OsNAC2d基因编辑水稻突变体的创建及其对干旱胁迫的响应

为探究转录因子OsNAC2d的生物学功能及其对水稻耐旱性的影响, 本研究利用CRISPR/Cas9编辑技术对粳稻中花11中的OsNAC2d基因进行突变, 并考察osnac2d突变体在田间种植下的农艺性状, 以及突变体幼苗在干旱胁迫下的生长情况和OsNAC2d基因表达水平。结果表明, OsNAC2d基因主要在水稻成熟籽粒、叶片和花药中表达, 在根系和茎中的表达量较低, 并且受干旱胁迫诱导, 在10株阳性OsNAC2d基因突变株系的T₂代植株中, 筛选出6种纯合osnac2d突变体, 田间试验调查表明, osnac2d突变体与野生型中花11相比, 株高、有效穗、穗长、穗粒数、结实率、千粒重和单株产量等农艺性状无显著差异。在干旱胁迫时, osnac2d突变体幼苗的根系与植株生长、根系和地上部生物量的积累均受到抑制, 且OsNAC2d在osnac2d突变体中的表达量维持在较低水平, 而野生型水稻的OsNAC2d表达则受干旱胁迫诱导而增强, 植株生长与生物量积累未受到显著抑制, 表明转录因子OsNAC2d正调控水稻响应干旱胁迫。创建的osnac2d突变体材料为进一步揭示OsNAC2d的生物学功能及其响应干旱胁迫的精细调控机制提供了优质种质资源。     

水稻双组分系统基因干旱胁迫表达谱分析

利用全基因组表达芯片,系统分析干旱胁迫条件下水稻双组分信号系统(two component system,TCS)相关基因在其不同发育阶段、不同组织以及抗旱能力不同的株系中的表达谱变化特征.结果表明,双组分信号系统基因在干旱胁迫环境下的表达具明显的时空特异性,表现为不同组织的TCS基因干旱胁迫表达谱差异较大,而同一组织内表达谱相似,其中生殖生长期(幼穗分化期和孕穗期)两个叶片材料中TCS基因表达谱最为接近;与细胞分裂素信号传导负向调控相关的A型应答调控器在旱胁迫下表达下调,而与CK信号传导正向调控相关的B型应答调控器呈现明显上调趋势,推测与干旱胁迫下CK信号传导增强有关,同时乙烯受体基因在干旱胁迫环境下的表达下调,从激素间相互关系的角度更好地印证了上述推测;与拟南芥细胞分裂素受体基因(AHK2、AHK3和AHK5)序列相似的磷酸感应激酶基因HK5和HK3在干旱胁迫下表达上调,与拟南芥中不依赖细胞分裂素的AHK5序列接近的HK6则表达下调,进一步验证上述推测;干旱胁迫下抗旱能力不同的水稻株系其TCS基因表达谱没有明显差异,推测TCS基因差异表达可能源于对干旱胁迫反应,而其表达对抗旱能力的增强还有待进一步研究.     

外源ABA对干旱胁迫下不同品种灌浆期小麦psbA基因表达的影响

脱落酸(abscisic acid, ABA)是一种重要的植物激素,与作物的抗干旱胁迫密切相关。本试验以灌浆期的豫麦949和陕麦5号小麦品种为试材,PEG干旱处理72 h后,比较了脱落酸对小麦相对水分含量、叶绿素、丙二醛含量以及产量的影响,并采用反转录半定量PCR方法测定PSII中psbA基因转录水平的变化。结果表明,干旱胁迫明显降低小麦叶片中相对水分和叶绿素含量,增加丙二醛含量,抑制psbA基因的转录,降低小麦的产量,而外源脱落酸能明显缓解这些胁迫反应。与豫麦949相比,陕麦5号中质膜损伤较小,相对水分和叶绿素含量、产量以及psbA基因转录水平的下降也较小,外源脱落酸处理后,各参数也能够恢复到对照水平,说明不同小麦品种的抗干旱胁迫能力与psbA基因的表达水平密切相关。本试验的研究结果也首次发现了外源ABA能够调控干旱胁迫下灌浆期小麦psbA基因的表达,稳定PSII系统中重要基因的转录水平,从而提高灌浆期小麦的抗干旱胁迫能力。     

