2011～2014年广西H9N2亚型禽流感病毒HA基因遗传变异分析

为了解H9N2亚型禽流感病毒广西分离株的遗传变异情况,采用RT-PCR技术扩增了10株从2011~2014年广西不同地区分离的H9N2亚型AIV的HA基因片段,并对所得序列进行同源性和遗传进化分析。结果显示,10个毒株的HA基因全长1 683 bp,编码560个氨基酸;10株分离株的裂解位点均为PSRSSR↓GLF,为典型低致病性禽流感病毒的特征序列。10株分离株234位氨基酸均为L,具有与哺乳动物唾液酸α-2,6受体结合的特征。分离株与参考毒株HA基因的核苷酸与氨基酸同源性均较高,分别为79.3%~98.7%和85.0%~98.6%,均属欧亚种系,其中与A/Duck/Hong Kong/Y280/97亲源关系较近。研究结果从分子水平上证明H9N2亚型禽流感病毒近年来未发生较大变异。     

2011-2014年山东省H9亚型禽流感病毒HA基因遗传变异分析

对2011-2014年山东26个H9亚型AIV毒株的HA基因进行测序分析。结果显示,所有毒株均属于h9.4.2.5亚分支,与疫苗株GD/SS/94、SD/6/96、SH/F/98的核苷酸相似性为88.0%~91.5%。HA裂解位点均只有一个碱性氨基酸(R),符合低致病性AIV的特征。所有毒株在234位发生了谷氨酸Q→亮氨酸L的突变,呈现出典型的人流感病毒受体结合特性。所有毒株在313-315位均新增1个潜在糖基化位点,且部分毒株在145-147位出现新潜在糖基化位点NGT。结果表明,山东省H9亚型AIV基因已发生较大变异,因此需要加强禽类生产贸易的监测和生物安全措施,及时更新疫苗毒株,控制H9亚型AIV的传播。     

25株H9N2亚型禽流感病毒HA基因的遗传进化分析

为了解山东省不同地区H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的变异情况,本研究汇集了2012-2013年间从山东省不同地区发病家禽中分离到的25株H9N2亚型AIV,采用RT-PCR技术扩增其HA基因,并进行测序和遗传进化分析。结果显示,25株病毒HA基因的开放阅读框全长为1 683bp,共编码560个氨基酸,其核苷酸和氨基酸同源性分别为94.5%~100.0%和93.8%~100.0%;遗传进化分析表明25株病毒分离株均属于欧亚分支中的Y280-like亚分支;HA蛋白有7~9个潜在糖基化位点,其中218位糖基化位点缺失,145位新增糖基化位点;25株病毒分离株HA蛋白裂解位点均为RSSR↓GIF,符合低致病力AIV的特征。受体结合位点较保守,234位受体结合位点均为L(亮氨酸),仅198位受体结合位点存在变异。分离的病毒株具有与人唾液酸α-2,6受体结合的特性,此类毒株的流行在公共卫生上值得重视。     

我国部分地区H9N2亚型禽流感病毒HA基因遗传进化分析

于2008～2013年从江苏、山东、河南、河北等地分离鉴定出45株H9N2亚型禽流感病毒,采用PCR扩增分离株HA基因,并进行HA基因测序、核苷酸同源性分析及遗传进化分析.同源性比较结果显示:45个毒株的HA基因与我国现有疫苗株的HA基因核苷酸同源性为89.1％～94.4％,其中与HP株和F98株的HA基因核苷酸同源性分别为91.3％～94.4％和89.1％～92.0％.遗传进化分析结果显示,分离株的HA基因均属于欧亚谱系A/DK/HK/Y280/97-like分支亚系,证明当前我国大部分地区的H9N2亚型禽流感病毒在同源疫苗的免疫选择压力下,其HA基因与现有疫苗株相比已发生了较大的遗传漂变.     

