乳酸乳球菌的质粒消除

质粒消除是鉴定质粒和获得无质粒菌株的重要方法,是乳酸菌进行遗传学改造所需的一项重要技术。试验采用高温和消除剂结合的方法,对乳酸乳球菌镉抗性菌株进行质粒消除,探讨温度、消除剂吖啶橙的用量和作用时间对乳酸乳球菌镉抗性质粒消除的影响。结果表明,39℃高温可以质粒消除,而37和41℃均无此效果;独自吖叮橙作用未获得质粒消除菌株;39℃高温-吖啶橙同时作用比高温-吖啶橙交替作用消除率高,而39℃高温-20μg·mL-1吖啶橙共同作用12d,消除率可达98%。根据消除结果,以疑似功能性质粒为模板,进行PCR扩增,获得预期片段,进一步证实了其功能。     

重组乳酸乳球菌对模拟胃肠道的耐受力研究

[目的]研究重组菌株在不同p H胃液和胆盐浓度肠液中的生存情况,验证重组菌株能否在肠道中发挥作用,为其制备基因工程活载体疫苗、新型免疫型微生态制剂及功能发酵食品提供理论依据。[方法]人工模拟人体胃肠道环境,研究表达金黄色葡萄球菌纤黏蛋白原凝集素A(Clf A)的重组乳酸乳球菌MG1363/p MG36c-clf A菌株在不同p H胃液和胆盐浓度的肠液中的耐受力。[结果]重组菌株在p H 3.0的人工胃液中处理2 h后,存活率约为88.6%;在0.3%胆盐浓度的人工肠液中处理2和4 h后,存活率约为83.6%和68.2%。[结论]重组菌株对胃肠道环境有较强的耐受力,适合制备基因工程活载体疫苗、新型免疫型微生态制剂及功能发酵食品。     

乳酸乳球菌抗氧化的研究进展

乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)主要是通过发酵产能的,但是有研究发现,在添加氯化高铁血红素后乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)能形成一条呼吸链,在乳酸乳球菌(L.lactis)IL1403中发现了能够编码呼吸链蛋白的基因,同样的现象在粪链球菌中(Strepto coccus feacalis)也有发现。当氧出现在电子传递链中,质子的排出和质子运动势(PMF)的产生都会加倍。相比较其他的兼性或者专性厌氧菌,乳酸乳球菌(L.lactis)的呼吸作用可以促进代谢能量的产生,由于这种呼吸作用,乳酸乳球菌(L.lactis)有更好的生长得率和显著的存活率,这表明在发酵条件下产生的代谢能量不足,从而会限制乳酸乳球菌(L.lactis)的生长。氧在呼吸链中扮演了重要的有益角色,而不是起毒害作用。     

乳酸乳球菌抗氧化的研究进展

乳酸菌（Lactic acid bacteria,IAB）主要是通过发酵产能的,但是有研究发现,在添加氯化高铁血红素后乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）能形成一条呼吸链,在乳酸乳球菌（L．lactis）IL1403中发现了能够编码呼吸链蛋白的基因,同样的现象在粪链球菌中（Strepto coccus feacalis）也有发现。当氧出现在电子传递链中,质子的排出和质子运动势（PMF）的产生都会加倍。相比较其他的兼性或者专性厌氧菌,乳酸乳球菌（L．lactis）的呼吸作用可以促进代谢能量的产生,由于这种呼吸作用,乳酸乳球菌（L．lactis）有更好的生长得率和显著的存活率,这表明在发酵条件下产生的代谢能量不足,从而会限制乳酸乳球菌（L.lactis）的生长。氧在呼吸链中扮演了重要的有益角色,而不是起毒害作用。     

乳酸乳球菌同源整合载体的构建及鉴定

构建乳酸乳球菌同源整合载体,实现外源基因在乳酸菌中的同源重组和转入。PCR扩增红霉素抗性基因,连接到T载体中,构建载体pMDE;根据乳酸乳球菌Lactococcus lactis1.2472全基因组中usp基因序列设计引物,PCR扩增usp基因两端的同源重组臂LB和RB基因序列,PCR产物经回收后,克隆至pMDE载体中,获得同源重组载体pMDELR,电转化至Lactococcus lactis1.2472感受态细胞中,挑选阳性克隆,采用PCR和SDS-PAGE方法进行鉴定。结果表明:成功扩增同源重组臂LB和RB,红霉素抗性基因替换了乳球菌中的usp基因,整合到了乳球菌基因组中。     