水稻OsNCED4基因的克隆及功能初探

脱落酸(abscisic acid,ABA)是一种抑制植物生长的植物激素,因能促使叶子脱落而得名,在植物逆胁迫中发挥关键作用。由NCED基因编码的9-顺-环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED),是ABA在高等植物中的关键酶。本研究已成功从水稻Ilmibyeo(O.sativa L.ssp.japonica)基因组中克隆得到Os NCED4,生物信息学分析表明,Os NCED4基因位于水稻第7号染色体上,ORF全长1749 bp,无内含子结构,编码582个氨基酸,具有NCED家族的RPE65保守结构;以该基因和其启动子序列构建组织表达载体pOsNCED4::GUS、pCaMV35S::OsNCED4:EGFP和RNAi干扰载体p Ca MV35S::OsNCED4:RNAi,用于基因表达和功能分析,并利用农杆菌介导的方法,成功获得了相应遗传载体的转基因植株;GUS染色结果表明,该基因在叶片、叶耳、小穗等组织部位均有表达;RT-PCR结果显示,Os NCED4在水稻不同生育期的根、茎、叶、叶鞘和穗子中均有不同程度的表达,但表达量具有明显的差异;亚细胞定位结果显示,OsNCED4基因编码的蛋白定位于细胞核;与野生型植株相比,RNAi植株的花粉育性无明显差异,而结实率显著下降。该研究结果为进一步研究水稻OsNCED4基因表达的调控,以及为水稻生长发育上的功能研究提供了科学依据。     

干旱胁迫下耐早稻中早3号全长cDNA文库的构建

干旱胁迫导致很多基因的表达发生变化。以干旱胁迫下的耐旱稻品种中旱3号为材料,我们用SMART技术(RNA转录5'末端模板转换技术)成功构建一个高质量的干旱胁迫诱导的节水抗旱稻中旱3号全长cDNA文库。体外包装后感染大肠杆菌XL1-Blue宿主菌,未扩展文库的滴度为1.94×106pfu/mL,重组率为85.15%。扩展后文库的滴度为1.45×1011pfu/mL。将λ噬菌体臂转入pTriplEx2质粒,从中随机挑选100个克隆,PCR扩增检测插入片段长度,结果显示文库插入片段在500~2000bp之间。     

转ZmPEPC与ZmPPDK基因拟南芥对干旱胁迫的反应

为探究干旱胁迫对转玉米高光效基因ZmPEPC与ZmPPDK拟南芥的影响,本研究选用2个转PEPC基因株系(PC90,PC73),2个转PPDK基因株系(PK17,PK26),1个转PEPC+PPDK基因株系(PCK110)和对照株系(GLC)为试验材料。在幼苗期分别用150mmol/L和250mmol/L甘露醇(Mannitol)模拟干旱胁迫处理,测定幼苗根长,结果显示,在胁迫处理下,转PEPC、PPDK和PEPC+PPDK基因拟南芥幼苗的平均相对根长分别较对照增加了43.8%,48.4%和50.6%。在成株期进行干旱胁迫处理,测定莲座叶片的叶绿素荧光参数,叶绿素、可溶性糖、可溶性蛋白、丙二醛含量和成株死亡率,结果显示,在胁迫处理下,供试材料F0增加,Fv/Fm减小,对照F0增幅最大,为20.4%,Fv/Fm最小,为0.78;转PEPC、PPDK和PEPC+PPDK基因拟南芥株系平均相对叶绿素含量分别较对照增加12.6%,15.4%和23.1%;可溶性糖含量分别较对照增加3.0%,16.3%和24.4%;可溶性蛋白含量分别较对照增加0.6%,10.8%和15.4%;丙二醛含量较对照降低,分别为对照的93.5%,90.3%和84.10%;死亡率分别为12.3%,13.3%和6.7%,极显著低于对照(87.7%)(P<0.01)。上述结果表明,玉米高光效基因ZmPEPC和ZmPPDK可增强拟南芥抵抗干旱胁迫的能力,且这两个基因的共表达可能存在协同作用。     