H9亚型禽流感病毒钦州株HA基因的克隆与遗传进化

采集钦州活禽交易市场的鸡气管和泄殖腔的棉拭予样品,用H9亚型分型引物进行PCR初步筛选,阳性样品经SPF鸡胚尿囊腔接种分离病毒,通过RT-PCR方法扩增HA基因,并将其克隆到pMD—18T载体后进行序列测定和分析。结果表明,获得1株H9亚型禽流感病毒命名为：A／Chicken／Guangxi／qz40／2009（简称qz40）。测序结果表明qz40的HA基因片段全长1683bp,编码560个氨基酸;序列同源性比较结果表明,该毒株与参考毒株的核苷酸序列同源性为82．8％．99．9％,推导氨基酸同源性为87．5％．99．6％;HA基因的裂解位点氨基酸顺序为RSSRIGLF,为低致病性毒株;含有7个潜在的N-糖基化位点,其中5个位于HAl部分、2个位于HA2部分;基于H9亚型HA基因的进化树分析表明,qz40株属于欧亚种系的A／Chicken／Beijing／1／94（Ck／Bei—like）群系。     

两广地区2011-2012年H9N2亚型禽流感病毒的HA基因进化分析

为探究两广地区H9N2亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的变异情况及分子流行规律,于2011—2012年从该地区发病鸡群中共分离到16株H9N2亚型AIV,并对分离株HA基因进行测序与进化分析。结果表明,分离株HA基因开放阅读框全长均为1 683bp,编码560个氨基酸;HA基因核苷酸同源性为88.7%⁹9.6%,编码氨基酸同源性为91.8%99.6%,编码氨基酸同源性为91.8%⁹9.5%。本试验分离毒株与国内疫苗株(GD-SS、SH-F和SD-6)的核苷酸同源性在90.1%99.5%。本试验分离毒株与国内疫苗株(GD-SS、SH-F和SD-6)的核苷酸同源性在90.1%⁹2.6%之间,推导的氨基酸序列同源性在91.6%92.6%之间,推导的氨基酸序列同源性在91.6%⁹4.8%之间。进化分析显示分离株可分为Group 1和Group 2两个亚分支,与疫苗株均属于欧亚谱系的Y280分支,但亲缘关系较远。分离株HA蛋白裂解位点附近序列有3种形式:PARSSR↓GLF、PSRSSR↓GLF和PARLSR↓GLF,均无连续碱性氨基酸的插入,符合低致病性AIV的特征。本试验发现分离株GD4、GX2在HA1的127、295位分别增加一个潜在的糖基化位点;除分离株GD5和GD6外,其余分离株在HA1的216位发生Q216L氨基酸突变,表明其存在感染人的可能性。     

两广地区2011--2012年H9N2亚型禽流感病毒的HA基因进化分析

为探究两广地区H9N2亚型禽流感病毒（avianinfluenzavirus,AIV）的变异情况及分子流行规律,于2011-2012年从该地区发病鸡群中共分离到16株H9N2亚型A1V,并对分离株HA基因进行测序与进化分析。结果表明,分离株HA基因开放阅读框全长均为1683bp,编码560个氨基酸;HA基因核苷酸同源性为88．7％～99．6％,编码氨基酸同源性为91．8％～99．5％。本试验分离毒株与国内疫苗株（GD-SS、SH—F和SD-6）的核苷酸同源性在90．1％～92．6％之间,推导的氨基酸序列同源性在91．6％～94．8％之间。进化分析显示分离株可分为Group1和Group2两个亚分支,与疫苗株均属于欧亚谱系的Y280分支,但亲缘关系较远。分离株HA蛋白裂解位点附近序列有3种形式：PARSSR＋GLF、PSRSSR＋GLF和PARLSR0GLF,均无连续碱性氨基酸的插A,符合低致病性AIv的特征。本试验发现分离株GD4、GX2在HA1的127、295位分别增加一个潜在的糖基化位点;除分离株GD5和GD6外,其余分离株在HAl的216位发生Q216L氨基酸突变,表明其存在感染人的可能性。     

2016-2021年广西H9亚型禽流感病毒HA和NA基因遗传进化动态分析

【目的】研究H9亚型禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)广西毒株的遗传进化动态,以期掌握其地域流行新特点,为及时优化调整有效防控措施提供数据支持。【方法】采集2016-2021年广西各地的家禽喉头、泄殖腔及环境拭子样品3 600份,接种9～11日龄SPF鸡胚分离病毒,并结合血凝和血凝抑制试验及实时荧光定量RT-PCR方法鉴定AIV亚型,根据毒株检测年限和来源地选取部分H9亚型AIV核酸阳性样品进行HA、NA基因扩增、测序及进化动态分析。【结果】共获得46株H9亚型AIV广西毒株的HA、NA基因序列,其中HA基因全长1 683 bp,编码560个氨基酸;4株NA基因全长1 410 bp,编码469个氨基酸,42株缺失3个氨基酸,编码466个氨基酸。BLAST分析结果显示,越南及国内多个省份的毒株与本研究获得的广西毒株HA、NA基因相似性最高,分别为97.62%～99.88%和93.13%～99.79%,宿主源也不尽相同,表现遗传多样性特征。广西毒株之间HA基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为93.0%～99.1%和94.6%～99.1%,NA基因核苷酸和氨基酸...     

