金黄色葡萄球菌表面烯醇化酶的研究进展

金黄色葡萄球菌是人和动物重要致病菌,常引起肺炎、脑膜炎、败血症、食物中毒等多种疾病。目前的研究发现,金黄色葡萄球菌有许多致病机理,因此迫切需要寻找一种替代预防或治疗金黄色葡萄球菌的试剂。近年来,人们对金黄色葡萄球菌表面烯醇化酶参与侵染过程的研究日益重视。烯醇化酶可以作为纤溶酶原和层黏连蛋白来调节细菌黏附和侵袭作用。文章就金黄色葡萄球菌表面烯醇化酶的研究进展做一简单的综述。     

鸡毒支原体烯醇化酶的可溶性表达及检测

烯醇化酶参与支原体糖酵解、细胞黏附及免疫调节等多种生命活动,对其开展功能研究有助于了解鸡毒支原体黏附及感染机制。本研究通过重叠PCR克隆获得鸡毒支原体烯醇化酶,经原核表达获得可溶性融合蛋白rMGEno,将纯化产物免疫BALB/c小鼠后制备获得特异性多抗。通过Western blot和ELISA检测发现,烯醇化酶在鸡毒支原体不同强弱毒株中高度保守,表达产量高,在鸡毒支原体参试各毒株的细胞膜中均有分布。这一表达产物的成功制备为深入研究鸡毒支原体烯醇化酶的生物学功能奠定了基础。     

鸡毒支原体烯醇化酶单克隆抗体研制及黏附阻断

通过对鸡毒支原体烯醇化酶的克隆和原核表达,利用表达产物免疫小鼠,制备单克隆抗体,以超声波裂解的MG全菌作为筛选抗原,结果获得了6株特异性单抗,分别命名为：1A4、2D7、2E4、2F4、384和3D8。经间接ELISA、免疫荧光试验及Western blot检测发现：1A4具有荧光效价和高滴度的ELISA效价,但无免疫印迹效价;而其他5株单抗,免疫印迹呈阳性,但无表面染色的活细胞免疫荧光。在所有6株单抗中,仅1A4单抗有MG细胞黏附抑制作用,可导致MG的黏附率降低34．40％,而且1A4与其他5种单抗混合后,则黏附率可下降57．69％。这些抗体的制备将为烯醇化酶生物学活性研究奠定基础。     

神经元特异性烯醇化酶在大鼠动情周期子宫中的分布

选择健康、未产、体重220-250g成年雌性SD大鼠，采用阴道涂片方法鉴定其动情周期，并采用免疫组织化学SP法研究了神经元特异性烯醇化酶（NSE）在大鼠动情周期子宫内分布的变化规律。结果显示，子宫各层均有不同程度NSE免疫阳性产物分布，并随动情周期的变化表现出一定的规律：各期子宫内膜黏膜上皮细胞、腺上皮细胞、基质细胞、血管内皮细胞及肥大细胞等NSE免疫阳性细胞数量变化不大，但着色深浅有一定差别，动情期着色最深，动情后期、动情间期、动情前期着色依次减弱；肌层和子宫外膜中，动情期着色最深，动情后期着色最浅，动情间期表达量明显回升，动情前期比动情期着色稍浅。表明，NSE在子宫中的分布可能受性类固醇激素的调节。     

鼠隐藏管状线虫烯醇化酶基因的克隆与序列分析

为获得鼠隐藏管状线虫(Syphacia obvelata)烯醇化酶结构及其功能,采用同源克隆方法结合RACE技术克隆获得了烯醇化酶基因c DNA序列,并对其进行了序列分析。测序结果显示,扩增获得的鼠隐藏管状线虫烯醇化酶基因大小序列为1603 bp,包含全长为1311 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF)序列,共编码436个氨基酸,推导分子量为47.428 k Da。序列分析结果显示,鼠隐藏管状线虫烯醇化酶含有10个丝氨酸激酶磷酸化位点、3个苏氨酸激酶磷酸化位点和4个酪氨酸激酶磷酸化位点,1个潜在的跨膜螺旋结构,无信号肽剪切位点;在亚细胞水平,预测其主要定位于胞浆;二级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主,其中α-螺旋占34.86%,无规则卷曲占30.50%,延伸链占24.08%,β-转角占10.55%。Swiss-Model模建的3D结构显示,鼠隐藏管状线虫烯醇化酶为一哑铃样结构,包含氨基端和羧基端两个结构域,结构域之间为Linker区。每个结构域由多个α-螺旋、β-折叠和卷曲所构成桶形结构,催化中心和Mg~(2+)结合位点位于桶形结构的中心。本研究结果为鼠隐藏管状线虫烯醇化酶基因的功能研究奠定基础。     

