聚磷酸激酶基因的阻断对刺糖多孢菌生长及多杀菌素合成的影响

聚磷酸激酶基因(Polyphosphate kinase gene,ppk)是放线霉菌中的一种影响抗生素合成的全局性负调控因子,阻断该基因能显著提高其次级代谢产物产量。本文利用PCR扩增了刺糖多孢菌中的ppk基因中间片段,经酶切连接技术将其克隆到大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pOJ260上,构建阻断型载体pOJ260-ppk;通过接合转移将该功能质粒导入刺糖多孢菌中,获得了遗传性能稳定的重组菌株S.sp-△ppk。对工程菌株的PCR检测结果显示,ppk基因片段已整合到刺糖多孢菌染色体上并成功阻断了该基因的表达。摇瓶发酵结果显示,工程菌株多杀菌素产量较原始菌株提高了122%。阻断聚磷酸激酶基因的表达对刺糖多孢菌的菌丝形态及生长发育产生了影响,并有效地促进该菌多杀菌素的生物合成。     

GlnA基因对刺糖多孢菌生长发育及多杀菌素合成的影响

谷氨酰胺合成酶（GS，glutamine synthetase）是由GlnA基因编码的生物体中最古老也是最广泛存在的酶，它参与许多生物体中的氮和碳代谢，是生物体氮代谢的关键酶之一，对微生物的生命活动起着重要作用。本文研究了GlnA基因对刺糖多孢菌Saccharopolyspora spinosa的生长发育及次级代谢产物合成的影响，从刺糖多孢菌基因组中克隆了glnA 基因的部分片段，将其与穿梭载体pOJ260连接，构建敲除载体pOJ260-glnA，通过接合转移将其导入刺糖多孢菌野生菌中，获得刺糖多孢菌敲除菌株S.spinosa-△glnA；同时，利用重叠延伸PCR将glnA基因置于红霉素强启动子P_ermE下，并将融合片段P_ermE-glnA与穿梭载体pOJ260进行酶切酶连，构建过量表达载体pOJ260-P_ermE-glnA，通过接合转移将其导入刺糖多孢菌中，获得了刺糖多孢菌过量表达菌株S.spinosa-glnA。表型分析发现，glnA基因的敲除对刺糖多孢菌的菌丝形态、孢子萌发等方面都有显著的抑制作用。HPLC检测分析发现，过量表达菌株中多杀菌素产量相比原始菌株提高到170%；该研究表明glnA基因对刺糖多孢菌的生长发育与多杀菌素的合成有一定的影响，为研究其在链霉菌次级代谢过程中的作用奠定了重要基础。     

磷酸甘露酶基因的阻断对刺糖多孢菌的形态及其多杀菌素合成的影响

磷酸甘露酶(PMM)是由manB基因编码的广泛存在于真核生物中的蛋白酶,在糖代谢过程中磷酸-6-甘露糖可在磷酸甘露酶的作用下转化为磷酸-1-甘露糖,与细胞的初级代谢过程及次级代谢产物的合成过程密切相关,可通过对刺糖多孢菌中与初级代谢途径相关的基因进行分析改造,促使多杀菌素的合成显著提高。本研究在刺糖多孢菌基因组中克隆了磷酸甘露酶编码基因manB的部分片段,将其与穿梭载体pOJ260连接,构建了阻断型载体pOJ260-manB。通过接合转移将其导入刺糖多孢菌野生菌中,获得刺糖多孢菌突变菌株S.spinosa-△manB。将突变菌株接种至不同培养基,观察突变菌株与野生菌株的孢子形成情况,发现突变菌株的孢子萌发有所提前,且孢子产生量比野生菌略多;在HPLC上检测多杀菌素的产量发现突变菌株的产量相对于野生菌株提高了180%,这说明manB基因对刺糖多孢菌的生长发育有一定的影响,并对调控多杀菌素的合成具有重要作用。     

MNNG对多杀菌素产生菌的诱变效应

多杀菌素(spinosad)是刺糖多孢菌 Saccharopolyspora spinosa发酵产生的次级代谢产物,有显著杀虫活性.采用N-甲基-N′硝基-N-亚硝基胍(MNNG)作为诱变因子对刺糖多孢菌的孢子进行诱变处理,以高效液相色谱方法检测多杀菌素的发酵产量.研究结果表明:诱变剂量为2mg/ml,诱变40min时多杀菌素产量有较大幅度提高.通过诱变最终得到5株产量分别比出发菌株提高61.1%、80.3%、128.1%、69.9%和77.8%的突变株.     

