鸭疫里默氏杆菌OmpA基因的克隆与表达

利用本实验室分离、鉴定并保存的鸭疫里默氏杆菌血清1型湖北云梦分离株（RA-YM）,根据GenBank上的序列设计了1对引物,用PCR方法扩增了RA-YM株的主要外膜蛋白OmpA基因,并克隆到pMD18-T载体,序列测定结果表明OmpA基因全长1152bp,序列同源性分析表明该基因相当保守,与其他不同RA菌株OmpA基因之间的核苷酸序列同源性为93%～97%。用pGEX-KG构建了原核表达载体pKG-OmpA,在大肠杆菌中进行了高效表达,表达蛋白约占菌体总蛋白的30%,主要为包涵体形式。SDS-PAGE电泳结果显示表达的融合蛋白大小约为68000,Western-blot结果表明该表达蛋白具有抗原性。     

鸭疫里默氏杆菌siderophore基因的克隆与表达

根据鸭疫里默氏杆菌全基因组序列,设计一对特异性引物,扩增了siderophore基因序列,克隆至pGEM-Teasy载体后进行序列测定及分析。结果表明,阅读框架全长为729bp,编码243个氨基酸。将该基因克隆到原核表达载体pET-28a后,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,经SDS-PAGE分析结果显示,已成功表达28ku的融合蛋白。     

鸭疫里默氏杆菌GroEL蛋白的原核表达和单克隆抗体制备

本试验旨在研制鸭疫里默氏杆菌GroEL蛋白的单克隆抗体。将鸭疫里默氏杆菌WJ4菌株的groEL基因进行原核表达,重组蛋白经过纯化后作为免疫原免疫BALB/c小鼠。经过3次免疫后,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,用间接ELISA筛选阳性细胞株并进行3次亚克隆后制备小鼠腹水单克隆抗体。共获得2株稳定分泌鸭疫里默氏杆菌GroEL单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1G2B6和1G2F10。2株单克隆抗体均为IgG1亚类。腹水单克隆抗体ELISA效价达到1:102 400。Western blot检测结果表明2株单克隆抗体均能与鸭疫里默氏杆菌血清1、2和10型菌株发生特异性结合,而与禽致病性大肠杆菌、沙门氏菌和禽巴氏杆菌菌株无反应性。本研究成功制备了稳定性好、特异性强的鸭疫里默氏杆菌GroEL单克隆抗体,为进一步研制基于抗体检测鸭疫里默氏杆菌抗原的试剂盒奠定了基础。     

鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白A克隆表达及纯化

为了制备鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)外膜蛋白A(Outer membrane protein-A,OmpA)。本研究将RA云南流行株外膜蛋白OmpA基因PCR克隆至质粒pET32a,构建重组表达质粒pET32a-OmpA,将其转化大肠杆菌TransB感受态细胞,用IPTG诱导表达,并将表达产物进行初步纯化。结果表明OmpA基因在大肠杆菌原核表达系统中获得了高效表达,表达的OmpA重组蛋白分子量为61 kDa,表达量占菌体蛋白的40%。OmpA重组蛋白经纯化后纯度达90%。本研究为RA的ELISA抗原的制备奠定了基础。     

鸭疫里默氏杆菌CAMP基因的克隆、原核表达及生物信息学分析

试验旨在克隆鸭疫里默氏杆菌协同溶血素蛋白(cooperative hemolysin protein,CAMP)基因,并对其进行原核表达和生物信息学分析。以RA贵州血清2型分离株RA-SS-8基因组为模板扩增并克隆鸭疫里默氏杆菌CAMP基因,构建pET-28a-CAMP重组原核表达质粒,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞,重组菌用IPTG进行诱导表达及纯化,利用SDS-PAGE和Western blotting分析表达蛋白的特征,并运用相关生物信息学分析软件对CAMP基因进行分析。结果显示,鸭疫里默氏杆菌CAMP基因大小为1 026 bp,该基因序列与GenBank中公布的10株RA参考菌株(如RA-LZ01(CP045564.1))CAMP基因的相似性达99.7%。经BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切鉴定后,获得大小约5 369和1 026 bp的基因片段,表明pET-28a-CAMP重组表达质粒构建成功。SDS-PAGE和Western blotting分析显示,表达的重组蛋白大小约为37 ku,以可溶形式进行表达,且能与His-tag单克隆抗体在37 ku处产生特异性反应,与预期结果相符。生物信息学分析表明,CAMP蛋白分子式为C₁₆₇₀H₂₆₅₉N₄₃₇O₅₀₀S₁₂,含341个氨基酸,理论等电点(pI)为5.62,不稳定系数为40.71,表明其为不稳定的弱酸性蛋白。疏水性预测结果显示,该蛋白属于亲水性蛋白。CAMP蛋白无跨膜结构域,无信号肽,有3个O-糖基化位点,无N-糖基化位点,存在34个磷酸化位点,共有17个抗原表位。二级结构和三级结构预测结果显示,CAMP蛋白以α-螺旋和无规则卷曲为主。本试验结果为进一步研究鸭疫里默氏杆菌CAMP蛋白的功能及鸭疫里默氏杆菌病疫苗的研发提供了参考。     