2013—2014年H7亚型禽流感病毒遗传进化分析

对2013—2014年15株不同来源的H7亚型禽流感病毒国内分离株进行了基因组测序与遗传进化分析。结果显示,15株H7亚型禽流感病毒具有遗传多样性,可分为2种亚型:13株为H7N9亚型,2株为H7N3亚型。HA蛋白裂解位点附近氨基酸分析显示所有H7亚型流感分离株均为低致病性毒株。基因组遗传进化分析显示,13株H7N9亚型禽流感病毒均与2013年人源分离株同源性较高,但具有2种遗传学特性,13株病毒的PB2、PA、HA、NP、NA、M和NS基因高度同源,而PB1基因来源于2个不同分支。2株H7N3亚型流感病毒与国内鸭源分离株同源性较高。15株H7亚型禽流感病毒PB2蛋白均未出现627K、701N等与哺乳动物适应性相关的氨基酸变异。13株H7N9亚型禽流感病毒HA裂解位点附近氨基酸(EIPKGR/GL)与人源H7N9病毒一致,且HA蛋白和M2蛋白分别具有与哺乳动物适应性和金刚烷胺耐药性相关的标志性变异,而2株H7N3亚型禽流感病毒未出现上述氨基酸变异。     

2007～2008年上海地区H9亚型禽流感病毒HA基因序列分析

对分离自上海活禽批发市场的11株H9亚型禽流感病毒（Arian influenza virus,AIV）（2007年5株、2008年6株）进行了血凝素（hemagglatinin,HA）基因序列的测定,以阐明2007年至2008年上海地区H9 AIV分离株HA基因的遗传变异及分子特征。采集鸡气管和泄殖腔棉拭子样品,将H9亚型荧光RT-PCR试剂盒检测出的阳性样品处理后,经鸡胚尿囊腔接种分离病毒,血凝抑制试验（haemagglutination inhibition,HI）进一步确定HA亚型,通过RT-PCR方法分别扩增了11个毒株的HA基因并进行了序列测定。遗传发生关系分析,这11株分离株均属于Ck/Bei/1/94系。2007年至2008年上海地区H9亚型分离株具有相同的起源,且分子特性相似。     

H9亚型禽流感病毒山西株的分离鉴定及其HA基因的遗传进化分析

从山西省某些鸡场采集疑似病料,接种SPF鸡胚后分离病毒,采用A型流感病毒通用引物进行HA基因的扩增,并连接T载体克隆后进行序列测序和遗传进化分析。结果显示:获得4株H9亚型禽流感病毒完整HA序列,开放阅读框1 683nt,编码560个氨基酸,各自之间核苷酸同源性较高,达95.5%~99.6%,且推导的氨基酸同源性介于92.0%~99.6%之间;遗传进化分析结果显示该4株属4.2.5分支,与国内常用疫苗株4.2.3分支存在一定差异,但仍属于4.2大分支;HA蛋白的裂解位点氨基酸顺序为RSSR↓GLF,为低致病性禽流感病毒,并且含有7个潜在的N-糖基化位点以及8个受体结合位点。结果表明:本试验分离的H9亚型禽流感病毒与近年来流行毒株HA基因同源性及蛋白关键位点相似性较高。     

福建省H9N2亚型禽流感病毒HA和NA基因的进化分析

为进一步了解福建省H9N2亚型禽流感病毒的基因遗传进化关系,本研究将福建省2011年分离的毒株FZ-04、FZ-11与GenBank上登录的2000～2011年福建省分离的H9N2毒株及国内外典型代表株进行HA、NA基因的序列比对和遗传进化分析。结果表明,分离株FZ-04和FZ-11的HA基因与CK/FJ/G9/09株核苷酸同源性最高,属于国内常见的CK/BJ/1/94亚系。HA裂解位点处的氨基酸序列为-PSRSSR/GL-,符合低致病性禽流感病毒的分子特征。NA基因在遗传进化关系上呈现独立的分支,与CK/FJ/10954/05毒株核苷酸序列同源性最高,属于CK/HK/G9/97亚系,且NA基因推导的469个氨基酸序列中没有缺失。同时,从HA和NA基因的遗传进化树上可知,2000～2011年福建省H9N2禽流感病毒进化相对比较稳定,可能有一个共同的起源。     

