天蚕素在动物生产中的应用

天蚕素具有改善动物生产性能、提高动物机体免疫力及调节动物肠道微生物群落结构等多种生理功能。文章针对天蚕素抗菌肽的组成、构效关系、作用机制、克隆与表达及其在动物生产中的应用作一综述,并展望其应用前景。     

天蚕素抗菌肽及其在动物生产中的应用

天蚕素抗菌肽具有提高动物生产性能、改善动物机体免疫力、维护动物肠道菌群平衡等多种生理功能。文章从天蚕素抗菌肽的来源、结构、作用机理、生物学功能及其在动物生产中的应用入手,并对其存在的问题和发展前景进行分析。     

天蚕素抗菌肽的性质、功能及应用研究进展

天蚕素(Cecropin)是发现的第1个动物抗菌肽,具有抗细菌、真菌、病毒、肿瘤、寄生虫等多种生物活性。文章总结了天蚕素抗菌肽的性质、结构,重点综述了天蚕素基因工程重组表达系统、表达策略,生物活性及应用现状等研究,并对相关研究发展趋势进行了展望。     

抗菌肽天蚕素B基因及其串联体在毕赤酵母中的表达

通过重叠区扩增基因拼接法(SOE)合成抗菌肽天蚕素B基因,并在其N端引入Kex2酶切位点.亚克隆天蚕素B并将3个亚克隆串联在一起,每个单体前都加上Kex2酶切位点,将天蚕素B以及串联体克隆至表达载体pPICZαA上,用Sac Ⅰ酶切使之线性化,采用电击法转化毕赤酵母SMD1168,转化子用小瓶发酵.经Tricine-SDS-PAGE检测,在α信号因子的引导下,表达产物可以分泌到培养基中,且具有明显抑菌活性.     

抗菌肽天蚕素B基因及其串联体在毕赤酵母中的表达

通过重叠区扩增基因拼接法(SOE)合成抗菌肽天蚕素B基因,并在其N端引入Kex2酶切位点.亚克隆天蚕素B并将3个亚克隆串联在一起,每个单体前都加上Kex2酶切位点,将天蚕素B以及串联体克隆至表达载体pPICZαA上,用Sac Ⅰ酶切使之线性化,采用电击法转化毕赤酵母SMD1168,转化子用小瓶发酵.经Tricine-SDS-PAGE检测,在α信号因子的引导下,表达产物可以分泌到培养基中,且具有明显抑菌活性.     

逆转录病毒介导的天蚕抗菌肽B在奶牛乳腺中的表达

为了研究天蚕抗菌肽在奶牛乳腺组织长期表达的可行性以及对大肠杆菌的抑制作用,将天蚕抗菌肽B(cecropinB,CB)的基因序列以哺乳动物偏爱的密码子优化后,合成了四条相互重叠的DNA片段,通过重叠延伸PCR法获得了天蚕抗菌肽B的基因,将其亚克隆至T栽体,测序正确后构建逆转录病毒载体pLNCX_bCP-cecB,经过包装细胞的包装,获得含有天蚕抗菌肽B表达框的逆转录病毒,注射入奶牛乳腺组织,通过琼脂板孔穴扩散法检测基因的表达及活性;实验结果表明,克隆的抗菌肽基因在乳腺中获得了表达,表达产物对大肠杆菌具有抑制作用,抑制效果可以持续至13天以上.     

