柔嫩艾美耳球虫裂殖子全长cDNA文库的构建及应用

为克隆柔嫩艾美耳球虫裂殖子阶段的功能基因的全长序列,利用SMART技术,采用Clontech公司的Creator TMSMARTTMcDNA Library Construction Kit构建了鸡球虫裂殖子的全长cDNA文库。用试剂盒提取mRNA后,以cDNA合成试剂盒合成cDNA。连接至pDNR-LIB载体,用电转化法将重组质粒转化到E.coli DH10B内得到原始文库,扩增后保存于-80℃冰箱内;最后以文库为模板,分别以研究室已成功克隆序列(EtSAG2、EtMIC-2、EtMCAT)及Sanger的部分EST序列(Contig1218)设计引物,进行PCR扩增并测序检验文库的实用性。经测定,构建的初级cDNA文库约含有8.72×107个重组子,插入的片段多在1kb～3kb之间,平均插入片段长度约1.8kb,扩增后文库保存的滴度为2.4×104 cfu/mL;通过文库的PCR扩增,不仅可以成功扩增出研究室已成功克隆的序列(EtSAG2、EtMIC-2),并成功获得EtMCAT和EST序列(Contig1218)的全长cDNA序列,经比对分析Contig1218所编码的蛋白为组织蛋白酶B样半胱氨酸蛋白酶(Cathepsin B)。结果表明,已成功构建了柔嫩艾美耳球虫裂殖子高质量的全长cDNA文库,从而为筛选鸡球虫的功能基因全长序列奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫cDNA文库的构建

用异硫氰酸胍法从孢子化7h的卵囊中提取总RNA，链合成引物用置换合成法合成总cDNA，cDNA与E再用oligo(dT)n-纤维素从总RNA中分离mRNA。mRNA以Not Iolig(dT)15作第一链合成引物用置换合成法合成总cDNA，cDNA用Ecor I Aaptors的连接后，经Not I酶切，再与EcoR I和Not I预切好的λ载体连拉，构建成鸡球虫cDNA文库。     

柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子的分离纯化

本文报道了柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子的分离纯化方法。依次通过酶消化、离心洗涤、红细胞裂解、Percoll密度梯度离心等手段对鸡柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子进行了分离纯化,结果表明,该法效果好,回收率高,操作程序较简单,所获得的裂殖子杂质极少,其纯度适用于进行分子生物学方面的研究。     

艾美耳球虫裂殖子的研究

艾美耳球虫裂殖子的研究谢明权，吴惠贤，张健，彭新宇，谢宏料（广东省农业科学院广州５１０６４０），（广东省农业科学院兽医研究所广州５１０６４０）球虫病是由艾美耳科原虫引起的寄生虫病，此病影响到哺乳类和禽类动物，尤其是鸡、火鸡、鹅、兔、牛，引起巨大的经济...     

柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子中的Etmic-2基因克隆及测序

作者根据子孢子微线基因 (Etmic- 2 )的 c DNA序列 ,利用计算机设计出 1对引物 ,从柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子中用 RT- PCR技术扩增出 1个片段 (m ic2 - m z)。把这个片段克隆到 p GEM- T- Easy Vector中后 ,我们得到 1个阳性克隆 pmic2 - mz,酶切分析证明 pm ic2 - m z含有 m ic2 - m z,并且外源片段以反方向插入 T载体中。核苷酸序列测定结果表明 m ic2 - m z与 Etmic- 2基因的编码区序列一样长 ,分子量都为 112 7bp,并且两序列之间也只有 3个碱基不同 ,也没有造成氨基酸编码错位 ,这说明球虫从子孢子到第二代裂殖子的二次无性生殖过程中 ,微线基因Etm ic- 2 c NDA序列没有发生太大的变化。     

柔嫩艾美耳球虫毒害艾美耳球虫变位艾美耳球虫交叉免疫试验

柔嫩艾美耳球虫毒害艾美耳球虫变位艾美耳球虫交叉免疫试验黄兵，赵其平，何林华，吴薛忠，陈兆国，史天卫（中国农科院上海家畜寄生虫病研究所，２００２３２）鸡感染球虫后会产生一种抵抗再次感染的免疫反应，这种免疫反应具有种的特异性，即感染某种球虫不能保护抵抗另...     