植物油对刺糖多孢菌生长及其合成多杀菌素能力的影响

为研究不同种类植物油对刺糖多孢菌生长及其合成多杀菌素能力的影响,探索提高多杀菌素产量的方法,在发酵培养基中分别添加葵花油、花生油、大豆油、芝麻油、橄榄油和菜籽油,研究了其对菌体生长、脂肪酶活性和多杀菌素产量的影响,并利用RT-PCR对脂肪酶基因及多杀菌素合成相关基因的转录水平进行分析。结果表明:6种供试植物油对菌体生长和多杀菌素产量的影响程度不同,依次为菜籽油橄榄油花生油芝麻油葵花油大豆油,其中菜籽油有利于诱导脂肪酶的表达、延缓菌体的衰亡和延长产素期,脂肪酶活力、菌体生物量和多杀菌素产量分别提高310.09%、8.97%和33.94%;脂肪酶基因和多杀菌素合成基因的转录强度也有明显提高。因此,菜籽油是其最佳的辅助性脂类碳源。     

武夷菌素产生菌CK-15中转录调控因子wysR3的功能研究

wys R3是武夷菌素产生菌Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis CK-15中可能的调控因子。为了验证wys R3是否参与武夷菌素生物合成基因的转录调节,构建了用于过表达wys R3的基因重组质粒p SETC-R,并通过接合转移的方法转化至武夷菌素产生菌S.wuyiensis CK-15中,构建过表达菌株。过表达菌株生长速度明显缓慢;通过摇瓶发酵和HPLC检测分析发现,武夷菌素产量与野生型菌株相比没有发生明显变化;DNS法测定发酵液中糖含量也没有发生明显变化,说明该基因与武夷菌素的产量和糖含量在该种条件下没有直接关系,但是影响菌株表型生长。     

AdpAsd对于淀粉酶产色链霉菌1628的形态分化和丰加霉素合成的影响

为阐明AdpA与淀粉酶产色链霉菌Streptomyces diastatochromogenes 1628形态分化和合成丰加霉素（Toyocamycin，TM）的相关性。本研究设计简并引物成功克隆了来源于淀粉酶产色链霉菌1628大小为1263 bp的adpA_sd基因（GenBank登录号：JX847412）。结果发现，AdpA_sd的氨基酸序列与灰色链霉菌Streptomyces griseus的AdpA_g及天然色链霉菌Streptomyces coelicolor的AdpA_c的同源性分别为80.7%和78.9%。将adpA_sd基因置于载体pIB139启动子PermE^*下游，构建了重组质粒pIB139-adpA_sd，将其通过接合转移法分别转入菌株1628-T15（高产TM）和1628-T62（低产TM，孢子合成受阻）中，获得重组菌1628-T15A和1628-T62A。结果表明，与出发菌株1628-T62相比，重组菌1628-T62A产孢能力得到一定程度的恢复；重组菌1628-T15A与出发菌株1628-T15相比，整体形态无明显变化。摇瓶发酵试验表明，重组菌1628-T62A较出发菌株1628-T62的TM合成能力显著提高，最终TM产量提高了近3倍，而重组菌1628-T15A的TM产量比出发菌株1628-T15仅有小幅提升。以上结果证实adpA_sd参与淀粉酶产色链霉菌1628形态分化以及TM合成，为今后深入理解adpA_sd的分子调节机制奠定了基础。     

武夷菌素生物合成调控基因wysPⅢ的功能

为了深入研究武夷菌素生物合成调控机理,通过筛选对武夷菌素产量有影响的基因,明确基因的功能,利用分子育种技术来获得武夷菌素高产菌株。本研究通过基因敲除和过表达技术,获得了wysPⅢ基因的缺失突变株、互补菌株和过表达菌株,验证了该基因在武夷菌素生物合成过程中的功能和武夷菌素产量的关系。结果表明:wysPⅢ基因的过表达菌株生长速率加快,产孢时间提前,而缺失突变株较野生菌株生长变慢,产孢量下降,孢子颜色由正常的深灰色变为灰白色,菌丝变稀疏,但是构建好的菌株与野生型菌株相比,武夷菌素产量没有显著变化。由此可知:wysPⅢ基因调节菌株的生长和产孢特征,而不影响武夷菌素的产量,过表达菌株生长速率加快可缩短武夷菌素发酵时间,降低生产成本。     