转基因水稻外源基因的遗传和表达初步研究

将天蚕抗菌肽B基因应用基因枪法导入水稻TN1发芽肿胚，获得转基因植株2株，转基因水稻T1－T5 5个世代不同株系，对bar基因、抗菌肽基因的遗传和表达进行初步研究。结果表明：转基因后代株系bar^R:bar^S在部分符合3：1分离比率。T1、T4转基因株系PCR、Southern印迹分析表明，T18株有抗菌肽B基因；T4仍有4个株系有抗菌肽基因，其他的株系基因丢失，T3 1个株系Northern印迹证明抗菌肽基因在RNA水平有表达；抗菌肽B转基因水委对白叶枯病的抗病性有提高，抗性能传递到高世代，在T3得到抗病性提高的株系。     

紫花苜蓿抗旱耐盐碱转基因抗性苗耐盐性研究

在紫花苜蓿抗旱、耐盐碱转基因抗性苗和对照苗的组织培养过程中模拟盐胁迫生境,经0%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、1.1%、1.3%、1.5%、1.7%、1.9%NaCl处理15 d后,苜蓿转化苗和苜蓿对照苗的盐适应性生长性能发生变化.观察统计了转基因抗性苗和无菌苗在盐胁迫下的成活率;测定了这2组苜蓿植株的根长和叶片的电导率.结果表明:转化苗比对照苗耐受盐胁迫的能力要高,转化苗能够耐受1.3%的NaCl盐浓度,在NaCl浓度为1.5%时其生长才开始受到损伤,而对照苗只能在NaCl浓度0.5%以下正常生长,在NaCl浓度为0.7%时其生长即开始受到伤害.同时,在盐胁迫下,转化苗的根生长能力要强于对照苗.在同一盐浓度下转化苗的细胞膜透性比对照苗的细胞膜透性要低,表明苜蓿转基因抗性苗比对照苗耐受盐伤害的能力强.     

紫花苜蓿MsCOL1基因植物表达载体的构建及拟南芥转化

[目的]构建紫花苜蓿MsCOL1基因植物的表达载体。[方法]根据紫花苜蓿CONSTANS类似基因MsCOL1基因(登录号:DQ661682)序列,设计含有酶切位点的一对特异性引物,以紫花苜蓿cDNA为模板,获得MsCOL1基因完整编码区DNA序列,并将目的片段插入表达载体pBI121的相应位置,构建植物表达载体35S∷MsCOL1,再利用农杆菌介导方法将35S∷MsCOL1转化到拟南芥中。[结果]分析测序结果显示,所获得克隆为插入目的片段的阳性克隆。经RT-PCR检测,证明转基因植株中MsCOL1基因能够顺利表达。[结论]该方法成功构建植物表达载体35S∷MsCOL1,并获得了转基因拟南芥植株。     

天蚕变态期神经分泌细胞的组织学研究（Ⅰ）：——脑神经分泌细胞

采用ＰＴｈ－Ｐｈ染色法，查明天蚕脑中存在着Ａ、Ｂ两类神经分泌细胞。分布于脑间部的中央群神经分泌细胞，由Ａ、Ｂ两种细胞组成；侧群神经分泌细胞则主要由Ｂ细胞组成。Ａ细胞的轴突有交叉现象。还对变态期间神经分泌细胞的大小，数量变化进行了调查研究。     

紫花苜蓿高频体胚发生及萌发成苗技术与转基因应用

以紫花苜蓿的子叶或叶片为外植体,建立高频体胚发生及成苗技术体系,为苜蓿耐逆性状的遗传改良提供技术支撑。在愈伤诱导、体胚诱导、体胚成熟与萌发等几个关键环节,分析比较培养基组分对培养效果的影响。建立在SHDK培养基上诱导愈伤、MB(-/+)+ABA 0.4mg/L+PEG-6000 50g/L+蔗糖50g/L培养基上诱导体胚、Bio2Y培养基上促体胚发育成熟、1/2 MS(或SH)培养基上体胚萌发成苗的高频再生技术体系。最适条件下,每克胚性愈伤组织可产生77.9个正常萌发成苗的健康体胚。再生植株在生长箱内经过2周20℃、16h/d的光照培养后移栽温室,成活率达90%以上。利用该离体再生技术成功地将凝集素基因PPA导入苜蓿中,获得抗蚜转基因苜蓿。     

