抗柔嫩艾美耳球虫EtRP单克隆抗体的制备及其免疫保护效果

棒状体蛋白(EtRP)在柔嫩艾美耳球虫入侵宿主细胞的过程中起重要作用。该蛋白在球虫发育阶段的早期表达,具有保护性抗原的性质,其相应抗体可抑制球虫对宿主的感染。采用纯化后的p GEX-6P-1-EtRP重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备了抗EtRP的单克隆抗体,将不同剂量的单克隆抗体注射试验鸡群再对免疫鸡群攻虫,7 d后致死鸡群并计算卵囊减少率、相对增重率以及盲肠病变评分情况。结果表明,所制备的单克隆抗体亚型为IgG1,经Western-blot检测能特异性识别重组蛋白,经间接ELISA测定其效价大于1∶128 000。此外,单克隆抗体对鸡的被动保护性试验结果显示相对增重率、病变评分、卵囊减少率均随着免疫剂量的增加而增大,表明一定剂量的单克隆抗体可以有效减少柔嫩艾美耳球虫对鸡群的感染。     

柔嫩艾美耳球虫毒害艾美耳球虫变位艾美耳球虫交叉免疫试验

柔嫩艾美耳球虫毒害艾美耳球虫变位艾美耳球虫交叉免疫试验黄兵，赵其平，何林华，吴薛忠，陈兆国，史天卫（中国农科院上海家畜寄生虫病研究所，２００２３２）鸡感染球虫后会产生一种抵抗再次感染的免疫反应，这种免疫反应具有种的特异性，即感染某种球虫不能保护抵抗另...     

柔嫩艾美耳球虫乳酸脱氢酶真核表达质粒的构建与鉴定

为构建柔嫩艾美耳球虫乳酸脱氢酶(Eimeria tenella Lactate dehydrogenase,EtLDH)的真核表达质粒,分别以柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子和鸡脾脏cDNA为模板,PCR扩增出EtLDH和鸡IFN-γ基因,PCR产物经酶切回收目的片段后与相应酶切的真核表达载体pCAGGS连接,构建了真核表达质粒pCAGGS-EtLDH和pCAGGS-EtLDH-IFN-γ。所构建的真核表达质粒经酶切和测序鉴定为正确后转染293T细胞进行表达,分别用Western blot和间接免疫荧光鉴定EtLDH基因的表达情况。Western blot结果可见大小约为37 kDa的目的蛋白条带,间接免疫荧光可以检测到特异性红色荧光。结果表明成功构建了EtLDH的真核重组表达质粒pCAGGS-EtLDH和pCAGGS-EtLDH-IFN-γ,并能在真核细胞中表达,为深入研究EtLDH的生物学功能和球虫DNA疫苗的研制奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫研究概况

本文简要介绍柔嫩艾美耳球虫生活史、生物学特性、卵囊形状、以及卵囊产量的影响因素，对柔嫩艾美耳球虫日龄与粪便卵囊产量进行科学的分析，旨在为疾病的治疗和预防提供依据。     

柔嫩艾美耳球虫分泌性蛋白生物信息学分析

为了分析柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)外分泌性蛋白的功能与结构以及预测其作为疫苗候选抗原的可能性,本试验将E.tenella第二代裂殖子与马-达氏牛肾细胞(MDBK细胞)通过Transwell小室进行无血清间接共培养12 h,收集培养液上清,利用液相色谱-串联质谱仪(LC-MS/MS)进行系列定性检测。将检测到的数据连接Mascot检索软件鉴定蛋白液中蛋白质的组成。运用生物信息学软件预测这些蛋白质的二级结构、跨膜结构域、亲/疏水性、信号肽、抗原表位和三维结构等。生物信息学分析得到的4种蛋白均无跨膜区,具有高疏水性,具有多个抗原表位,Hsp90和Histone 4存在信号肽,而HP和Ribosomal protein不存在信号肽。表明这些蛋白有潜在的免疫原性,可能成为柔嫩艾美耳球虫最为重要的潜在药物靶点或疫苗候选抗原。     

柔嫩艾美耳球虫泛素蛋白功能初步研究

泛素是真核生物中普遍存在的一种小分子蛋白,广泛参与细胞内蛋白质的平衡代谢过程,对维持细胞内环境的稳态具有重要作用.为研究泛素在柔嫩艾美耳球虫中的功能,本研究利用PCR方法克隆了柔嫩艾美耳球虫泛素(EtUb)基因,将其亚克隆至原核表达载体pET28a(+),转入大肠杆菌BL21,诱导表达制备rEtUb蛋白,用纯化的重组蛋...     