气相色谱法测定乳酸乳球菌脂肪酸

为了建立气相色谱法分析乳酸乳球菌脂肪酸方法,试验参照不同文献所提供的甲酯化方法对乳酸乳球菌进行甲酯化处理,通过对其气相色谱图中相同峰的峰面积进行比较,对比各个甲酯化方法的的效果。并对乳酸乳球菌MG1363进行气相色谱分析。结果表明,在对几种甲酯化方法进行比较后,发现酸碱结合法甲酯化法不适合乳酸菌,而三氟化硼甲酯化法明显优于酸催化与碱催化甲酯化法。并且测定出乳酸乳球菌MG1363的主要脂肪酸种类。结果表明,三氟化硼催化甲酯化法最适于乳酸乳球菌脂肪酸。乳酸乳球菌MG1363中除含有14和16C等脂肪酸外,还含有一种19C的环丙烷脂肪酸。     

乳酸乳球菌acmAas基因的克隆与基因中断突变株特性研究

克隆了乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)菌株AS1. 2829的1种主要细胞壁自溶素-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶的编码基因acmAas,并对其编码蛋白AcmAas的结构进行了预测,发现该蛋白由1个具催化活性的N-末端和1个具细胞壁锚定活性的C-末端结构域组成,其中C-末端又由3个LysM(1ysin motif)结构域组成,具有典型的"βαβα"型二级结构.进一步通过体外在acmA基因中引入红霉素抗性基因(Emr)而构建具有与宿主菌染色体acmA基因进行整合作用的重组基因,并导人宿主菌后筛选得到发生染色体整合重组的重组菌株MB257,对该菌株的形态与生长特性进行了初步研究,结果表明该菌株所携带的acmAasN-lysm1基因在保留其N端结构域和1个lysM编码区后,其编码产物可发挥其完整生物学活性.     

乳酸乳球菌电击转化方法的优化

乳酸菌NICE系统是食品级表达系统,本实验以该系统的表达载体pNZ8148和宿主菌NZ9000为研究对象,对电击转化方法进行了优化。结果表明,在培养基中加入2.5%甘氨酸,收集OD₆₀₀值为0.3的细胞、用配方I[（洗涤液I:蔗糖0.5 mol·L?1+甘油10%;洗涤液II:蔗糖0.5 mol·L?1+甘油10%+EDTA50 mmol·L?1）]洗涤细胞,再转入0.2 μg质粒,利用2.5 kV电压和0.2 cm电击杯进行电击转化,恢复培养1.5 h后转化效率最高,达1.6×108 CFU·μg?1。本实验为乳酸乳球菌NZ9000的电击转化参数提供了数据参考,为基于乳酸菌NICE系统的深入研究奠定了基础。     

一株乳酸乳球菌对棒曲霉素的去除作用

以筛选得到的可有效去除棒曲霉素的食品生产用菌株乳酸乳球菌MG1363为实验材料,通过改变环境温度、pH对其降解特性进行研究,并通过灭活菌体、提取粗酶液等手段,对乳酸乳球菌MG1363降解棒曲霉素的机理进行初步探究。结果表明,温度、pH对乳酸菌去除棒曲霉素活力的影响显著(P<0.05),去除棒曲霉素的较佳反应环境为30 ℃、pH值5.5~6.0。乳酸乳球菌MG1363既能物理吸附棒曲霉素,也能通过酶解作用降解棒曲霉素,且发挥降解活性的酶为胞内酶。乳酸乳球菌MG1363酶解棒曲霉素为其自身固有的特性,但棒曲霉素可诱导乳酸乳球菌的降解活性。     

乳酸乳球菌乳亚种丁二酮变种发酵乳风味物质研究

【目的】研究发酵过程中乳酸乳球菌乳亚种丁二酮变种发酵乳双乙酰的变化规律,并检测发酵乳样品中风味物质的种类和含量。【方法】采用邻苯二胺法,分别测定25,30℃培养4,8,12,24,36和48 h发酵乳中双乙酰的含量,用GC-MS方法测定了发酵乳中挥发性风味物质的组成。【结果】乳酸乳球菌乳亚种丁二酮变种发酵前期有大量双乙酰积累,随着发酵时间的延长,双乙酰含量逐步增加。通过GC-MS方法在发酵乳挥发性风味物质中共鉴定出19种成分,其中酯类4种、醇类1种、杂环化合物1种、短链挥发性脂肪酸5种、羰基化合物8种。【结论】乳酸乳球菌乳亚种丁二酮变种发酵乳中,有较高含量的双乙酰,在发酵后期其含量更大,乙醇、2,3-丁二酮、2,3-戊二酮含量也明显高于其他单菌种乳酸菌发酵乳中的相应含量。     