武夷菌素生物合成调控基因wysPIII的功能

为了深入研究武夷菌素生物合成调控机理,通过筛选对武夷菌素产量有影响的基因,明确基因的功能,利用分子育种技术来获得武夷菌素高产菌株。本研究通过基因敲除和过表达技术,获得了wysPⅢ基因的缺失突变株、互补菌株和过表达菌株,验证了该基因在武夷菌素生物合成过程中的功能和武夷菌素产量的关系。结果表明：wysPⅢ基因的过表达菌株生长速率加快,产孢时间提前,而缺失突变株较野生菌株生长变慢,产孢量下降,孢子颜色由正常的深灰色变为灰白色,菌丝变稀疏,但是构建好的菌株与野生型菌株相比,武夷菌素产量没有显著变化。由此可知：wysPⅢ基因调节菌株的生长和产孢特征,而不影响武夷菌素的产量,过表达菌株生长速率加快可缩短武夷菌素发酵时间,降低生产成本。     

TasA抑菌蛋白对烟草黑胫病的防治效果研究

【目的】烟草黑胫病是烟草疫霉菌侵染形成的一种严重危害烟草根茎的土传性疾病,给全球烟草种植业造成严重的经济损失。研究通过构建TasA蛋白原核表达重组菌,研究TasA对烟草黑胫病的抑制效果;并通过改变TasA蛋白的异源表达水平,以期提高该蛋白对烟草黑胫病的抑制效果。【方法】通过PCR扩增技术获得枯草芽孢杆菌抑菌蛋白TasA基因,构建大肠杆菌重组菌;并以烟草疫霉菌（Phytophthora nicotianae）为指示菌,研究TasA蛋白对烟草黑胫病的抑制效果。此外,通过改变克隆载体的拷贝数,研究TasA蛋白的表达量对其抑菌作用的影响。【结果】成功构建了三株大肠杆菌重组菌（pACYC-Tas A、pCDF-TasA及pT7473-TasA菌株）,且TasA蛋白在三株重组菌中都成功进行了异源表达,分子量为35 ku左右。pACYC-TasA菌株、pCDF-TasA菌株及pT7473-TasA菌株对烟草疫霉菌菌丝体均有抑制效果,抑制率分别为14.85%、25.55%及13.45%。【结论】抑菌蛋白TasA对烟草黑胫病具有显著抑制效果,且过表达pCDF-TasA重组质粒的工程菌对烟草黑胫病抑制效果...     

西瓜枯萎病生防菌的分离鉴定及其生防潜力研究

为筛选获得高效防治西瓜枯萎病菌的生防菌株,本研究以胶体几丁质为唯一碳源的培养基,从广东珠海红树林根际土分离的1000余株细菌中筛选到32株具有高几丁质酶活性菌株,采用平板对峙法进行复筛,最终获得10株综合效果好的菌株。温室结果表明,这10株菌株均具有促生及防病效果,其中菌株PL-29处理组相对于对照组防病效果最好,防治效果为63.11%,促生效果同样显著。经形态学、生理生化特征和16S rDNA系统发育分析,最终将菌株PL-29鉴定为黄三素链霉菌Streptomyces flavotricini。此外,抑菌谱试验结果表明,该菌株对辣椒疫霉Phytophthora capsici、灰葡萄孢Botrytis cinerea、立枯丝核菌Rhizoctonia solani等多种病原菌都具有拮抗能力。对菌株PL-29的抑菌作用进一步研究表明,菌株PL-29能抑制尖孢镰刀菌孢子的产生及萌发,从而抑制病原菌的生长。此外,还可以破坏尖孢镰刀菌质膜完整性,诱导ROS积累。综合上述结果表明,黄三素链霉菌S. flavotricini PL-29在防治西瓜枯萎病方面具有较高的潜在应用价值。     