柔嫩艾美球虫抗药株第二代裂殖子的双向电泳图谱比较

对实验室诱导的柔嫩艾美球虫马杜拉霉素、地克珠利抗药株及其同母源敏感株第二代裂殖子的蛋白质进行双向电泳，构建了稳定的双向电泳图谱。经Imagemaster 2D Elite软件分析，敏感株和抗药株平均可分离900个点；以敏感株平均胶作为参考胶，抗药株平均胶与之比较，得到差异蛋白质斑点，其中地克珠利抗药株和马杜拉霉素抗药株各有4个表达差异点。这些差异表达的蛋白质可能参与了球虫抗药性产生的过程。     

鸡毒害艾美耳球虫及堆型艾美耳球虫的诊治

元氏县三个养鸡专业户于1998年10月从同一种鸡场引进商品蛋鸡4500只,三户鸡场相连,且饲喂同一厂家的饲料。鸡群90日龄时开始出现精神沉郁,羽毛蓬乱,食欲下降,腹泻,先后按大肠杆菌病、传染性法氏     

一种纯化柔嫩艾美耳球虫裂殖子的新方法

本文报道了一种快速而简单的纯化柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子的新方法。这种方法是利用含0.25％胰酶和5％胆盐的消化液,消化被感染的鸡胚或盲肠而释放出裂殖子。利用这一消化程序子孢子液过滤后每胚或每条盲肠可获得1.4×10~7和8.33×10~7的裂殖子。与老方法相比。此法比从鸡胚收获到裂     

堆型艾美耳球虫早熟减毒株裂殖子的细胞培养

以收集于雏鸡十二指肠的堆型艾美耳球虫早熟减毒株裂殖子接种于鸡胚成纤维细胞、鸡胚肝细胞、鸡胚小肠上皮细胞和雏鸡肾细胞,４１℃培养１２０小时,其在鸡胚成纤维细胞和鸡胚肝细胞中不能继续发育,在鸡胚小肠上皮细胞和雏鸡肾细胞中可发育到卵囊阶段。     

鸡毒害艾美耳球虫病例报告

作者在近几年的工作中发现长春地区(包括农安、伊通、怀德等县)鸡患球虫以堆型艾美耳球虫和柔嫩艾美耳球虫居多,时尔发现巨型艾美耳球虫等其它种类球虫。据孙维东等(1900)对长春地区鸡球虫种类所进行的初步调查表明,至少有五种艾美耳属球虫存在于该地区鸡群中。这五种分别为巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima),堆型艾美耳球虫(E.acervlima),和缓艾美耳球虫(E.mitis),早熟艾美耳球虫(E.praecox)与柔     

斯氏艾美耳球虫裂殖生殖的多态现象

迄今描述的艾美耳科和住肉孢子虫科球虫的裂殖生殖为单态，作者发现斯氏艾美耳球虫的裂殖生殖具多态性，其方式有：子孢子型裂殖体以内单多生殖方式产生下代裂殖子；双或多核的裂殖子型裂殖体或以内二多生殖方式或以外单多生殖方式产生下代裂殖子；单核裂殖子型裂殖体以外多生生列殖方式下代裂殖子；经典型裂殖体以内单多和外单多混生方式产生下代裂殖子。这种裂殖体以多态的方式产生下代裂殖子的现象称为裂殖生殖的多态现象。依据前     

