猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白研究进展

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的猪的传染病,对养猪业危害很大.GP5蛋白是PRRSV ORF5基因编码的一个糖基化的囊膜蛋白,具有较好的免疫原性,能够诱导产生中和抗体.因此,GP5蛋白在PRRSV的致病性、诊断、预防与控制等方面研究中具有重要意义,是研制基因工程疫苗的最佳候选基因.近年来对GP5蛋白的研究取得了重要的进展,现就GP5蛋白的特征、免疫作用及疫苗等方面做一综述.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒湘潭分离株GP5基因的遗传进化分析

湖南湘潭某猪场母猪出现流产、死胎等症状,疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染所致,将2头病猪肺脏样本送至实验室进行分子生物学诊断与分析。结果显示:样品均检测为PRRSV阳性,GP5序列同源性分析结果显示:PRRSV湘潭分离株与HP-PRRSV分离株(JXA1、CH-1a和TJ等)核苷酸同源性为94.2%～99.3%;与其它型PRRSV毒株同源性相对较低。遗传进化分析结果显示,研究获得的2株PRRSV毒株与国内流行的高致病性毒株(HP-PRRSV)所属分支相隔较近,提示研究获得的2株PRRSV分离株为高致病性毒株,且其GP5抗原表位存在变异。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒国内分离毒株GP3、GP5和N蛋白抗原性分析

本研究利用抗美洲型病毒株的GP3、GP5和N蛋白的11株单克隆抗体,对国内分离毒株的GP3、GP5和N蛋白的抗原表位进行鉴别,并同国外参考毒株VR-2332、NVSL(美洲型,B型)、Lelystad(欧洲型,A型)及商品化疫苗毒的抗原多样性进行了比较与分析.通过对免疫过氧化物酶单层试验改进,建立了免疫荧光单层试验(IFMA),并采用该方法对国内分离毒株的GP3、GP5和N蛋白的抗原特性进行了鉴定,研究结果发现国内分离毒株和北美洲型VR-2332株的抗原性比较相近,而与欧洲型LV株的GP3、GP5的抗原性差异较大.根据N蛋白的单克隆抗体(ISU15A-E)与国内分离毒株的反应谱,按照美国L.Yang等[3]分类方法,本试验中的国内分离毒株均属于Ⅰ组.     

2株猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离、鉴定及遗传进化分析

Two strains of porcine reproductive and respiratory syndrome viruses (PRRSV) were isolated from serum of some pig farms in Guangdong province and showed PRRSV positive in RT-PCR testing. The two viruses could passage stably and cause typical cenotaphic effect, they were named as LZ-GD and LB-GD. The analysis of variable region sequences of ORF5 and Nsp2 of the two viruses showed that LZ-GD and LB-GD strains were far to Europe strain Lelystad, the homology of nuclear nucleotide sequence were 63.5% and 63.8%, respectively, with classic American strain VR-2332 were 88.7% and 89.1%, respectively, and that with highly pathogenic JXA-1 strain were 99.2% and 99.3%, respectively. There were 30 amino acids deletion in Nsp2. It shared the deletion with JXA-1, HUN4 and other pathogenic variant. Thus, the two strains of PRRSV belonged to highly pathogenic American type.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP3与GP5蛋白在杆状病毒表面的展示

选择猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) GP5和GP3蛋白作为免疫原,将杆状病毒的表面展示系统作为载体,成功构建了重组转座载体pBacSC-GP5与pBacSC-GP3,通过转化DH10Bac,筛选蓝白斑,转染昆虫Sf-9细胞,获得重组杆状病毒BacSC-GP5、BacSC-GP3。重组病毒感染Sf-9细胞后,经Western blot和激光共聚焦显微镜观察,目的蛋白在感染细胞中获得表达,并且成功展示在了感染细胞的质膜上。将重组病毒经蔗糖梯度超速离心纯化后,经Western blot和免疫透射电镜观察,目的蛋白在重组病毒上获得表达,展示在重组病毒的囊膜上。研究为开发PRRSV新型疫苗奠定基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒河南分离株GP4蛋白免疫活性研究

克隆猪繁殖与呼吸综合征病毒河南分离株的ORF4基因,将疏水序列缺失后,再克隆到原核表达载体pET-32a中,得到阳性重组质粒,经IPTG诱导,纯化后由Western blotting分析,并将所得的包涵体、变性蛋白和复性蛋白分别免疫小鼠,获取的血清抗体进行效价和中和活性的检测。为深入研究GP4蛋白的免疫特征奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒华南株GDjm全基因组测序与遗传进化分析