扩展莫尼茨绦虫烯醇化酶基因的原核表达及抗原性鉴定

为表达扩展莫尼茨绦虫(Moniezia expansa)的烯醇化酶(Enolase),本研究采用RT-PCR方法以M.expansa 组织总RNA为模板扩增enolase基因,将其克隆到原核表达栽体pET-28a中,并转化BL21 (DE3)感受态细胞,以IPTG进行诱导表达.SDS-PAGE结果显示表达的重组Enolase约为47 ku.Western blot分析表明,天然蛋白能够被重组表达产物免疫小鼠的血清识别,出现两条免疫印记条带,即天然蛋白以两种形式(约47 ku和40 ku)存在,并具有抗原性,为该蛋白功能研究奠定了基础.     

滑液支原体烯醇化酶在感染宿主中的反应原性和细胞黏附性

滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)是一种重要的禽病病原,严重危害我国养禽业。本研究旨在分析MS烯醇化酶(enolase, Eno)参与病原致病和诱导感染宿主免疫相关的功能。对MS的Eno蛋白进行种内和种间同源性和进化树分析,并预测Eno的蛋白结合位点和B细胞表位。MS Eno在不同MS菌株间同源性较高,且有别于其他物种。B细胞表位广泛分布在Eno蛋白的各个部分,且大都与预测的蛋白结合位点有重合。进行Eno原核表达和纯化,制备兔抗Eno多克隆抗血清。利用Western blot分析Eno在MS感染鸡或灭活苗免疫鸡中的反应原性。结果显示,MS Eno与兔抗Eno多克隆抗血清、兔抗MS多克隆抗血清、灭活疫苗(HN01株或YBF-MS1株)高免鸡血清、HN01强毒攻毒后阳性鸡血清、3个不同地方来源的临床阳性鸡血清均能发生反应,说明其在疫苗免疫和病原感染鸡中均表现有反应原性。利用菌落印迹和双荧光检测分析并证实Eno为外膜蛋白。利用间接免疫荧光和ELISA板结合试验分析Eno对鸡滑膜鞘细胞(synovial sheath cells, SSCs)是否具有黏附素作用。试验证实...     

猪附红细胞体α-烯醇化酶基因的克隆及生物信息学分析

为了研究猪附红细胞体α-烯醇化酶的功能,根据GenBank中猪附红细胞体α-烯醇化酶基因的DNA序列设计引物,以猪附红细胞体吉林株DNA为模板,进行PCR扩增,将该基因克隆到pMD-18T载体后,进行序列测定及分析。结果表明:此序列编码393个氨基酸,与GenBank上登录的α-烯醇化酶序列核苷酸同源性为98%,氨基酸同源性为100%。蛋白质的分子理论值为42.4 ku,理论等电点为6.62。α-烯醇化酶二级结构以α螺旋为主,主要有6个抗原表位区域。系统进化分析显示,该基因与牛支原体的亲缘关系最近,与犬支原体亲缘关系最远。     

