bp,含有648 bp的完整开放阅读框,编码216个氨基酸,该基因编码的蛋白序列与拟南芥、荠菜、甘蓝型油菜编码的氨基酸序列有极高的同源性,且具有CBF典型的保守结构域AP2.     

不结球白菜BrCBF基因cDNA全序列克隆及结构特征分析

运用RT-PCR和RACE技术从不结球白菜中克隆到1个抗寒相关基因,命名为BrCBF,基因登陆号为DQ402470.其cDNA全长1 003 bp,含有648 bp的完整开放阅读框,编码216个氨基酸,该基因编码的蛋白序列与拟南芥、荠菜、甘蓝型油菜编码的氨基酸序列有极高的同源性,且具有CBF典型的保守结构域AP2.     

烟青虫气味结合蛋白基因的克隆与序列分析

 根据已经报道的棉铃虫普通气味结合蛋白I（GOBP1）和性信息素结合蛋白（PBP）基因的cDNA序列，设计了2对引物，以烟青虫Helicoverpa assulta触角cDNA为模板，分别进行PCR扩增，获得2条特异性条带，约400 bp。将以上两条片段分别连接到T-easy载体上，获得重组子T-GOBP1-Hass和T-PBP-Hass。序列测定和结构分析表明，Hass-GOBP1开放阅读框全长441bp，编码147个氨基酸残基，预测分子量和等电点分别为17.2 kD和4.71。Hass-PBP开放阅读框全长405 bp，编码135个氨基酸残基，预测分子量和等电点分别为15.1 kD和5.2。Hass-GOBP1和Hass-PBP具有昆虫气味结合蛋白的典型特征，即氨基酸序列中具有6个保守的半胱氨酸残基，呈酸性。这2个基因已在GenBank中登记，序列号分别是AY864774和AY864775。     

桂花β-胡萝卜素羟化酶基因的克隆与序列分析

为揭示桂花不同品种β-胡萝卜素羟化酶(β-carotene hydroxylase,HYB)基因的序列差异,利用已构建的桂花花瓣转录组数据库中Unigene序列信息,结合RT-PCR技术对桂花品种玉玲珑、金球桂、堰虹桂和日香桂中2个β-胡萝卜素羟化酶基因(HYB1和HYB2)的最大阅读框进行扩增,并测序验证。生物信息学分析结果表明,4个桂花品种HYB1基因均含有长为909 bp的开放阅读框,编码302个氨基酸残基; HYB2基因均含有长为915 bp的开放阅读框,编码304个氨基酸残基。4个桂花品种HYB1和HYB2推导的氨基酸序列均具备保守的组氨酸结构域。HYB1基因核苷酸序列存在27个变异位点,其氨基酸序列存在8个变异位点; HYB2基因核苷酸序列存在12个变异位点,其氨基酸序列存在3个变异位点。进化树分析结果发现,4个桂花品种的HYB1和HYB2蛋白与茄科植物番茄和辣椒HYB蛋白亲缘性最高。     

软枣猕猴桃L-半乳糖内酯脱氢酶基因的克隆及原核表达分析

为更好了解L-半乳糖内酯脱氢酶及编码基因在软枣猕猴桃中的生理功能及作用,以‘魁绿’软枣猕猴桃果实cDNA为模板,用RT-PCR及RACE技术,获得L-半乳糖酸-1,4-内酯脱氢酶基因AaGalLDH(GenBank:KP145007.1)。序列分析表明该基因全长为2 394 bp,开放阅读框为1 833 bp,编码610个氨基酸,与其它植物GalLDH氨基酸序列具有78%～95%的同源性。编码的蛋白序列具有GalLDH蛋白家族典型的保守结构域。进一步将该基因连接到原核表达载体并转化大肠杆菌进行诱导表达,经Western Blotting验证,目的基因在pET-28a表达系统中有表达,但基本为不溶性表达。这为进一步研究该酶蛋白的体外表达和功能以及选育高品质软枣猕猴桃品种奠定了基础。     

猪链球菌2型IMPDH基因功能结构域的研究

在猪链球菌毒力相关基因orf2和mrp之间发现一个新的开放阅读框,经酶活性染色试验证实该阅读框编码的蛋白具有次黄嘌呤核苷酸脱氧酶(IMPDH)活性,该阅读框共计957 bp,编码319个氨基酸.经Interpro和PHD软件分析,推测该蛋白的功能结构域存在于9～798 bp基因片段所编码的多肽中,特对这790个碱基依次缺失,以找寻酶的催化部位和底物结合部位.4个缺失基因和全长基因经过基因克隆,表达出5种相应的蛋白.免疫印迹证实这5种蛋白可被猪链球菌2型(SS2)的抗血清识别,且其中的4种蛋白含有IMPDH单抗(1A8)识别表位;通过活性染色,初步确定了SS2中IMDPH的催化部位和底物结合部位.     