2011年－2014年我国部分省区 H9N2亚型禽流感病毒HA 基因序列分析

本研究于2011年－2014年在我国部分省区鸡群中鉴定出49株 H9N2亚型禽流感病毒,并对所有毒株的 HA 基因进行克隆、测序及序列分析。结果表明,49个毒株的 HA 基因开放阅读框全长均为1683 bp,编码560个氨基酸。所有分离株均属于以 HK/Y280/97株为代表的 H9．4．2谱系,并明显分成2个亚分支(H9．4．2．5和 H9．4．2．6)。分离株 HA 基因核苷酸同源性在87．1％~100％之间,与疫苗株 SH/F/98株、GD/SS/94株和 SD/6/96株核苷酸同源性在89．4％~92．5％之间。对 HA 基因的推导氨基酸序列分析表明,所有分离株裂解位点附近没有连续的碱性氨基酸插入,符合低致病力毒株特征,受体结合位点为PWTN?LY 形式,受体结合位点左沿为 NGLM/QGL 形式,右沿均为 GTSKA 形式。在49个分离株中共发现10个潜在糖基化位点,但只有6个糖基化位点保守。研究表明,近年来 H9N2亚型禽流感在我国多个地区流行,2013年以后流行毒株趋势以 H9．4．2．5为主,但病毒基因仍在不断发生变异,因此需要继续加强对H9N2亚型禽流感分子流行病学的监控。     

一株H9亚型禽流感病毒HA基因的遗传变异分析

对2006年采集的1份禽流感病鸡组织进行RNA抽提后,采用A型流感病毒通用引物进行禽流感病毒HA基因的扩增,并进行T载体克隆及测序,获得了一株H9亚型禽流感病毒的HA序列。序列分析表明,此血凝素基因的ORF由1683个核苷酸组成,编码560个氨基酸,属A／Chicken／Beijing／1／94系。将其在GenBank中Blasl后发现,其与1株珍珠鸡H9N2病毒（A／Guineafowl／Hongkong／NT101／03）和1株鸡H9N2病毒（A／Chicken／Hongkong／AP45／03）的同源性和分值最高,同源性可达97％,较中国2006年前的分离株进化相对稳定,核苷酸的变异不大。切割位点的序列为-PARSSRGLF-,仍属于低致病力毒株。但Gln226Leu的变异,使其成为一种潜在的可感染人的禽源毒株。     

宁夏部分地区H9亚型禽流感病毒HA基因演化分析

为了解宁夏地区H9亚型禽流感病毒的流行情况与分子遗传学特征,2022年4—6月在宁夏养禽业集中的6个县（市、区）共采集1 240份咽喉/泄殖腔拭子,采用实时荧光定量PCR进行AIV核酸检测,并对RT-PCR扩增的HA基因阳性产物进行测序分析及生物信息学分析。结果表明,参试样本中总AIV阳性率为9.84%,其中H9亚型阳性率为7.59%;HA蛋白裂解位点分析发现氨基酸序列均为PSRSSR的非连续性碱性氨基酸的插入,符合低致病性禽流感特征,且均发生Q234L突变（H9编码）,具有与人流感受体唾液酸α-2,6-受体结合的特性;生物信息学分析显示H9亚型AIV毒力和致病力等生物学特性有趋于转强的可能性,经过基因重排可能会进化出新的禽流感亚型或分支。因此,在禽类养殖过程中,必须对H9亚型AIV加以重视并加强预警,严格做好监测防控工作。     