马链球菌兽疫亚种烯醇化酶对小鼠肺泡巨噬细胞吞噬功能的影响

旨在研究马链球菌兽疫亚种（Streptococcus equi ssp.zooepidemicus,SEZ）烯醇化酶（enolase,Eno）对小鼠肺泡巨噬细胞（RAW264.7）吞噬能力的影响。通过构建原核表达质粒获得重组烯醇化酶（rEno）,采用台盼蓝活细胞计数法,判定在不同处理浓度和时间下rEno蛋白对RAW264.7细胞的细胞毒性。将rEno蛋白与RAW264.7细胞共孵育后,用SEZ作用于细胞并检测细胞吞菌数量,判断RAW264.7细胞对SEZ的吞噬活性。进一步通过活细胞稳定同位素标记技术（SILAC）和蛋白质谱分析技术（LC-MS/MS）,筛选到RAW264.7细胞中可能与SEZ Eno存在相互作用的候选蛋白。结果发现,10 μg·mL^-1 rEno蛋白处理对RAW264.7细胞有明显的细胞毒性,且10 μg·mL^-1 rEno蛋白处理RAW264.7细胞2和4 h可显著抑制其对SEZ的吞噬作用（P<0.01、P<0.05）。初步筛选到RAW264.7细胞中动力蛋白激活蛋白亚单位蛋白（dynactin subunit protein 2,Dctn）、整合素α-M蛋白（integrin alpha-M）等17种可能与Eno发生互作的蛋白。本研究获得了rEno重组表达蛋白,发现rEno可减少RAW264.7细胞对SEZ的吞噬,互作蛋白的初步筛选也为进一步揭示Eno在SEZ抗吞噬中的作用机制奠定了基础。     

胎衣不下奶牛母体胎盘α-烯醇化酶异常表达分析及验证

试验通过对胎衣不下奶牛母体胎盘组织中差异α-烯醇化酶(enolase,ENO1)的分析验证,探讨ENO1在胎衣不下中的作用。本研究选取了年龄、胎次、体重和泌乳量均相近的产后胎衣不下和产后胎衣正常排出奶牛各3头,分为两组,提取了胎衣不下组与胎衣正常排出组母体胎盘组织中的总蛋白,采用双向凝胶电泳的方法筛选出差异蛋白,并利用Western blotting及实时荧光定量PCR的方法对其中差异表达量大的ENO1进行验证。结果发现,胎衣不下组和胎衣正常组母体胎盘组织中ENO1差异表达量大且倍数较大,Western blotting及实时荧光定量PCR验证发现ENO1在胎衣不下奶牛母体胎盘中的表达量升高,t检验结果分别为P=0.015<0.05,差异显著;P=0.001<0.01,差异极显著。该基因参与机体的能量调节、免疫和纤溶等过程,而这些过程与奶牛胎衣不下密切相关,提示ENO1可能参与该病的发生发展。     

寄生虫抗肿瘤研究进展

虽然旋毛虫抗肿瘤的分子机制仍不清楚,但旋毛虫具有抗肿瘤的效应却已被许多实验所证实。小鼠感染旋毛虫后对肿瘤细胞在体内的增殖或对移植进体内的肿瘤生长的抑制作用,其可能的机理是旋毛虫感染机体后激发宿主免疫网络系统促使机体产生多种免疫活性细胞因子,发挥特异性和非特异性抗肿瘤免疫功能;或者是由于寄生虫本身就具有能够分泌排泄一些抗肿瘤活性物质而发挥抗肿瘤效应;或者是由于寄生虫感染诱导肿瘤的基因表达发生变化而产生了抗肿瘤的效应。     

野生动物寄生虫的研究进展

野生动物由于种类多,活动范围大,感染或交叉感染寄生虫的机会也比较多,系统、规范的研究野生动物寄生虫越来越受到研究人员的重视。本文综述了国内外野生动物寄生虫研究的现状,以期对相关研究人员有所启发或参考。     

寄生虫蛋白酶体的研究进展

近年来,蛋白酶体的分子组成、亚基、生化机理、胞内功能等方面的研究受到广泛关注,发展迅速.蛋白酶体的主要生物学功能包括:降解细胞内蛋白质、调节细胞周期、促进细胞凋亡、调节转录因子、增加抗原提呈等.在寄生虫中,蛋白酶体不仅参与胞内寄生虫的生长发育调节,同时对宿主造成损伤,并可诱导宿主产生对其的免疫应答.对寄生虫蛋白酶体的研究有助于深入了解寄生虫的入侵机制,为寄生虫病的防治提供新思路.作者对蛋白酶体的结构、功能及寄生虫蛋白酶体的研究进展作一综述.     