毒害艾美耳球虫鸡胚培养研究

为了建立毒害艾美耳球虫(Eimeria necatrix)的鸡胚培养体系,用毒害艾美耳球虫子孢子分别接种8～11日龄鸡胚以确定最佳接种日龄,用不同剂量子孢子接种同一日龄鸡胚以确定最佳子孢子接种剂量,并在子孢子混悬液中分别加入不同剂量的胰岛素和叶酸以观察对球虫在鸡胚中发育的影响.结果显示,毒害艾美耳球虫子孢子接种9日龄的鸡胚,其卵囊产量(平均每只胚的卵囊量)和卵囊成熟率均为最高,成熟率达到99%;当每个鸡胚接种子孢子1×104个时,其卵囊产量最高;在子孢子混悬液中分别加入胰岛素1 000 U/mL、叶酸0.05 mg/mL,均能明显增加鸡胚中的卵囊产量.本文通过对毒害艾美耳球虫的鸡胚接种日龄、子孢子接种剂量、营养物质添加等因素的研究,初步建立了毒害艾美耳球虫的鸡胚培养体系.     

柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库的构建

为了筛选柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵相关的蛋白,利用酵母双杂交体系构建了柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库。提取纯化的子孢子总RNA,经MMLV-RT反转录合成cDNA第一链后,利用LD-PCR扩增合成双链cDNA(ds cDNA),dscDNA经纯化柱CHROMA SPINT+TE-400 Columns纯化剔除小于200 bp的片段。将纯化后dscDNA、pGADT7-Rec及Carrier DNA共转化到已经制备好的酵母感受态细胞Y187中,dscDNA与pGADT7-Rec以同源重组的方式在细胞内进行连接,经过缺陷性培养基(SD/-Leu)的筛选得到酵母双杂交cDNA文库。结果显示,构建的柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库的转化率为4.33×105/μg pGADT7-Rec,文库滴度为3.62×107 cfu/m L。随机挑取32个单克隆进行PCR检测,插入片段大小为200~2000bp,重组率为93.75%,并以该文库作为模板,用柔嫩艾美耳球虫5对特异性引物进行PCR扩增,获得了这5个基因片段。结果表明成功构建了柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库,为进一步筛选和研究球虫入侵互作蛋白奠定了基础。     

雏鸡感染毒害艾美耳球虫后的体液免疫

采用SPA菌体花环法、间接ELISA法和免疫组织化学法检测毒害艾美耳球虫（E．necatrix）感染雏鸡后，其血液免疫球蛋白含量、B细胞和免疫器官抗体生成细胞数量的动态变化。结果发现：①E．necatrix感染雏鸡后10d血液B细胞数量和IgG、IgM、IgA含量均开始增加，16～18d达到峰值；②感染雏鸡法氏囊、脾脏等免疫器官的抗体生成细胞数量于7～21d不同程度增加，14～18d达最高峰。结果表明，雏鸡体液免疫在抵抗E．necatrix感染中也发挥重要作用。     

柔嫩艾美耳球虫裂殖生殖阶段超微结构的研究

利用透射电镜对柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella)裂殖生殖阶段的超微结构进行了观察描述。其第二次裂殖生殖方式为外裂殖生殖，裂殖子侵入宿主细胞后，裂殖子逐渐变圆形成裂殖体，此过程中裂殖子的棒状体首先消失，引后锥体和极环消失、最后微浅、淀粉颗粒和折光体消失。裂殖体长大后，细胞膜下陷，将裂殖体分成几个部分，随后裂殖体进行核分裂成多核裂殖体，此后在靠近细胞核处细胞膜加厚外突，临近部位的细胞膜凹陷，同时近突起部位内膜复合体加厚形成极环，随着时间的推移逐渐形成幼稚裂殖子，幼稚裂殖子后部与残体相连，此过程中裂殖子的锥、极环、微线、棒状体、淀粉颗粒、折光体依次逐渐形成。裂殖子成熟的标志为从残体脱离，裂殖子的膜下微管24根纵向贯穿裂殖子直达顶端和极环相连，裂殖子内部由锥体、锥体前环1、锥体前环2、极环、微线、线粒体、折光体和3－多个棒状体等组成。