黄曲条跳甲易化扩散载体超家族成员的cDNA序列及其基因表达

采用转录组测序和荧光定量PCR等方法,分析蔬菜害虫黄曲条跳甲Phyllotreta striolata(Fabrici-us)易化扩散载体超家族成员的cDNA序列及其基因表达。结果表明:黄曲条跳甲的一种易化扩散载体超家族成员PsMFS1,其开放阅读框为1 224bp,编码407个氨基酸,含有2个典型的功能域,即药物分子排出系统蛋白功能域和易化扩散载体超家族蛋白功能域;该基因在黄曲条跳甲雌雄成虫的不同部位中都有表达,其中头部、中肠和精巢或卵巢的相对表达量较高,触角和足部的相对表达量较低。     

不结球白菜抗坏血酸过氧化物酶基因克隆及其原核表达载体构建

参照拟南芥APX基因保守域序列设计引物,扩增出不结球白菜抗坏血酸过氧化物酶(APX)基因的核心片段,结合RACE技术获得该基因的5′端序列和3′端序列,利用DNAman软件经序列拼接获得1个全长为1 089bp的cDNA序列,该序列包括开放阅读框867 bp,编码288个氨基酸,蛋白质等电点5.52的相对分子量31 600。APX基因编码的氨基酸序列与拟南芥APX基因编码的氨基酸的同源性为81%。将APX基因片段连接到原核表达载体PGEX-4T-3,转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导重组蛋白质的表达,SDS-PAGE电泳结果表明,产生了预期大小的重组蛋白。     

不结球白菜BrCOR14基因cDNA全序列克隆及结构特征分析

通过设计保守的基因特异引物,运用RT-PCR、RACE技术从不结球白菜中获得1个抗寒相关基因,命名为BrCOR14,登录号为DQ192529,cDNA全长549 bp,含有387 bp的完整开放阅读框,编码128个氨基酸.该基因编码的氨基酸序列与油菜、拟南芥、荠菜编码的氨基酸序列有极高的同源性.     

2个新的鳞翅目OR83b类化感蛋白基因的克隆和序列分析

【目的】分离和克隆昆虫触角中一类非常保守的嗅觉受体蛋白基因全序列。【方法】采用简并引物反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆基因,用生物信息学方法对获得的cDNA全序列及推导的氨基酸序列进行分析。【结果】从甜菜夜蛾(Spodoptera exigua Hübner)和斜纹夜蛾[Spodoptera litura(Fabricius)]雄蛾触角中扩增得到2个分别为1906bp和2483bp的OR83类化感蛋白基因的cDNA,开放阅读框(ORF)编码473个氨基酸,命名为SexiOR2和SlitOR2。通过在GenBank中进行序列的同源性比较,发现这2个鳞翅目化感蛋白新序列与已知蛾类昆虫的OR83b类化感蛋白氨基酸序列具较高的同源性。【结论】明确了所获得的2个鳞翅目蛋白新序列属于OR83b类化感蛋白。     

野桑蚕酚氧化酶原基因PPO1的克隆及其特征(英文)

利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)克隆野桑蚕(Bombyx mandarina)酚氧化酶原基因PPO1,获得其cDNA序列;该序列长2 086bp,含有一个2 058bp的完整开放阅读框,编码一个由685个氨基酸残基组成的蛋白质;该基因推导的氨基酸序列与其他鳞翅目昆虫PPO1基因相应的氨基酸序列有较高的同源性,该序列具有它们的PPO基因所共有的典型特征。RT-PCR检测分析表明该基因仅在野桑蚕的头部和血液中表达,而Northern杂交检测表明该基因仅在血液中有表达。这些结果为进一步研究该基因的功能提供了分子基础。     

棉铃虫信息素结合蛋白2 cDNA的克隆、表达与组织特异性表达

 【目的】克隆、分析和原核表达编码棉铃虫Helicoverpa armigera (Hübner)信息素结合蛋白HarmPBP2的cDNA,并纯化得到HarmPBP2蛋白。【方法】以棉铃虫触角为材料,通过RT-PCR 技术以获得编码中棉铃虫信息素结合蛋白HarmPBP2 基因成熟蛋白开放阅读框序列,使用半定量RT- PCR对表达谱进行研究,并在使用pGEX-4T-1表达载体在BL21（DE3）系统中进行原核表达,使用GSTrap FF预装柱进行纯化并切去标签。【结果】克隆了命名为HarmPBP2（GenBank登录号：EU647241）的棉铃虫信息素结合蛋白基因,该序列全长457 bp,编码149 个氨基酸残基,前端是一段25个氨基酸长的信号肽,推测蛋白具有昆虫信息素结合蛋白典型的6 个保守的半胱氨酸残基的特征。棉铃虫HarmPBP2在雌雄成虫的触角、足和翅中都有表达,另外在雌虫下颚须也有表达。雌雄组织表达量顺序相同,触角中表达量最高,翅中次之,足中最少。雌虫组织中表达量高于雄虫。构建的原核表达载体pGEX/ HarmPBP2,在大肠杆菌BL21（DE3）中成功地表达出一个分子量约为40 kD的融合蛋白,经亲和层析纯化与酶切得到去标签的HarmPBP2蛋白。【结论】克隆、分析和表达了棉铃虫信息素结合蛋白HarmPBP2的cDNA序列,并对其进行纯化,为进一步研究其分子结构和功能奠定了基础,同时对其表达谱进行了研究。     