乳酸链球菌最适抑菌培养条件的研究

为降低天然防腐剂乳酸链球菌素（Nisin）的生产成本,以金黄色葡萄球菌为试验菌,探讨了直接利用乳酸链球菌（Lactococcus lactis）培养液进行抑菌的最适培养条件。首先通过单因素试验,初步确定了最适碳源、氮源、金属离子及其浓度或配比的范围,然后采用正交试验L9（3^3）优化后得到的乳酸链球菌抑茵的最佳发酵条件为：3.0g／100g葡萄糖,4g／100g蛋白胨,2g／100g酵母膏,1g／100g牛肉膏,0.005mol／L MgSO4。优化后的培养基抑菌能力明显提高,此结果可为乳酸链球菌素的生产提供参考。     

乳链菌肽抗性菌株的定向筛选及鉴定

利用乳链菌肽抗性菌株中乳链菌肽抗性和乳糖发酵紧密连锁的原因，在含有乳链菌肽、乳糖和溴甲酚紫的选择培养基上，从205个新鲜的牛奶样品中定向筛选乳链菌肽抗性菌株。对筛选到的4株菌分析鉴定结果表明：4株菌均为革兰氏阳性菌，产乳酸，过氧化氢酶试验阴性；通过质粒的抽提和电泳，发现Lactococcus Lactis subsp.lactis ZL2009,ZL2009,ZL2010,ZL2024,ZL2030分别含有1，7，5，3条质粒带，且4株菌的质粒DAN分子大小不完全相同。     

乳酸乳球工程菌表达L-苯丙氨酸解氨酶的工艺优化

[目的]提高乳酸乳球工程菌表达L-苯丙氨酸解氨酶的水平.[方法]对培养基种类、接种量、培养温度、诱导剂浓度、磷酸甘油二钠浓度等因素进行了优化.[结果]使用DifcoTM M17 Broth培养基培养乳酸乳球菌时,L-苯丙氨酸解氨酶表达活性最高;磷酸甘油二钠对L-苯丙氨酸解氨酶表达活性有较大影响,可提高活性93.8％.通过正交试验,得到PAL最佳表达条件为接种量2.0％,培养温度30℃,磷酸甘油二钠浓度2.0％,诱导剂浓度10.0 μg/L. PAL表达酶活可达3.05 IU/ml.[结论]在发酵扩大培养中优化了L-苯丙氨酸解氨酶在乳酸乳球菌中的表达条件,为今后生产及应用提供参考.     

乳酸乳球菌质粒提取方法的改进与优化

[目的]建立一种简便、快速、安全的乳酸乳球菌质粒提取方法.[方法]质粒提取采用文献报道的乳酸菌质粒提取与常用的大肠杆菌质粒提取相结合的方法,并对提取过程中溶菌酶浓度、溶菌酶处理方式和时间进行优化.[结果]采用改良后的方法提取乳酸菌质粒效果显著.最佳溶菌酶浓度是10 mg/mL,最佳溶菌酶处理方式和时间是37℃振荡培养30 min.[结论]该方法避免了毒性物质溴化乙锭的使用,同时减少了通常提取乳酸菌质粒的复杂步骤,是一种高效、快速、安全的提取乳酸菌质粒的方法.     

牛乳中乳酸乳球菌nisRK基因的克隆与序列分析

以一株分离自牛乳中乳酸乳球菌染色体DNA为模板,采用PCR技术扩增出乳链菌肽生物合成的双组分调控元件(nisRK基因)。试剂盒回收纯化nisRK基因后将其克隆入以氨苄青霉素为选择压力的pGEM-T克隆载体中,再转化E.coliDH5α感受态细胞,筛选阳性克隆,提取重组体,进行酶切鉴定和PCR鉴定,并对nisRK基因进行序列测定,与已知序列进行同源性比较。结果表明成功地克隆出nisRK基因,全长为2 035 bp,与国外报道的nisRK基因同源性高达99.9%。