柔嫩艾美耳球虫病毒的鉴定

鸡球虫病是由艾美耳属（Eimeria）的一种单细胞寄生性原虫引起的严重危害养禽业发展的重要疾病之一,遍及世界各地。感染鸡的艾美耳属球虫中,国外已报道在巨型艾美耳球虫（E.maxima）,堆型艾美耳球虫（E.acervu-lina）,毒害艾美耳球虫（E.necatrix）和布氏艾美耳球虫（E.brunetti）中发现了病毒粒子或病毒RNA。但是作为危害最严重的柔嫩艾美耳球虫是否有病毒感染,国内外迄今尚无报道。本研究首次在柔嫩艾美耳球虫中发现病毒并对其进行了鉴定。通过核酸分析、RNA依赖的RNA聚合酶（RDRP）活性和电镜形态观察对病毒进行鉴定。核酸酶的敏感性试验结果表明在柔嫩艾美耳球虫总核酸电泳图谱上观察到的大小分别为1.4、2.4和3.6kb的3条病毒带均不能被DNA酶（100mg/L）降解,但可被RNA酶（1.0mg/L）降解,表明这些核酸为RNA。另外,这些核酸不能被高盐浓度（0.3mol/L NaCl）RNase A（10mg/L）降解,但可被低盐浓度（0.015mol/L NaCl）RNase A（10mg/L）降解,并且采用α-32P标记的UTP掺入法测得该病毒样核酸具有RNA依赖RNA聚合酶（RDRP）活性,表明这些核酸为双链RNA（dsRNA）。利用蔗糖梯度离心和透射电镜技术对柔嫩艾美耳球虫病毒进行了分离和鉴定。电镜负染观察到柔嫩艾美耳球虫病毒粒子外观呈球形,二十面体,无囊膜,直径38nm。     

柔嫩艾美耳球虫保护性抗原应用研究进展

鸡球虫病是一种重要的鸡寄生虫病,长期以来药物防治成为抗球虫病的主要手段,但由于药物的残留和耐药性等问题,使得鸡球虫病的免疫学研究受到广泛关注。本文对柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段重要的免疫保护性抗原研究进行了综述,旨在为鸡球虫病的免疫防治提供新思路和参考。     

柔嫩艾美耳球虫的抗原分析

本文采用十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳，免疫印渍技术，用抗柔嫩艾美耳球虫抗体分析了第二代型殖子、子孢子和未孢子化卵囊的蛋白质。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳银染表明第二代裂殖子主要蛋白质为：１７．６ＫＤ，２９．９ＫＤ，３８．９ＫＤ和５３．７ＫＤ，但用抗Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ抗体免疫印渍法检测出的主要抗原为：７８．０ＫＤ，８３．２ＫＤ和９５．５ＫＤ，这说明并不是含量高的蛋白质就是产生抗体的抗原；子孢子蛋白质含     

柔嫩艾美耳球虫交叉抗药性试验

以雏鸡为试验对象,以抗球虫指数(ACI)为判断指标,检测5 mg/kg马杜霉素,70 mg/kg盐霉素,1 mg/kg 地克珠利对抗盐霉素株、抗地克珠利株和实验室保存的敏感株的控制效果。结果表明,马杜霉素对3 个虫株都有很好的抑杀效果,地克珠利也可有效地控制抗盐霉素株,同时,盐霉素也可有效地控制抗地克珠利株,说明盐霉素和地克珠利2种药物之间没有交叉抗药性。     