为监测猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)基因变异情况,对广东地区某猪场患有猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)仔猪的肺脏样品进行检测及病毒分离,在猪肺泡巨噬细胞(PAM)上成功分离1株病毒并命名为GDjm株,然而分离的毒株不能感染Marc-145细胞。全基因组进化分析、同源性比对及重组分析结果显示,GDjm属于重组毒株,与GDZS2016的同源性为96.2%,与中国高致病性毒株HUN4同源性为96.0%,与美洲型经典毒株VR-2332的同源性为87.4%,与NADC30同源性为82%,与欧洲型毒株Lelystad-virus同源性为57.9%。NSP2序列比对和同源性分析结果显示,GDjm与高致病性毒株HUN4、JXA1、JXwn06相似,在511、534～562位存在氨基酸缺失。GP5序列比对以及同源性分析结果显示,GDjm毒株在GP5抗原表位存在氨基酸突变。经重组分析得出GDjm株为高致病性毒株HUN4与华南地区流行毒株GDZS2016的重组毒株,重组区域为6 723～9 521 bp、11 998～15 019 bp。     

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒宁夏株ORF5基因遗传进化分析

为了解宁夏地区感染猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的基因型和遗传变异情况,收集2008~2014年宁夏4个地区临床疑似发病猪的血清和组织,病毒核酸提取后用特异性引物进行RT-PCR扩增、凝胶电泳和测序,鉴定9份阳性样品。并与国内外猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒代表毒株进行序列比和遗传进化分析。结果表明,9个毒株的ORF5基因中7株属于美洲IV型,2株属于美洲I型。说明宁夏流行的猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒均属于美洲型,但病毒亚型之间已发生变异,为PRRSV遗传进化分析和疫病防控提供了新的参考。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白单克隆抗体,首先构建猪PRRSV GP5基因的真核重组表达载体pCDNA-GP5,将其作为免疫原,对Balb/c小鼠进行免疫。取免疫4次后的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。构建PRRSV GP5基因的原核重组表达载体pGEX-6P-GP5,将其转化至大肠埃希菌Rosetta(DE3)并诱导表达。以表达的原核蛋白GP5作为单克隆抗体的筛选抗原,通过间接ELISA进行杂交瘤细胞株的检测和筛选。本研究成功构建了GP5基因的真核重组表达载体pCDNA-GP5,表达并纯化了GP5蛋白。经2~3次亚克隆后获得3株针对GP5蛋白的杂交瘤细胞株,IFA和Western blot对3株杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体进行了鉴定。GP5蛋白单克隆抗体的成功研制,为进一步建立特异性PRRSV检测方法奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白的原核表达及鉴定

为获得猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白,以一株PRRSV NADC30-like毒株的基因组RNA为模板,利用RT-PCR扩增出ORF5基因后,将该基因克隆至原核表达载体pCold-TF中,构建了重组质粒pCold-TF-GP5,转化Rosetta(DE3)后用IPTG诱导,经SDS-PAGE、Western blot鉴定,重组蛋白获得了可溶性表达,大小约为72 ku。将该蛋白过镍柱纯化后获得浓度为0.5 mg/mL的纯化蛋白,为下一步GP5蛋白单克隆抗体的制备奠定物质基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白在酿酒酵母中的定位研究

为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)gp5基因在酿酒酵母中表达后蛋白的定位位置,以此揭示PRRSV在感染细胞中获取囊膜的位置信息,本研究首先将gp5基因克隆到酿酒酵母表达载体pUG35的gfp基因上游,构建重组质粒pUG-gp5-gfp,电击导入酿酒酵母CEN.PK2中,经尿嘧啶缺陷型营养筛选,获得重组酵母pUG-gp5-gfp/CEN.PK2,在甲硫氨酸营养缺陷培养基诱导表达后,荧光显微镜观察显示,gp5-gfp融合基因在酿酒酵母中获得表达,所表达的融合荧光蛋白主要聚积位置与内质网和质膜的定位模式一致,表明GP5蛋白信号肽在酵母中起到了导向作用,揭示了PRRSV在宿主细胞中获得囊膜的可能位置。该研究为其他病毒在宿主细胞中的组装位置研究提供新的思路。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒截短型GP3蛋白的原核表达

<正>猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一种严重危害养猪业的高度传染性疾病。该病已经成为影响国内养猪业最主要的也是最为棘手的疾病[1]。PRRSV是含有包膜的单股正链RNA病毒,属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属[2]。PRRSV基因组含9个开放阅读框(ORF),从基因组     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5/M蛋白可溶性表达及免疫原性分析