刺五加GAPDH 基因全长cDNA 的克隆与生物信息学分析

采用cDNA末端RACE技术,从刺五加叶片中克隆到GAPDH基因cDNA的全长序列,并运用生物信息学方法对该基因的cDNA序列、保守区、氨基酸序列、亲缘关系等特征进行分析,并预测其编码蛋白质的结构和功能.研究结果表明,刺五加GA PGH基因的cDNA全长为1 437 bp,开放阅读框全长为1 023 bp,编码一个具有340个氨基酸残基的蛋白,蛋白分子质量为37.070 ku,理论等电点(pI)为7.71.刺五加GAPDH蛋白不存在跨膜结构域,定位于细胞质中,属于亲水蛋白.     

一个陆地棉水通道蛋白基因的生物信息学分析(英文)

[目的]对陆地棉水通道蛋白基因GhNIP5.1进行生物信息学分析,为深入研究陆地棉水通道蛋白的功能提供研究基础。[方法]利用电子克隆的方法,获得棉花GhNIP5.1基因的开放阅读框序列,并对该序列进行了生物信息学分析;利用已公布的棉花基因组测序结果,搜索获得GhNIP5.1基因的编码区序列。[结果]序列分析表明,所获得cDNA序列具有完整的897 bp的开放阅读框,编码298个氨基酸残基;该氨基酸序列具有MIP超家族典型的NPA保守序列;它同葡萄和拟南芥的NIP5.1氨基酸序列的一致性最高,分别为89.3%和83.2%,在拟南芥NIP家族9个成员中,GhNIP5.1蛋白的氨基酸序列同AtNIP5.1同源性最高;该蛋白的三维结构也同拟南芥AtNIP5.1的非常相似;GhNIP5.1基因的编码区全长2 067 bp,包含4个外显子和3个内含子,所有内含子的左右边界均为GT-AG结构。[结论]GhNIP5.1基因可能具有同拟南芥AtNIP5.1类似的生理功能。     

芸薹属栽培种ALS1-3的克隆及序列分析

【目的】揭示6种芸薹属植物乙酰乳酸合成酶(ALS)基因的结构特征,为ALS酶的遗传操作和抗除草剂种质创制奠定基础。【方法】利用特异PCR方法,对甘蓝型油菜(Brassica napus L.)、甘蓝(B.oleracea)、芥菜型油菜(B.juncea)、白菜型油菜(B.rapa)、埃塞俄比亚芥(B.carinata)、黑芥(B.nigra)等6个芸薹属16份材料的ALS基因进行扩增、克隆测序及生物信息学分析。【结果】除1个B.nigra材料未扩增出任何产物外,其余参试材料中均有PCR扩增产物,共成功克隆了30个ALS基因(GenBank登录号为KM816807~KM816836),且克隆的基因ALS1、ALS2、ALS3均不含内含子,只有一个开放阅读框。ALS1基因开放阅读框长为1 968bp,编码655个氨基酸;ALS2基因开放阅读框长为1 914bp,编码637个氨基酸;ALS3基因开放阅读框长为1 959bp,编码652个氨基酸。参试材料中,在ALS1基因中检测到7个SNP,其中4个导致氨基酸突变;在ALS2基因中检测到3个SNP,其中2个导致氨基酸突变;在ALS3基因中检测到25个SNP,其中2个导致氨基酸突变。在3类ALS蛋白中,ALS1和ALS3遗传距离较近,与ALS2的遗传距离相对较远。ALS1基因定位于C01染色体上,ALS2和ALS3基因定位于A01染色体上。【结论】参试的6个芸薹属不同材料间ALS1、ALS2、ALS3基因序列及其编码的蛋白序列均存在差异。     

梅花PmZAT12的克隆及表达分析

为筛选梅花抗寒关键基因,以‘雪梅’叶片c DNA为模板,采用RT-PCR技术克隆获得一个C2H2型锌指蛋白基因PmZAT12。该基因开放阅读框为537 bp,编码178个氨基酸,氨基酸序列比对结果显示PmZAT12蛋白含有2个高度保守的锌指蛋白结构域,以及DLN和L-Box等锌指蛋白特征序列。系统进化树分析发现PmZAT12蛋白与桃PpZAT12蛋白的亲缘关系最近。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测了PmZAT12基因在多种非生物胁迫下的表达模式,结果表明PmZAT12基因能够持续而强烈地响应低温和干旱,而盐和ABA抑制其表达。