3株鸭疫里默氏杆菌OmpA单克隆抗体的制备及特性鉴定

鸭疫里默氏杆菌(RA)病,是家禽中主要的细菌性传染病之一,血清型复杂且各血清型间缺少交叉免疫保护,其中血清1型、2型、10型是国内优势血清型。外膜蛋白A(OmpA)是RA的毒力因子之一,在不同血清型RA中保守性良好。用OmpA蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,与骨髓瘤细胞SP2/0融合后用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株,腹腔注射BALB/c小鼠制备单克隆抗体。通过间接ELISA检测单克隆抗体效价及稳定性,秋水仙素法进行染色体分析,Western blot和玻片凝集试验鉴定单克隆抗体特异性。获得3株稳定分泌抗RA OmpA的单克隆抗体,分别命名为2D5、2A6、4H8;3株单克隆抗体的亚型均为IgG2a,腹水效价均为1∶2 048 000,均与鸭疫里默氏杆菌血清1型RA-CH3、血清2型RA-NJ3、血清10型RA-HXb2发生特异性反应,而与其他禽源致病菌不发生交叉反应。本研究成功研制的3株单克隆抗体具有良好的菌种特异性,有助于RA致病机理和RA快速诊断试剂盒的研制。     

鸭疫里默氏杆菌研究进展

我国是水禽养殖量及相关产品消费的第一大国.鸭疫里默氏杆菌是水禽的一种重要细菌性病原,主要导致10～50日龄的雏鸭发病,给水禽的健康养殖带来了较大的经济损失.本文针对该病原的流行病学、病原学、耐药性及当前的疫苗研究工作进行了概述,期望对鸭疫里默氏杆菌的科学用药、新型疫苗研发和疾病的综合防控提供一定的理论基础.     

鸭疫里默氏杆菌病

鸭疫里默氏杆菌病（原称鸭疫巴氏杆菌病）又名鸭传染性浆膜炎,是由鸭进里默氏杆菌感染所致的鸭、鹅、火鸡和多种禽类的一种接触性传染病。本病呈急性或慢性经过,以纤维众性心包炎、肝周炎、气囊炎、干酯性输卵管炎和脑膜炎为特征。由于本病的高发病率和死亡率,是当前国内外造成养鸭业经济损失最主要的疾病之一。本届呈世界范围分布,已在所有的集约化养鸭生产的国家发现O迄今为止,美国、英国、前苏联、荷兰、澳大利亚、法国、德国、丹麦、西班牙、新加坡、泰国、孟加拉和日本等均有本病的报道。我国于1982年报道在北京地区商品北京鸭中…     

鸭疫里默氏杆菌病

鸭疫里默氏杆菌病 ,原称鸭疫巴氏杆菌病 ,又名鸭传染性浆膜炎 ,是由鸭疫里默氏杆菌所致的一种接触性传染病。本病呈急性或慢性经过 ,以纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、干酪性输卵管炎和脑膜炎为特征。 2 0 0 0年 5～ 8月 ,山东省济宁、菏泽、泰安等地区的商品代肉鸭大量发生此病 ,造成了严重的损失。1　流行病学调查　 2 0 0 0年 5～ 8月 ,山东济宁、菏泽、泰安的商品代肉鸭场相继发生一种传染病 ,主要发生于 1 0～ 40日龄的小鸭 ,大棚地面饲养 ,品种主要为樱桃谷商品代 ,发病率 2 0 %～ 80 % ,发病后抗生素控制疗效不佳 ,死亡率 1 5 %～ …     

鸭疫里默氏杆菌病防治

正1流行病学鸭疫里默氏杆菌病是强传染性、高死亡率的细菌性传染病,多见于1～8周龄雏鸭,2～3周龄雏鸭发病风险较高,成鸭发病较少。鸭疫里默氏杆菌病多发于春夏、秋冬交替时节,当环境改变,雏鸭免疫力低下时,其易发生鸭疫里默氏杆菌病。鸭疫里默氏杆菌病传播途径较多,病菌可通过种蛋、呼吸道及饮水、饲料等传播。     

鸭疫里默氏杆菌原生质体的制备研究

鸭疫里默氏秆菌是一种非常难以转化的细菌,国内外未见关于其质粒转化的报道,试验以鸭疫里默氏杆菌OD600为0.7时为受体菌,在高渗缓冲液中,经溶菌酶5 mg/ml于37℃作用50 min,制备的原生质体再生于再生双层固体培养基,原生质体成功再生.研究为鸭疫里默氏杆菌的质粒转化提供了一条新途径.     