寄生虫的反式剪接研究进展

从锥虫可变表面糖蛋白 ( VSG)中发现反式剪接以来 ,已经发现很多低等真核生物体内都存在这种剪接形式。这种广泛存在于低等真核生物中的反式剪接 ,对于生物蛋白多样性、阶段性表达有着重要的生物学意义。反式剪接中的反式剪接引导序列 ( spliced leader,SLRNA)为一段保守序列 ,SL RNA为寄生虫的功能基因的筛选、c DNA文库的构建提供了表达基因标签 ( EST) ,同时反式剪接为转基因治疗提供了有力的手段。反式剪接的发现和广泛研究 ,对于深入了解低等真核生物的核酸分子生物学及其起源、进化、系统发生、寄生虫病的预防研究等都有着重要意义。文章对反式剪接在低等真核生物体中的研究现状、SL RNA基本结构、生物学特点及其在现代分子生物学领域的应用进行了概述     

寄生虫疫苗的研究进展

寄生虫病由于广泛的流行性和传染性而成为严重威胁人类和动物的重要疫病之一。寄生虫病的防治工作多年来一直以药物为主 ,并在生产实践中确实发挥了显著的效果。但由于耐药性和研制新药昂贵的费用 ,特别是药物残留对人类健康带来的影响已受到广大学者的极大关注 ,加之人们环境保护意识的不断增强 ,寻找有效防治寄生虫病的新途径以取代药物防治是当务之急。寄生虫病的免疫防御是目前研究的重中之重 ,因此 ,本文就近年来寄生虫疫苗的研究进展作一简要综述。1　寄生虫免疫的特点寄生虫之所以能在宿主体内长期生存并繁殖 ,其机理十分复杂。首先 …     

寄生虫MicroRNA的研究进展

<正>寄生虫严重危害人和动物的生命及健康,并造成巨大经济损失。目前,对人和动物寄生虫病的防治仍然主要依靠使用抗寄生虫药物。在养殖业中,由于抗寄生虫药物的长期过度使用造成的寄生虫抗药性问题及动物产品和环境中的药物残留问题,已引起人们的关注,并一直在寻找更为有效的防治寄生虫病的新途径。     

2型猪链球菌烯醇化酶的原核表达及其对体外血脑屏障模型通透性影响的检测

通过原核表达的方式获得能在多种病原菌表面表达的烯醇化酶(Enolase,Eno),探索Eno在脑膜炎致病过程中的作用。根据GenBank上公布的基因序列设计Eno特异性引物,通过PCR技术扩增2型猪链球菌(Streptococcus suis serotype 2,SS2)的Eno基因序列,克隆到pMD18-T载体,进一步亚克隆到原核表达载体pET28a(+),构建重组表达质粒pET28a-Eno,转化入大肠杆菌BL21Codon Plus(DE3)感受态中诱导表达,经镍离子螯合柱纯化后,检测其对体外血脑屏障模型通透性的影响。结果显示,经1mmol/L IPTG诱导5h为最佳诱导条件,目的蛋白约54 000,与预期蛋白大小相符合;纯化的蛋白Western blotting分析表明,其具有较好的免疫原性;Eno可致体外血脑屏障模型通透性增加。结果表明,Eno作为SS2潜在的毒力因子在SS2引起脑膜炎的致病过程中起到重要的作用。     

2型猪链球菌烯醇化酶的原核表达及其对体外血脑屏障模型通透性影响的检测

通过原核表达的方式获得能在多种病原茵表面表达的烯醇化酶（Enolase,Eno）,探索Eno在脑膜炎致病过程中的作用。根据GenBank上公布的基因序列设计Eno特异性引物,通过PCR技术扩增2型猪链球菌（Streptococcussuis serotype2,SS2）的Eno基因序列,克隆到pMD18-T载体,进-步亚克隆到原核表达载体pET28a（＋）,构建重组表达质粒pET28a—Eno,转化入大肠杆菌BL21CodonPlus（DE3）感受态中诱导表达,经镍离子螯合柱纯化后,检测其对体外血脑屏障模型通透性的影响。结果显示,经1mmol／LIPTG诱导5h为最佳诱导条件,目的蛋白约54000,与预期蛋白大小相符合;纯化的蛋白Westernblotting分析表明,其具有较好的免疫原性;Eno可致体外血脑屏障模型通透性增加。结果表明,Eno作为SS2潜在的毒力因子在SS2引起脑膜炎的致病过程中起到重要的作用。