猪源盖塔病毒Cap蛋白与E2蛋白多克隆抗体的制备及其免疫特性分析

采用RT-PCR技术扩增猪源盖塔病毒(Getah virus, GETV)的衣壳蛋白(Cap)与糖蛋白(E2)基因,构建了Cap与E2蛋白的原核表达载体pET-Cap和pET-E2,转化至BL21(DE3)诱导大量表达。纯化并复性原核表达的目的蛋白,免疫BALB/c小鼠,制备了Cap蛋白和E2蛋白的多克隆抗体,间接ELISA效价达1∶10~5以上。Western blot和免疫荧光(IFA)结果显示,Cap蛋白和E2蛋白多抗与GETV均有良好的反应性。本研究制备的Cap蛋白与E2蛋白多克隆抗体,为建立ELISA等检测方法以及GETV致病机制的研究提供了参考。     

乙型脑炎病毒SXBJ07株E基因的克隆及原核表达

为构建乙型脑炎病毒(JEV)SXBJ07株E基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行高效表达;根据JEV SXBJ07株基因组全序列设计1对特异性引物,RT-PCR扩增E基因全长;将目的基因插入pGEM-T连接载体,筛选出阳性重组质粒;将该质粒克隆至原核表达载体pET32α中,再转化入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达后对其产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western-blot检测。结果表明:扩增到了全长为1 500 bp的JEV SXBJ株E蛋白基因;重组质粒pET-32α-E构建成功;融合蛋白可以与乙脑阳性血清抗体特异性结合。说明在大肠杆菌中成功表达了JEV E蛋白。     

非洲猪瘟病毒结构蛋白p54的优化表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为了实现非洲猪瘟病毒(Africanswinefevervirus,ASFV)p54基因在大肠杆菌中的高效表达，同时建立以ASFV-p54重组蛋白为抗原的间接ELISA抗体检测方法，本试验根据Gen Bank(序列号：NC＿044943.1)公布的ASFV p54的基因序列，设计一对特异性引物，扩增构建p GEX-6P-1-p54原核表达质粒，在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行复制，经IPTG诱导表达，对重组蛋白利用SDS-PAGE分析和免疫印迹鉴定正确后，进行表达条件优化，并纯化重组蛋白。随后用ASFV-p54重组蛋白为包被抗原，通过条件优化、特异性试验、敏感性试验和重复性试验，建立一种稳定的血清ASFV抗体检测方法。结果显示，ASFV p54基因成功克隆到p GEX-6P-1原核表达载体中，得到p GEX-6P-1-p54原核表达质粒；转化E. coli菌株BL21(DE3)中，经诱导表达得到重组蛋白，大小为46k Da；成功建立测定ASFV抗体的间接ELISA方法，优化后确定最佳包被浓度为1.2μg/mL，待检血清最佳稀释倍数1∶100，最佳封闭液为1%BSA，酶标抗体最佳稀...     

非洲猪瘟病毒结构蛋白p54的优化表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为了实现非洲猪瘟病毒(Africanswinefevervirus,ASFV)p54基因在大肠杆菌中的高效表达,同时建立以ASFV-p54重组蛋白为抗原的间接ELISA抗体检测方法,本试验根据Gen Bank(序列号：NC＿044943.1)公布的ASFV p54的基因序列,设计一对特异性引物,扩增构建p GEX-6P-1-p54原核表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行复制,经IPTG诱导表达,对重组蛋白利用SDS-PAGE分析和免疫印迹鉴定正确后,进行表达条件优化,并纯化重组蛋白。随后用ASFV-p54重组蛋白为包被抗原,通过条件优化、特异性试验、敏感性试验和重复性试验,建立一种稳定的血清ASFV抗体检测方法。结果显示,ASFV p54基因成功克隆到p GEX-6P-1原核表达载体中,得到p GEX-6P-1-p54原核表达质粒;转化E. coli菌株BL21(DE3)中,经诱导表达得到重组蛋白,大小为46k Da;成功建立测定ASFV抗体的间接ELISA方法,优化后确定最佳包被浓度为1.2μg/mL,待检血清最佳稀释倍数1∶100,最佳封闭液为1%BSA,酶标抗体最佳稀...     