武夷菌素产生菌CK-15遗传操作系统的优化

旨在优化武夷菌素产生菌不吸水链霉菌武夷变种CK-15的遗传操作系统,实现武夷菌素生物合成基因的高效敲除。以自杀性质粒pKC1132为载体,优化了外源DNA通过接合转移进入菌株CK-15的方法,确立了构建基因敲除突变株的最佳方案,最终成功得到了武夷菌素生物合成基因的双交换突变株。获得了菌株CK-15稳定高效的遗传操作系统,为进一步研究武夷菌素生物合成机理和对武夷菌素利用组合生物合成改造奠定基础。     

茶炭疽病拮抗链霉菌的筛选鉴定与拮抗能力测定

茶炭疽病是茶树的一种重要叶部病害,发生时严重影响茶叶产量和品质,给茶叶生产带来经济损失。为获得对茶炭疽病菌刺盘孢菌Colletotrichumcamelliae具有良好拮抗效果的链霉菌,采用稀释涂布平板法从茶园根际土壤中分离放线菌菌株,利用平板对峙法筛选具有较高拮抗活性的菌株;结合其形态特征、培养特征、生理生化特性和分子生物学对其进行种属鉴定;采用扫描电镜观察菌株JS4-F对茶炭疽病菌的生长抑制作用,离体叶片法和盆栽防效测定其发酵液对茶炭疽病的室内防治效果,平板对峙法测定其抗菌谱。结果表明,分离筛选获得一株对茶炭疽病菌具有较好拮抗作用的菌株JS4-F,根据该菌的形态特征、生理生化特性初步将其鉴定为链霉菌属,通过联合16S rRNA、gyrB、ropB、recA、trpB基因测序结果构建系统发育树,JS4-F菌株被鉴定为藤黄生孢链霉菌Streptomyces luteosporeus。菌株JS4-F对茶炭疽病菌的拮抗效果达75.59%,扫描电镜表明其能使茶炭疽菌菌丝畸形、皱褶、菌丝之间相互缠绕;氮源利用试验表明,菌株JS4-F能利用L-精氨酸、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-色氨酸,能在6%...     

枯草芽孢杆菌G3菌株的抗菌物质及其特性

 产几丁质酶枯草芽孢杆菌G3菌株的固体培养物在黄瓜灰霉病菌和番茄叶霉病菌抑菌试验中证实,抑菌活性物质存在于过滤上清液中,它们是从酸沉淀物中提取出的伊枯草菌素、生物表面活性素和存在于盐析粗蛋白中的几丁质酶。在叶霉孢子萌发试验中,伊枯草菌素微弱地抑制孢子萌发但强烈破坏芽管和新生菌丝;生物表面活性素和几丁质酶则强烈抑制孢子萌发并长久性地抑制芽管伸长。在PDA平板上的灰霉菌丝抑菌试验中,伊枯草菌素抑制菌丝生长,引发菌丝顶端膨大,形成泡囊,泡囊破裂后原生质外泄;几丁质酶抑制菌丝生长,引发产生不规则的菌丝团;生物表面活性素在平皿上对菌丝则不显示出抑菌活性。     

乙基多杀菌素

理化性质：乙基多杀菌素是从放线菌刺糖多孢菌（saccharopolyspora spinosa）发酵产生的．是多杀菌素（spinasad）的换代产品。其原药的有效成分是乙基多杀菌素-J和乙基多杀菌素-L的混合物（比值为3：1）,     

淡紫拟青霉NH-PL-03菌株的多糖及其对尖孢镰刀菌的抑制作用

提取淡紫拟青霉NH-PL-03菌株的胞内、外多糖,分别以菌丝生长法与孢子萌发法研究其对尖孢镰刀菌的抑制效果。结果表明,淡紫拟青霉多糖对尖孢镰刀菌有明显抑制作用。在PDA平板上观察到不同程度的抑制现象,并在显微镜下观察到尖孢镰刀菌菌丝局部膨大,细胞质浓缩,细胞壁消解等现象。淡紫拟青霉多糖对尖孢镰刀菌孢子萌发有强烈抑制作用,并随多糖浓度的提高而增强。     