梭梭和水稻种子萌发初期对渗透胁迫和外源ABA反应敏感性研究

旱生植物梭梭和水生植物水稻的种子在萌发初期对水分、渗透胁迫和外源ＡＢＡ的反应敏感性显著不同。前者有很强的吸水能力,基细胞膜透性对胁迫不敏感,在脱水过程中持水也较大,外源ＡＢＡ对其抗渗透胁迫和抗脱水能力表现出有利的作用;而后者吸水能力弱,基细胞膜透性对渗透胁迫和外源ＡＢＡ敏感,外源ＡＢＡ还导至水稻种子萌发幼苗的死亡。结果表明这两类不同生态型植物在种子萌发对渗透胁迫的反应和适应能力具有明显差异。     

转 AhCMO 基因棉花苗期对干旱胁迫的生理反应

以转AhCMO基因的2个棉花品系L1和L2及其转化受体泗棉3号(SM3)为材料,研究了转AhCMO基因棉花对干旱胁迫的生理反应。试验采用盆栽方式在日光温室中进行,以维持土壤含水量为最大持水量的45%作为干旱处理,以正常供水维持土壤含水量为最大持水量的75%作为对照。结果表明,正常供水条件下转基因品系L1和L2与SM3生长表现一致。但是干旱胁迫下,转基因品系L1和L2的干物质积累量、平均净光合速率以及叶片叶绿素的含量都显著高于SM3;而且L1和L2叶片中甜菜碱含量显著高于SM3,过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性也较SM3显著提高。说明2个转AhCMO基因品系的耐旱性得到明显提高,耐旱性的提高与甜菜碱积累量的增加、POD和SOD活性的增强有关。     

野生稻SSSLs孕穗期对干旱胁迫的响应

为揭示水稻孕穗期的抗旱机理,以6份由南方野生稻和展颖野生稻构建的单片段代换系(SSSLs)及其亲本华粳籼74(HJX74)为试验材料,进行盆栽干旱处理,测定干旱处理0,5,10 d和复水5 d后的6个生化指标和结实期后的11个农艺性状,并结合相关性分析、主成分分析对7个材料的耐旱能力进行综合评价。结果表明,干旱胁迫条件下7个材料之间的农艺性状存在极显著差异,材料M78-1与HJX74在相对穗长、相对空粒数、相对穗粒数存在极显著差异,M148与HJX74在相对瘪粒数存在极显著差异,M107与HJX74在相对穗长和相对二次枝梗数存在极显著差异;在孕穗期鉴定到6个耐旱QTLs,包括相对穗长(qRPL1-1、qRPL2-1)、相对二次枝梗数(qRNSB2-1)、相对瘪粒数(qRNDG11-1)、相对空粒数(qRNEG1-1)和相对穗粒数(qRGNP1-1),分布在1,2,11号染色体上。超氧化物歧化酶(SOD)活性和过氧化物酶(POD)活性在干旱5 d后分别增加3.76%～18.20%,31.88%～100.00%,而丙二醛浓度降低41.07%～81.65%;干旱10 d后SOD和POD的活性出现下降趋势,分别降低9.20%～48.53%,44.74%～79.79%,而丙二醛浓度相比于干旱5 d出现显著升高;脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白等渗透调节物质在处理5,10 d阶段持续上升,复水5 d后各生化指标基本恢复正常水平。综合分析结果显示,在干旱胁迫下相对结实率、POD和脯氨酸的特征向量和贡献率最大,表明这3种指标更能代表水稻孕穗期的耐旱情况。综上,干旱胁迫会影响水稻孕穗期各项农艺性状与生化指标,同时水稻也会调节自身代谢过程响应干旱胁迫。     