猪瘟病毒E2蛋白重组T4噬菌体的构建及免疫学特性

利用重组 PCR技术将猪瘟病毒 (CSFV) E2基因与 T4噬菌体 SOC基因 C端融合 ,构建了大小为 12 33bp的SOC/ E2融合基因 ,将其插入携带 T4溶菌酶基因 (e)和 denv基因的 T4重组载体 (p RH) ,构建了重组载体 p RSE2 ,通过重组载体与缺失突变型 T4噬菌体基因发生同源重组 ,将 SOC/ E2融合基因整合入 T4噬菌体的基因组中。经EL ISA、Western blot等免疫学检测证实 ,T4噬菌体表达的 E2融合蛋白具有 CSFV免疫学活性 ,动物试验证实 T4 .SOC.E2重组噬菌体免疫鼠后能诱导产生特异性的猪瘟抗体     

牛病毒性腹泻病毒E_0-E_2融合基因重组卡介苗的构建

为了增强重组卡介苗对牛病毒性腹泻黏膜病的免疫效果,本研究将敲除疏水氨基酸及密码子优化的E0基因与去除了C末端的疏水序列E2截短基因采用重叠延伸PCR的方法进行融合后,将其分别与p MV261/p MV361载体连接,电转化至卡介苗中,构建重组卡介苗。45℃热诱导重组卡介苗表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blotting分析。结果证明E0-E2融合基因在卡介苗中成功表达,目的蛋白大小为66.5 ku,且具有反应原性。     

抗人红细胞/抗猪瘟病毒双功能单链抗体的制备及功能鉴定

旨在构建检测猪瘟病毒(CSFV)的双功能单链抗体。通过连接肽将抗人红细胞膜H抗原单链抗体基因2E8-ScFv和抗猪瘟病毒单链抗体基因CSFV-ScFv拼接成融合基因,大肠杆菌密码子优化及人工合成后,构建原核表达载体pCzn1-2E8-CSFV,转化BL21(Plyss)进行重组蛋白IPTG的诱导表达,利用SDS-PAGE对表达产物进行鉴定,通过间接免疫荧光(IFA)、ELISA和血凝试验,验证重组蛋白双功能活性。结果表明,重组蛋白主要以包涵体形式在大肠杆菌中表达,分子质量约为55 kDa。IFA和ELISA结果表明,纯化复性后的重组蛋白与猪瘟病毒具有良好的结合活性;红细胞凝集试验表明,重组蛋白能与人红细胞特异性结合,同时也能与猪瘟病毒发生特异性结合,具有双功能特性。本研究成功表达了抗人红细胞膜H抗原/抗猪瘟病毒双功能单链抗体,为进一步构建猪瘟病毒红细胞凝集试验快速检测方法奠定基础。     

乙型脑炎病毒E蛋白N端片段在大肠杆菌中的表达

利用 PCR扩增乙型脑炎病毒 E蛋白基因 5′端片段 ,克隆入原核表达载体 p ET-2 8a,转化大肠杆菌 BL2 1 ( ED3 )。经 IPTG诱导表达后 ,SDS-PAGE分析表达产物。结果表明 ,所表达的E蛋白片段的分子量约为 3 .4万 ,表达量约占菌体总蛋白的 3 5%。 JEV E蛋白片段在大肠杆菌中的成功表达 ,为制备 JE实验室诊断抗原和分析 E蛋白基因结构与功能的关系提供条件     