一种柔嫩艾美耳球虫棒状体蛋白单抗的制备及初步应用

利用原核表达的柔嫩艾美耳球虫棒状体蛋白（EtRP）的重组蛋白免疫BALB／c小鼠,经4次免疫后取脾脏制备免疫脾细胞,与小鼠骨髓瘤细胞SP2／0融合,经间接ELISA和Western blot筛选获得一株抗EtRP蛋白的特异性单克隆抗体细胞株,命名为2E3,亚类鉴定为IgG2a。细胞上清和小鼠腹水的效价分别为1：40和1：2．56×10^4。利用该单抗对EtRP在柔嫩艾关耳球虫子孢子中的分布进行分子定位,结果显示该蛋白主要分布于子孢子的顶端;而当子孢子在DMEM培养基中41℃孵育1h后,该蛋白则分布于整个虫体。研究结果表明,成功制备了EtRP单克隆抗体,为进一步研究球虫相关蛋白功能奠定了基础。     

柔嫩艾美耳球虫低温保存方法的研究

在对球虫的研究、疫苗生产和球虫病的诊断中离不开球虫的保存和保种,目前常规的保存方法是将球虫的孢子化卵囊保存在2.5%重铬酸钾中,置于4℃,一般保存期不超过1年.1年内必须进行鸡体传代,以保持球虫活力,这不仅浪费大量的人力和物力,而且增加了虫种被污染的机会.     

鸡柔嫩艾美耳球虫和巨型艾美耳球虫双重PCR检测方法的建立

为了建立一种能够快速实现对鸡柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)和巨型艾美耳球虫(E.maxima)同时进行检测的双重PCR方法,基于2种艾美耳球虫各自的ITS-1基因筛选2对特异性引物,对制备的阳性DNA样品进行PCR扩增,凝胶电泳检测结果显示,分别在约450bp和150bp处出现目的条带。对PCR反应中的退火温度、MgCl2浓度、DNA模板量等进行优化。结果表明,当退火温度为59℃、MgCl2浓度为2.5mmol/L、DNA模板量为2μL时,双重PCR扩增结果最佳。特异性检测结果显示,所建立的双重PCR对环形泰勒虫、羊巴贝斯虫、隐孢子虫和蓝氏贾第虫的扩增结果均呈阴性,表明建立的方法具有较高的特异性。成功建立了柔嫩艾美耳球虫和巨型艾美耳球虫双重PCR检测方法,为临床中鸡球虫病的快速诊断提供了一种可靠的检测方法。     

柔嫩艾美耳球虫侵入相关抗原研究进展

鸡球虫作为胞内寄生原虫给禽类养殖业的发展带来严重危害。论文详细介绍了柔嫩艾美耳球虫微线蛋白、棒状体蛋白、表面抗原、折光体蛋白及热休克蛋白等侵入相关抗原,并对其侵入宿主细胞的相关机制进行了阐述。同时,概述了宿主感染虫体后所发生的细胞及体液免疫应答,并对未来鸡球虫病的相关研究做了展望。     

柔嫩艾美耳球虫YL株抗药性研究

用柔嫩艾美耳球虫杨凌株 ( YL t)对 1 4日龄雏鸡进行感染 ,检测了该虫株对 4种常用抗球虫药 (马杜拉霉素、地克珠利、克球粉和氯苯胍 )的敏感性。以最适抗球虫活性百分率、抗球虫指数、相对卵囊产量和病变记分减少率为指标 ,进行综合评定 ,其抗药程度分为无抗药性、轻度抗药性、中度抗药性和完全抗药性 4个等级。结果表明 ,该虫株对马杜拉霉素有轻度抗药性 ,对地克株利有完全抗药性 ,对克球粉和氯苯胍无抗药性。     

柔嫩艾美耳球虫莆田株抗药性研究

为掌握鸡场球虫抗药程度,以便制定合理用药方案,采集福建省莆田市某鸡场盲肠球虫,进行柔嫩艾美耳球虫单卵囊分离和纯化;采用鸡体试验法,设立5个用药组、1个感染不用药对照组和1个不感染不用药对照组,以病变记分减少率(Reduction of lesion sores,RLS)、抗球虫指数(Anticoccidial index,ACI)、相对盲肠卵囊产量(Relative at oocyst production,ROP)和最适抗球虫活性百分率(Percent of optimum anticoccidial activity,POAA)4项为指标,检测该球虫对癸氧喹酯、尼卡巴嗪、地克珠利、二硝托胺和氯苯胍等5种常用抗球虫药的抗药性。结果表明:该虫株对癸氧喹酯敏感,对地克珠利、二硝托胺和氯苯胍具有完全抗药性,对尼卡巴嗪为中度抗药性,说明目前莆田市球虫抗药性非常严重,癸氧喹酯可用于抗球虫病,其他药物应慎用或暂停使用。     