鸭疫里默氏杆菌血凝素基因的克隆、表达及其蛋白的定位分析

为研究鸭疫里默氏杆菌(R.anatipestifer)血凝素蛋白的功能,本实验克隆表达了鸭疫里默氏杆菌血凝素基因,并对其蛋白定位进行了分析。根据鸭疫里默氏杆菌CH3株血凝素基因序列设计一对特异性引物,采用PCR扩增不同血清型鸭疫里默氏杆菌的血凝素基因,进行序列测定与分析。结果表明其血凝素基因全长1 059 bp,编码352个氨基酸。不同血清型鸭疫里默氏杆菌血凝素间的氨基酸同源性为94.1%～100%,与黄杆菌3519-10株血凝素的氨基酸同源性为68.0%～68.9%。采用表达的血凝素蛋白免疫鼠血清和鸭抗鸭疫里默氏杆菌阳性血清对血凝素在细菌中的定位分析表明,鸭疫里默氏杆菌血凝素可能不是一种膜蛋白,而是存在于胞浆中的一种蛋白。     

鸭疫里默氏杆菌的研究进展

鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)是引起雏鸭传染性浆膜炎的一种短杆状革兰氏阴性菌,可严重危害养鸭业的健康发展.RA在我国养鸭地区均广泛分布,具有血清型多样、各血清型之间无交叉免疫保护的特点.由于养殖场存在滥用抗生素现象,近年来RA的耐药性愈加严重,给我国养鸭业的稳定健康发展带来了巨...     

鸭疫里默氏杆菌分子生物学研究进展

为全面总结鸭疫里默氏杆菌的研究情况,该文对鸭疫里默氏杆菌的病原特性、血清型、检测方法及全基因组序列测定、毒力因子等方面的研究进展进行综述,为临床上鸭疫里默氏杆菌病的预防提供参考。     

鸭疫里默氏杆菌病防治技术

正目前,鸭疫里默氏杆菌病的发生和流行极为广泛,几乎在有养鸭的地方均有本病流行,小鸭发生本病后,可引起大批死亡或生长发育严重受阻。本病的发生和流行,一方面是与应激因素的存在有着非常密切的关系,另一方面是倘若并发感染其他疾病,可诱发和加剧本病的发生和流行,本病常与大肠杆菌混合感染,造成更大的死亡,是当前危害养鸭业的主要的传染病之一。防治本病最主要和根本的办法是做好综合性的防控措施,改善饲养管理和卫生工作,建立合理的、     

鸭疫里默氏杆菌研究现状

为调查鸭疫里默氏杆菌的研究现状,方法：综述了鸭疫里默氏杆菌的诊断方法、致病机理、疫苗研制、耐药性现状以及药物防治方面取得的重大成果,结果：发现各方面研究成果显著,总结：提出检测不同地区RA的优势血清型和耐药性,成为一项常态化的工作。     

鸭疫里默氏杆菌分子生物学研究进展

鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipcstifcr,RA）是一种革兰氏阴性、无鞭毛、无芽孢的棒状杆菌,瑞氏染色呈两极着色。鸭疫里默氏杆菌所引起的传染病被称为鸭巴氏杆菌病、鸭败血症、鸭疫综合症、鸭疫败血症、新鸭病和鸭传染性浆膜炎。该病呈世界范围分布,现已在几乎所有集约化养鸭生产的国家发现,给养鸭业带来了巨大的经济损失：RA血清型众多且非常复杂,     

鸭疫里默氏杆菌病防制

<正>鸭疫里默氏杆菌病又称为鸭传染性浆膜炎,是鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)感染引起的一种接触性传染性疾病。1932年纽约长岛首次报道该病,以后各国相继报道,我国于1982年首次报道,目前我国多地已陆续有本病的发病报道。鸭疫里默氏杆菌感染是危害全世界养鸭业的一种主要疾病[1]。