牛支原体p30蛋白的原核表达与鉴定

为了实现牛支原体p30蛋白在大肠杆菌中的高效表达,试验根据GenBank发表的p30(登录号为AIA33998.1)基因序列,在不改变p30蛋白氨基酸序列的情况下优化基因序列,全基因合成p30基因,并将其克隆到pET28a(+)载体中,构建的重组质粒pET28a(+)-p30转化至BL21(DE3)工程菌中进行诱导表达,筛选重组菌pET28a(+)-p30/BL21(DE3)诱导表达的最适诱导温度、诱导时间及IPTG诱导浓度,利用His-tag镍柱纯化p30重组蛋白,并对纯化后的重组蛋白进行鉴定。结果表明:当重组菌株pET28a(+)-p30/BL21(DE3)诱导条件为37℃、IPTG浓度为0.1 mmol/L、诱导4 h时,p30蛋白表达量最高;SDS-PAGE电泳显示经镍柱纯化后p30蛋白达到了电泳纯,经Western-blot分析,目的蛋白具有抗原特异性,在36 ku处有明显的蛋白印迹条带,与预期大小相符。说明成功实现了在大肠杆菌中高效表达牛支原体p30重组蛋白。     

牛病毒性腹泻病毒HB-bd毒株E2基因的克隆表达及免疫原性分析

为了研究牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的免疫原性,试验采用PCR技术扩增牛病毒性腹泻病毒HB-bd毒株去除跨膜区的E2基因,将获得的s E2基因克隆到p ET20b载体构建重组质粒p ET20bs E2,并转化大肠杆菌BL-21(DE3)感受态细胞及诱导表达,应用SDS-PAGE、Western-blot和Dot-ELISA对表达产物进行分析,取纯化的表达产物加等量佐剂免疫家兔,观察免疫效果。结果表明:s E2基因得到了高效表达,表达的重组蛋白分子质量约为37.0 ku,表达产物能诱导免疫家兔产生高效价抗BVDV抗体。说明表达产物s E2蛋白具有良好的免疫原性。     

鲤春病毒(SVCV)糖蛋白基因的原核表达

通过将鲤春病毒血症病毒(Spring Viremia of Carp Virus,SVCV)糖蛋白(Glycoprotein,G)基因截短后构建重组表达载体,实现体外高效表达G蛋白,为有关原核诱导蛋白提供参考。以质粒pEGFP-G为模板设计引物,分别扩增G基因的不同片段,与密码子优化后的G基因分别插入pET-32a表达载体,构建重组表达载体pET-32a-GX和pET-32a-OG。经过鉴定后,将重组质粒分别转入大肠杆菌BL21(DE3),通过适宜条件的诱导表达,获得诱导产物并进行SDS-PAGE和Western blotting检测。构建了重组表达载体pET-32a-GX与含密码子优化后G基因的重组表达载体pET-32a-OG;经适宜条件诱导表达了G蛋白后的SDS-PAGE和Western Blotting检测,表明G蛋白成功表达,且含截短片段的重组载体pET-32a-G2的蛋白表达量最高,与原G序列有相同的免疫原性。成功构建截短后的原核表达载体pET-32aGX与密码子优化后的重组表达载体pET-32a-GX,并实现体外大量诱导SVCV的G蛋白。     

表达禽流感病毒HA蛋白及传染性法氏囊病毒VP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒的构建

为构建同时表达禽流感病毒(AIV)HA蛋白及传染性法氏囊病毒(IBDV)VP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒(r HVT),本研究以本实验室构建的连续覆盖火鸡疱疹病毒(HVT)全基因组的5个重组粘粒(p Fos A、p Fos B、p Fos C、p Fos D和p Fos E)为基础,利用猪捷申病毒2A蛋白的编码序列,将HA基因和VP2基因串联,并克隆于p CAGGs载体中,构建重组质粒p CA-HA-2A-VP2。利用Gateway LR克隆技术,将重组质粒中的HA-2A-VP2的表达盒(Pec-HA-2A-VP2-POLYA)插入到p Fos C粘粒中HVT片段的复制非必需区HVT053与HVT054基因之间,构建重组粘粒p Fos C-5354-HA-VP2。将p Fos A、p Fos B、p Fos D、p Fos E和p Fos C-5354-HA-VP2 5个重组粘粒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),制备表达HA蛋白及VP2蛋白的重组火鸡疱疹病毒(r HVT-5354-HA-VP2)。将重组病毒在CEF中连续传至20代后,通过PCR、间接免疫荧光和western blot鉴定分析,结果显示HA与VP2基因能够在重组病毒中稳定存在并正确表达;生长动力学结果表明,重组病毒在CEF中的增殖效率与野生型病毒HVT无显著差异。该重组病毒的制备为研制AIV-IBDV-马立克病毒三联苗奠定了基础。     