鸡柔嫩艾美耳球虫表面抗原蛋白SAG17的生物信息学分析

为了分析鸡柔嫩艾美耳球虫表面抗原蛋白SAG17的蛋白质结构以及预测其作为疫苗候选抗原的可能性,试验采用蛋白分析专家系统(Ex PASy)、DNAMAN、DNAStar、Gene Runner等生物信息学软件,对SAG17的开放阅读框、理化性质、信号肽、二级结构、跨膜结构域、亲/疏水性、修饰位点以及抗原表位等进行分析与预测。结果表明:SAG17全长813 bp,其蛋白由270个氨基酸组成,理论分子质量为28 741.23 u,分子式为C1252H1979N339O411S12,原子总数为3 993个,等电点为4.81,含有7个丝氨酸磷酸化位点、16个苏氨酸磷酸化位点、2个酪氨酸磷酸化位点、7个O-糖基化位点、1个N-糖基化位点、2个赖氨酸ε-氨基糖基化位点、1个GPI修饰位点、4个SUMO蛋白附着位点、13个潜在的抗原表位、4个跨膜区,无信号肽。在SAG17基因中α螺旋占44.44%,β转角占10.00%,无规卷曲占32.59%,延伸链占12.96%,含有13个抗原表位。说明SAG17具有潜在的免疫原性,可用于研制安全、高效的球虫疫苗。     

柔嫩艾美耳球虫感染对鸡血清凋亡蛋白的影响

为了研究柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）感染对鸡血清细胞凋亡相关蛋白的影响,探讨柔嫩艾美耳球虫与宿主相互作用,将240只体重接近的7日龄海兰灰公雏鸡分为4组：A组为不感染不诱导凋亡组;B组为不感染诱导凋亡组;C组为感染不诱导凋亡组;D组为感染诱导凋亡组。诱导凋亡的处理方法是采血前2.5 h按6.4 mL/kg体重灌服40%酒精诱导凋亡,不诱导凋亡的处理则同时灌服与40%酒精等体积的生理盐水替代。于柔嫩艾美耳球虫感染（每只鸡感染1×10⁵个柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊）后第24、48、72、96、120 h,每组抽取10只鸡心脏采血,制备血清,采用ELISA法检测血清中细胞色素C（Cyto-C）、半胱氨酸蛋白酶（Cas）-9、Cas-8、Cas-3、B细胞淋巴瘤/白血病（Bcl）-2、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、Bcl-XL、BH3结构域凋亡诱导蛋白（Bid）的浓度。结果显示,感染后24、48、72、96 h D组Cyto-C、Cas-9、Cas-8、Cas-3的浓度均低于B组,感染120 h D组Cyto-C、Cas-9、Cas-8、Cas-3的浓度均显著高于B组（P<0.05）,感染24、48、72、96 h D组Bcl-2/Bax和Bcl-XL/Bid值均高于B组,感染120 h D组的Bcl-2/Bax低于B组,Bcl-XL/Bid值高于B组。说明柔嫩艾美耳球虫感染早期通过Bcl-2/Bax值、Cyto-C、Cas-9、Cas-8、Cas-3浓度的增加来抑制宿主细胞凋亡,感染中晚期通过Bcl-2/Bax值、Cyto-C、Cas-9、Cas-8、Cas-3浓度的降低促进宿主细胞凋亡。     

柔嫩艾美耳球虫早熟株的内生发育及其致病性

为了给鸡球虫早熟弱毒疫苗的开发提供依据,对柔嫩艾美耳球虫(Eim eria tenella) 北京株经10 代早熟选育获得的早熟株的内生发育研究发现,其第2 代裂殖生殖发育较快,第2 代裂殖体含裂殖子较少,提前进入配子生殖,从而造成卵囊“早熟”。该早熟株致病性大大下降,经口感染10×104 个/只的致病性仅相当于剂量0.1×104 个/只亲本毒株的致病性。该虫株可作为研制早熟弱毒苗用虫株。