2012年上海地区发病鸡群H9N2亚型禽流感病毒的变异分析

为了了解2012年分离自上海发病鸡群的H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus, AIS）的遗传变异特征,采集发病鸡群中病死鸡气管、肺、脑和肾脏等内脏,经实验室诊断为H9亚型禽流感病毒核酸阳性。将阳性样品处理后,经鸡胚尿囊腔接种分离病毒,HI进一步确定HA亚型,通过RT-PCR方法分别扩增了3个分离株的8个基因片段并进行了序列分析。3株分离株均为H9N2亚型禽流感病毒,与以往从上海地区健康鸡群中分离的4株H9N2毒株相比,本研究中的3株分离株由于HA基因220位的氨基酸发生了变异,缺失了HA上218~220位的一个潜在的糖基化位点,并且HA基因受体结合位点的左缘235位发生了变异。从HA基因抗原位点的分析表明,与疫苗株Ck/SD/6/96相比,这3株H9N2亚型禽流感病毒7个抗原位点中已有4个发生了改变。遗传发生关系表明这3株分离株均属于Ck/Bei/1/94系,与08年的分离株Ck/SH/Y1/088个基因片段所属基因型相同。2012年上海地区发病鸡群中分离的上述3株H9N2禽流感病毒基因序列已发生变异,是否导致其生物学特性发生改变以及目前使用的疫苗能否给禽群提供足够的保护力还需要作进一步的研究。     

表达H9亚型禽流感病毒HA基因重组鸡痘病毒疫苗的遗传稳定性

将表达H9亚型禽流感病毒HA基因重组鸡痘病毒疫苗连续传代至30代，取第10、20、30代重组病毒作为受检代次，进行外源基因片段的克隆与测序，以间接免疫荧光试验检验各代次的表达，并以第10、20、30代重组鸡痘病毒疫苗进行免疫保护效力试验。对各代次模板进行PCR反应，分别扩增出特异的1．7kb外源基因片段，酶切位点与原始代次相同；各代次外源基因序列与原始序列相比，仅有1个碱基发生变化，不涉及氨基酸的变化；免疫荧光试验显示各代次均有显著表达；各免疫组在免疫后第7、10、14、20天的HI抗体效价(log2)逐渐上升；攻毒后第5天各免疫组排毒率与对照组相比差异显著，各免疫组之间无显著差异。结果表明：此重组载体疫苗具有较好的遗传稳定性，经过30代的传代后外源插入基因及其表达未见变化，免疫保护效力亦与原代一致。     

一株鸡源H9N2亚型禽流感病毒的致病性及其HA基因遗传进化分析

为了解H9N2亚型禽流感病毒在新疆蛋鸡养殖场的致病性及遗传进化特点,对一株分离自蛋鸡的禽流感病毒A/Chicken/Xinjiang/01/2010(H9N2)进行了致病性及遗传进化分析。结果显示,分离株的MDT为92h,ICPI指数为1.125,IVPI指数为0.14,HA裂解位点处氨基酸序列为335 RSSRGLF342,这些特征均证实该分离株为低致病性AIV。HA基因遗传进化分析表明,该分离株在系统进化树上与A/swine/XJWLMQ/7/09(H9N2)及3株野生鸟类新疆分离株的亲缘关系最为接近,该分离株HA基因属于欧亚谱系的A/chicken/Beijing/94(H9N2)和A/chicken/Hongkong/G9/97(H9N2)的一个分支。     

3株H9亚型禽流感病毒的分离与遗传进化分析

2011年1月至3月,从江苏地区免疫蛋鸡群中分离出了3株H9亚型禽流感病毒(AIV),为了了解H9亚型禽流感在免疫鸡群中发生与流行的原因,研究采用RT-PCR技术对该病毒HA和NA基因进行扩增和测序,并对所得全序列进行同源性和遗传进化分析。研究结果显示:分离株与近期华东地区H9亚型AIV分离株关系最近;3株毒株之间的HA和NA基因均具有很近的亲缘关系,但在遗传发生树上与疫苗株具有较远的遗传距离,分离株与疫苗株之间的同源性在91%左右。     

H9亚型禽流感病毒HA基因的重组禽痘病毒构建

本试验构建了H9亚型禽流感病毒HA基因禽痘病毒转移载体,经转染、蓝斑克隆、筛选和纯化,获得了遗传性状稳定的HA基因重组禽痘病毒。提取感染重组病毒的鸡胚成纤维细胞(CEF)的DNA进行PCR扩增,获得1.7kb的携带有外源目的基因片段。收集纯化的重组病毒CEF细胞,用H9亚型禽流感病毒多克隆血清作一抗,碱性磷酸酶标记的鸡IgG为二抗进行Western blot检测,结果表明重组痘病毒能在体外的CEF细胞表达HA糖蛋白。