猪圆环病毒2型ORF2基因片段的原核表达

猪圆环病毒2型(PCV2)的衣壳蛋白由ORF2编码。采用PCR技术扩增得到ORF2基因片段,克隆入p UCm-T载体,构建了重组质粒p UCm-PCV2-ORF2。根据p UCm-PCV2-ORF2测序结果设计引物,用Pfu酶扩增替换稀有密码子三联体。改造后的基因片段连接入表达载体p GEX-4T-1,并转化到BL21(DE3)宿主菌,成功构建了GST-PCV2-ORF2蛋白大肠杆菌工程菌。经诱导表达后,对以包涵体形式存在的GST-PCV2-ORF2重组蛋白进行纯化、复性。复性后的GST-PCV2-ORF2重组蛋白具有良好的反应原性。     

非洲猪瘟病毒p72蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备

为了研发非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)的免疫学诊断试剂，试验将ASFV B646L基因克隆至pET-30a(+)载体中构建表达载体pET-30a(+)-p72,利用大肠杆菌表达系统表达重组蛋白，采用SDS-PAGE分析诱导表达的大肠杆菌，以镍柱对重组蛋白进行纯化，通过SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定纯化的重组蛋白。用纯化后的重组蛋白免疫Balb/c小鼠，通过细胞融合方法制备杂交瘤细胞。采用间接ELISA方法筛选并检测单克隆抗体，以Western-blot及IFA方法鉴定单克隆抗体的特异性，并通过Mouse Monoclonal Antibody Isotyping ELISA Kit鉴定单克隆抗体的亚型。结果表明：PCR扩增得到大小约为1 941 bp的B646L基因，并成功构建了表达载体pET-30a(+)-p72。诱导表达的大肠杆菌在72 ku处出现目的条带，纯化后的重组蛋白p72在72 ku处出现目的条带。筛选出4种单克隆抗体2C7D8、2E6D12、3B10E3、4G5E6,其效价在1∶100 000～1∶500...     

猫免疫缺陷病毒p24基因原核表达载体的构建及表达

为了研究猫免疫缺陷病毒(Feline immunodeficiency virus,FIV)的核衣壳蛋白(core nucleocapsid protein)——p24蛋白的免疫活性,试验根据Gen Bank中FIV的p24基因序列设计了1对引物,对FIV检测阳性的猫血液样本提取总RNA并进行反转录,PCR扩增p24基因,将此目的片段克隆到原核表达载体p ET-28a(+)中,构建获得重组质粒p ET-p24,并热转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,诱导蛋白表达后用SDS-PAGE和Western-blot进行鉴定,用FIV感染的猫阳性血清和重组p24蛋白免疫小鼠得到的多克隆抗体对表达蛋白的免疫原性和反应原性进行检测。结果表明:RNA反转录成c DNA后成功扩增出大小为622 bp的p24基因和构建出原核表达载体;构建成功的含p ETp24重组质粒的大肠杆菌诱导后能大量表达FIV-p24蛋白,并且p24蛋白以包涵体形式存在;p24蛋白具有良好的免疫原性和反应原性。说明p24蛋白是具有生物学活性的蛋白,在猫免疫缺陷病的诊断和防治中具有重要意义。     

犬细小病毒SH14株VP2基因原核表达及免疫原性分析

根据犬细小病毒(Canine Parvovirus,CPV)SH14株基因序列设计引物,采用PCR方法扩增CPV VP2基因,经Bam HⅠ、XhoⅠ双酶切后,将其克隆至p GEX-4T-1载体,构建重组表达载体p GEX-4T-VP2,经酶切鉴定和测序验证正确后转化大肠杆菌BL21中进行诱导表达,应用SDS-PAGE法检测蛋白的表达。然后,使用纯化的重组VP2蛋白制备其兔源多克隆抗体,分别应用蛋白免疫印迹、间接免疫荧光检测该抗体的免疫原性。结果表明,p GEX-4T-VP2能在大肠杆菌中以包涵体形式高效表达,所制备的兔抗CPV-VP2抗体能与重组蛋白和病毒蛋白发生特异性反应。本研究为研发CPV亚单位疫苗、检测技术及致病机理研究等奠定了物质基础。     