水分胁迫对水稻叶片气孔频率,气孔导度及脱落酸含量的影响

试验结果表明，在水分胁迫条件下，水稻新生叶片的气孔频率增大，气孔频率最大值的出现推迟；土壤水分充足（对照）或水分胁迫３天的处理在叶片上有两个气孔频率的高峰，水分胁迫５天的处理仅有一个；随着水分胁迫的加重，保卫细胞长度变短，但叶片顶部和基部保卫细胞长度变化较小，中部的变化较大；水分胁迫后，气孔导度变小，复水后迅速上升，上升的速度因品种不同而有较大差异；在较高叶片水势下，品种盐粳２号叶片的脱落酸（ＡＢ     

Mapping three new interspecific hybrid sterile loci between Oryza sativa and O. glaberrima

Hybrid sterility hinders the transfer of useful traits between Oryza sativa and O. glaberrima. In order to further understand the nature of interspecific hybrid sterility between these two species, a strategy of multi-donors was used to elucidate the range of interspecific hybrid sterility in this study. Fifty-nine accessions of O. glaberrima were used as female parents for hybridization with japonica cultivar Dianjingyou 1, after several backcrossings using Dianjingyou 1 as the recurrent parent and 135 BC₆F₁ sterile plants were selected for genotyping and deducing hybrid sterility QTLs. BC₆F₁ plants containing heterozygous target markers were selected and used to raise BC₇F₁ mapping populations for QTL confirmation and as a result, one locus for gamete elimination on chromosome 1 and two loci for pollen sterility on chromosome 4 and 12, which were distinguished from previous reports, were confirmed and designated as S37(t), S38(t) and S39(t), respectively. These results will be valuable for understanding the range of interspecific hybrid sterility, cloning these genes and improving rice breeding through gene introgression.     

胁迫相关蛋白激酶基因OsSAPK2调控水稻抗白叶枯病反应

水稻蔗糖非酵解型蛋白激酶Sn RK2,又称胁迫相关蛋白激酶(stress-activated protein kinase genes in rice,Os SAPKs),在调控水稻非生物胁迫信号传导中起着重要作用。本研究对Os SAPK2的结构及其在水稻抗白叶枯病反应中的功能进行了初步研究。结果表明Os SAPK2被定位于细胞核和细胞质内,与Os SAPK1、Os SAPK3同属于Kulik’s II组。Os SAPK2-RNAi转基因水稻中Os SAPK2下调表达,人工接种水稻白叶枯病菌后,转基因水稻比受体对照的病斑长度显著增长,抗病相关基因Os LRR1、Os HIR1表达水平下降,感病相关基因Os MAPK5表达水平升高。此外,Os SAPK2具有自激活活性,可能与Os MAPK5等胁迫相关蛋白互作。上述结果为进一步研究Os SAPK2调控水稻抗白叶枯病的分子机制提供了信息。     

水稻叶脉白化突变体wpsm的遗传分析与基因定位

叶绿素是植物生长发育必不可缺的元件。叶色突变体的发掘与研究在叶绿体发育、叶绿素代谢、光合作用等研究中具有重要作用。利用化学诱变剂EMS诱变水稻(Oryza sativa L.)籼型恢复系缙恢10号,从其后代中筛选出一份突变性状稳定遗传的叶脉白化突变体wpsm (white primary and secondary midrib)。与野生型相比,该突变体苗期表现正常,孕穗后期剑叶、倒二叶、倒三叶整张叶片的主叶脉和次级叶脉白化,叶肉细胞无显著变化,该性状一直持续到成熟期。抽穗期突变体wpsm的光合色素含量极显著低于野生型,净光合速率(P_n)及表观电子传递速率(ETR)极显著降低,株高、每穗实粒数、千粒重、结实率等农艺性状均显著降低。该突变性状受一对隐性核基因调控,利用892株西农1A/wpsm的F₂隐性定位群体,将该基因定位在第6染色体上引物InDel 10与InDel 4之间,遗传距离分别为0.06 cM和0.12 cM,物理距离约为56 kb。本研究为WPSM基因的克隆和功能研究奠定了基础。     