淀粉酶产色链霉菌1628中toyF基因的克隆与丰加霉素合成相关性

为考察编码腺苷琥珀酸裂解酶toyF基因对淀粉酶产色链霉菌Streptomyces diastatochromogenes 1628合成丰加霉素的影响,本研究设计简并引物,首次克隆获得了菌株1628的toyF基因,并构建了敲除质粒pKC1132-toyF',通过接合转移转入菌株1628,获得toyF基因缺失株1628-ΔTOYF。结果表明,与原始菌株1628相比,缺失株1628-ΔTOYF中TOYF的酶活和丰加霉素产量分别降低66.7%、87.5%。在缺失株1628-ΔTOYF中回补表达toyF基因构建了重组菌1628-ΔTOYF/toyF。重组菌1628-ΔTOYF/toyF中的TOYF酶活和丰加霉素产量,较缺失株1628-ΔTOYF分别提高了2.7和8.3倍。由此可见,toyF基因是参与菌株1628生物合成丰加霉素的关键酶基因。本文toyF基因的克隆及其功能研究,为克隆完整的丰加霉素生物合成基因簇及其丰加霉素生物合成机制的研究奠定了基础。     

全局调控子MtrAsbh影响米尔贝霉素生物合成的研究

MtrA是链霉菌中保守存在的全局性应答调控蛋白。为探究冰城链霉菌中MtrA同源蛋白MtrA_sbh在生物农药米尔贝霉素产生中的作用,本文通过基因敲除、回补和过表达确定了MtrA_sbh对米尔贝霉素产生的影响;通过转录分析和凝胶阻滞初步探究了MtrA_sbh影响米尔贝霉素产生的机制;通过转录分析检测了MtrA_sbh对基因组中其他天然产物生物合成基因表达的影响。结果表明MtrA_sbh为米尔贝霉素产生的关键激活子,其失活导致米尔贝霉素彻底不产生,而过表达则显著提高米尔贝霉素的产量。MtrA_sbh通过影响米尔贝霉素基因簇和前体合成相关基因的表达来调控米尔贝霉素的产生。此外,MtrA_sbh作为激活子或抑制子差异化影响了冰城链霉菌基因组中众多天然产物生物合成基因的表达。     

激活嘌呤回补途径提高淀粉酶产色链霉菌丰加霉素产量

丰加霉素是核苷类抗生素家族中的一员,它在抑制真菌方面表现出很高的活性,在植物病害生物防治领域具有重要的应用潜力。淀粉酶产色链霉菌Streptomyces diastatochromogenes 1628是丰加霉素的生产菌株之一,但由于野生菌产量较低,难以实现在工业水平进行丰加霉素的发酵生产。通过对代谢途径分析发现,嘌呤回补途径能够影响丰加霉素合成。为了阐明嘌呤回补途径调控基因xdhR对淀粉酶产色链霉菌丰加霉素合成的影响,本研究通过基因敲除技术探究xdhR基因对丰加霉素产量、丰加霉素合成基因簇转录水平、菌丝分化、抑菌效果等方面的影响。摇瓶发酵试验表明,敲除xdhR基因能够显著提高淀粉酶产色链霉菌1628的丰加霉素产量,发酵至96 h时,重组菌中丰加霉素产量达到最高287.8 mg/L,产量较野生菌株提高约114.0%。q PCR试验表明,xdhR基因能够激活嘌呤回补途径基因的转录和丰加霉素合成基因簇基因的转录。同时,xdhR基因能够改变菌落生长形态。xdhR基因敲除菌株发酵液对水稻纹枯病菌和黄瓜枯萎病菌的抑制率分别提高到69.3%和100%。以上结果证明XdhR参与并调控淀粉酶产色链霉菌...     

秦岭山区链霉菌发酵产物杀菌活性的测定

从秦岭山区采集的200份土样中分离到6株链霉菌菌株。以菌丝生长速率法、孢子萌发法和盆栽法测定了其发酵液对常见十余种重要农作物病原真菌的杀菌活性。结果表明，N18菌株发酵产物在500μg/ml浓度下，对苹果炭疽病菌、棉花枯萎病菌的菌丝生长抑制率为100％，对番茄灰霉病菌、烟草赤星病菌、南瓜枯萎病菌的菌丝生长抑制率在90％以上。N18菌株发酵产物对小麦根腐病菌和玉米弯孢叶斑病菌的孢子萌发抑制率分别为98．47％和96．15％。在盆栽试验中，N18菌株发酵产物对小麦白粉病的防治效果为80．25％，治疗效果为69．31％。在大田防治小麦白粉病的试验中，N18菌株发酵液稀释200倍的防治效果为60．54％，而其它分离得到的5株链霉菌的活性较低。