定点突变的猪源性胰高血糖素样肽-2融合蛋白的原核表达与鉴定

为提高胰高血糖素样肽-2(GLP-2)生产效率以适应畜牧生产应用的需求,本试验利用基因工程技术表达出定点诱变的p[Gly2]GLP-2。用甘氨酸取代GLP-2氨基末端第2位的丙氨酸后,再根据大肠杆菌的偏好性对p[Gly2]GLP-2序列进行优化并在目标肽序列N-端添加肠激酶识别位点,合成基因序列,通过KpnⅠ和XhoⅠ双酶切位点连接到pET-40b(+)构建原核重组表达载体p[Gly2]GLP-2-pET-40b(+),重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,诱导表达重组蛋白。优化后最适表达条件为:菌液D_(600 nm)值为0.6时,用0.2 mmol/L IPTG在37℃诱导培养5 h;最终得到p[Gly2]GLP-2重组蛋白表达量较高的基因工程菌株。通过镍离子亲和层析柱纯化及分梯度洗脱获得纯度较高的p[Gly2]GLP-2融合蛋白,本结果为后续p[Gly2]GLP-2功能性的研究及其在畜牧生产的应用奠定了基础。     

副猪嗜血杆菌外膜蛋白OmpP2的原核表达与鉴定

为获得副猪嗜血杆菌(HPS)外膜蛋白中的穿孔素前体蛋白P2(Omp P2)基因的表达产物,利用特异性引物以HPS血清13型江西分离株扩增omp P2基因,并将其克隆到p MD18-T载体中进行序列测定和分析。结果表明:omp P2全基因含一个1 092 bp的开放阅读框,编码一个含363个氨基酸的蛋白,与所报道的HPS omp P2基因(登录号:HM172029.1)的同源性为100%。再将其亚克隆于原核表达载体p ET-32a(+)中构建重组表达质粒p ET-32a(+)-omp P2。后转化至受体菌大肠杆菌BL21(DE3),进行IPTG诱导。经SDS-PAGE检测,表达的重组蛋白分子质量与预期的58 ku一致。Western blot分析表明,表达产物与HPS阳性血清能发生反应,显示表达产物具有良好的反应活性。     

猪圆环病毒2型ORF2可溶性表达条件的优化

为探索猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因在大肠杆菌中高效可溶性表达的条件,扩增ORF2基因构建重组表达质粒p ET30a-ORF2,转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态获得重组表达菌;通过改变菌体培养温度和时间、诱导温度和时间、溶解氧量、IPTG及CaCl_2浓度,实现目的蛋白高效可溶性表达。结果表明:重组表达质粒p ET30a-ORF2经酶切及测序证明构建正确,重组表达质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中实现可溶性表达,其最佳表达条件为:在500 mL培养瓶中加入200 mL LB卡那霉素阳性培养基,菌体于37℃培养4 h后,分别加入IPTG及Ca Cl2至终浓度为0.6 mmol/L及0.06 mol/L,30℃诱导表达4 h;重组Cap蛋白的最高表达量占总蛋白的55.9%。说明优化后可实现猪圆环病毒Cap蛋白的可溶性表达,这为进一步研究该蛋白的结构及其生物学特性奠定了基础。     

瘦蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

采用 RT- PCR方法从猪脂肪组织扩增出瘦蛋白基因 ,将其插入 p MD1 8- T克隆载体 ,经序列分析证明 ,所获得的目的基因为 4 4 1 bp,与预期大小一致。提取质粒后用 Eco R 和 Xho 双酶切 ,克隆入 p ET- 2 8a表达载体 ,将阳性重组质粒转化表达受体菌 E.coli BL 2 1 ( DE3) ,经 IPTG诱导 ,SDS- PAGE检测 ,证明在 E.coli BL 2 1中正确表达了重组猪瘦蛋白