外源NO供体硝普钠(SNP)对盐胁迫下水稻幼苗中叶绿素和游离脯氨酸含量以及抗氧化酶的影响

在100 mmol L^-1 NaCl胁迫下, 研究了不同浓度一氧化氮供体硝普钠(sodium nitroprusside, SNP)处理对水稻叶片叶绿素、游离脯氨酸含量, 叶片及幼根中愈创木酚过氧化酶(guaiacol peroxidase, GPX)、超氧化物歧化酶(superoxide dis-mutase, SOD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)活性以及超氧阴离子产生速率等生理指标的影响。结果表明, 适当低浓度SNP处理可以显著提高盐胁迫下水稻叶片中叶绿素和脯氨酸含量, 并明显缓解盐胁迫下叶片和幼根受到的氧化性损伤; 但在水稻幼苗不同器官, SNP调节的主要靶酶有所不同, 在叶片中促进SOD和CAT活性, 而在幼根中除SOD和CAT活性外, 还提高GPX活性。     

水稻类受体激酶基因OsBAK1L调控细胞坏死机制分析

拟南芥类受体激酶BAK1 (BRI1-associated kinase 1)在调控生长发育和免疫信号中有十分重要的作用。本研究选择水稻中BAK1的同源基因LOC_Os03g49620.4, 将它暂命名为OsBAK1L并探索其结构和功能。结果表明,OsBAK1L定位于细胞膜,是SERKL (Somatic embryogenesis receptor kinase Like)家族成员。OsBAK1L-RNAi转基因水稻中OsBAK1L下调表达。接种细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola)菌株Rs105后,转基因苗与受体9804-Rxo1都表现过敏性反应(hypersensibility response,HR),但转基因苗HR推迟。此外,HR相关基因OsMPK13 (Mitogen activated protein kinase 13)表达模式与HR变化趋势一致,在转基因苗中皆出现推迟现象。上述结果表明：OsBAK1L可能通过调节OsMPK13表达而推迟9804-Rxo1对细菌性条斑病菌的HR反应。     

云南哈尼梯田当前栽培水稻ALK基因的遗传多样性及与稻米糊化温度的关联分析

云南是世界公认的亚洲栽培稻遗传多样性和起源中心之一。利用51对SSR分子标记对云南哈尼梯田当前栽培的111份水稻材料进行多态性检测,并分析其群体结构。聚类分析表明,供试材料主要分为偏粳类群(group I)及偏籼类群(group II)两大类群,其中以偏籼类群居多,占83%,这两类群并未完全按地理来源聚类。所选材料稻米的糊化温度变异较广,可以分为低(66℃)、中低(66~70℃)、中高(70~74℃)和高(74℃)4类。通过基因测序,分析了稻米糊化温度控制基因ALK的序列多样性,发现其可以分为10种单倍型。关联分析结果表明,所选水稻样品稻米的糊化温度主要由ALK基因3个SNP位点组合控制。其中,A-GC和G-TT两种组合主要控制低(66℃)和中低(66~70℃)糊化温度,G-GC组合主要控制中高(70~74℃)和高(74℃)糊化温度。SNP3402 T类型与高、中高糊化温度有关。绝大多数偏籼类品种的ALK基因含有G-GC组合,因此都倾向于高糊化温度。上述研究结果为水稻分子育种和种质资源保护研究提供了一定的参考价值。