为表达出高可溶性的GP5/M蛋白并检测其免疫原性,本试验将高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)HN07-1毒株ORF5和ORF6基因序列上GP5和M蛋白的编码核苷酸序列进行密码子偏爱性优化设计,构建了GP5/M融合Grifin、GST、MBP、NusA、Sumo、Thioredoxin、γ-crystallin、ArsC、PpiB、CeHSP17共10种不同可溶性标签的表达重组载体。分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导,SDS-PAGE电泳对融合蛋白的可溶性表达进行检测,筛选出高可溶性表达的GP5/M融合蛋白。重组蛋白通过Ni-NTA Agarose亲和纯化,免疫家兔,对获得的兔抗GP5/M血清进行间接ELISA和病毒中和试验。结果显示,成功构建10个GP5/M表达载体,10个标签中,MBP与GP5/M蛋白相融合的可溶性表达效果最好,并获得了高纯度的MBP-GP5/M重组蛋白质;通过免疫家兔,检测重组蛋白具有免疫原性并能刺激机体产生较高水平的中和抗体。结果表明,试验成功建立了稳定获得GP5/M重组蛋白质的方法,初步鉴定了重组蛋白的免疫效力,为PRRSV亚单位疫苗的后续研究及大量制备奠定基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒E蛋白研究进展

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的高度接触性传染病,主要引起母猪繁殖障碍,表现为妊娠后期流产、死胎、木乃伊胎及弱仔。E蛋白是由ORF2b编码的一个非糖基化结构蛋白,分子质量约10 ku,具有影响病毒复制的作用,促使病毒粒子脱壳,但对病毒的装配不起作用,认为具有离子通道蛋白活性。作者就E蛋白的特性、亚细胞定位和拓扑结构、离子通道活性作一综述。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白的研究进展

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是20世纪80年代末期出现的一种新病,它的症状主要表现为流产、早产、死胎、木乃伊胎、仔猪成活率急剧下降和育成猪呼吸道症状等.20世纪90年代中期猪繁殖与呼吸综合征先后在亚洲的菲律宾、日本、韩国、台湾省爆发.1996年,哈尔滨兽医研究所的郭宝清等人首次从国内阳性血清猪群中分离到猪繁殖与呼吸综合征病毒,并证实我国也有该病发生.2006年,在我国大部分省份流行猪繁殖与呼吸综合征,该病又称为"猪高热综合征".     

猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白的研究进展

目前PBRS已成为国内外的研究热点,在开展了大量的调查与研究工作的基础上,PRRS在流行病学、免疫学及致病机理、实验室诊断技术、综合防治等方面都取得了新的进展。本文就PRRS病原在蛋白水平上的研究进展作一综述,为进一步研究PRRS的病原特性及其预防与诊断方法提供科学依据。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白在昆虫细胞中的可溶性表达

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) GP5蛋白是该病毒基因工程亚单位疫苗研究的重要靶向抗原,基因变异较大,且难以高效表达.本研究通过比对美洲型PRRSV 3种基因亚型的代表性毒株GP5蛋白的氨基酸序列,选取其同源性较高的氨基酸序列组合为杂合GP5 (xGP5m),并在其N端分别添加3种穿膜肽序列(TAT、ppTG20...     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白在疫苗上的应用研究进展

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是影响养猪业发展的主要病原。GP5蛋白是PRRSV的主要糖蛋白,是中和抗体的主要靶标。因此,GP5蛋白的研究在PRRSV感染的诊断和新型基因工程疫苗的研发上具有重要意义。近年来,对于GP5蛋白的研究取得了重要的进展,本文就GP5蛋白的特性、功能和应用等方面进行综述。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白研究进展

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是引起猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的病原,该病毒自发现以来受到国内外学者的高度重视,对病毒结构蛋白的研究也正在逐步深入和完善.论文综述了近年来PRRSV结构蛋白的最新研究进展,特别对新发现的5a蛋白的结构与功能、决定病毒入侵的细胞受体及与其结合的病毒囊膜蛋白等问题进行深入分析,从而...     

猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白GP3调节Claudin 4促进其早期感染的分子机制研究

正猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)是危害养猪业的重要病原之一。PRRSV基因组具有高变异性,新的变异株不断出现,致使现有疫苗保护力不理想;加之缺乏有效药物,其致病机制也不完全清楚,使得该病更加难以防控。