转柠檬酸合成酶基因苜蓿耐铝性研究

【目的】通过对渝苜1号转柠檬酸合成酶(CS)基因和对照株的根尖进行耐铝性试验,旨在找到转基因苜蓿耐铝性的适宜条件,明确转基因株较对照株表现出来的耐铝效果。【方法】以对照株和转CS基因4号苜蓿为材料,设计0、5、15、30和50μmol·L-15个氯化铝浓度梯度,每个处理3个重复,测量前3d根尖的伸长情况。【结果】在5个氯化铝浓度下,对照株和转基因株在第1天的根尖伸长都显著的高于第2天和第3天;转基因株第2天在15、30和50μmol·L-13个氯化铝浓度下的根尖伸长显著高于第3天,而对照株的根尖在第2天和第3天基本停止伸长。随着铝浓度升高,根尖伸长受阻越严重。对照株在15μmol·L-1铝处理的第1天根尖还能基本正常伸长,但在第2天即使5μmol·L-1铝处理,根尖伸长已严重受阻,这说明对照株耐铝浓度低于15μmol·L-1。而转基因株当氯化铝浓度达到30μmol·L-1时,根尖伸长才开始明显受阻(P0.05)。【结论】渝苜1号CS转基因苜蓿的耐铝条件为氯化铝浓度15-30μmol·L-1,处理2d;转基因苜蓿相对于对照株表现出明显的耐铝性。     

紫花苜蓿MsUGT73B2基因的克隆及表达

糖基化是植物体蛋白、激素等物质的常见修饰方式,对维持植物正常生长发育具有重要作用,在植物中糖基化反应由糖基转移酶催化。利用蒺藜苜蓿参考序列通过RACE法克隆得到紫花苜蓿基因MsUGT73B2的全长序列,利用生物信息学方法分析其氨基酸序列、二级结构、理化性质等,RT-qPCR分析基因表达情况,构建基因表达载体,研究亚细胞定位。结果表明,MsUGT73B2基因全长1 512bp,编码503个氨基酸,属于稳定的亲水性蛋白,序列比对结果显示其属于UGT家族基因,亚细胞定位于细胞质中。MSOGT73B2主要在紫花苜蓿叶片中表达,且干旱、10μmol/L ABA处理下在2h之前升高,之后下降;在150mmol/L NaCl胁迫处理下表现为4h之前表达水平升高,之后下降的趋势。     

紫花苜蓿不同发育时期次生壁合成调控的转录组分析

【目的】探讨紫花苜蓿次生壁合成的基因网络调控变化和表达模式,确定一些关键候选基因和转录因子,为紫花苜蓿次生壁加厚调控网络的分子机制研究奠定基础。【方法】对‘中苜1号’紫花苜蓿分枝期（S1）、现蕾期（S2）、初花期（S3）和盛花期（S4）的茎进行近红外光谱法测定次生壁主要物质含量和Illumina HiSeq^TM 2500高通量转录组测序。以紫花苜蓿的近缘物种蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）基因组作为参考基因组进行序列比对并组装构建转录本。利用FPKM法计算基因表达量,以Fold change（差异表达倍数）≥2或≤0.5（表达上调或下调）、FDR（false discover rate）≤0.05为筛选条件,在3个相邻时期转录组比较组合中（S2vs S1,S3 vs S2,S4 vs S3）筛选差异表达基因。通过Gene Ontology数据库和KEGG Pathway数据库对紫花苜蓿不同发育时期差异表达基因的功能和参与的代谢途径进行注释。【结果】共获得41 734个基因在紫花苜蓿不同发育时期的转录表达情况,27个功能注释与紫花苜蓿纤维素、木质素合成密切相关的基因差异表达,其变化趋势与纤维素和木质素含量测定结果基本一致,即随着生长发育时期的变化,表达水平逐渐提高。研究表明,初花期是紫花苜蓿次生壁合成调控的转折期,纤维素和木质素含量与其合成基因表达量在初花期均显著提高。MTR_2g016630（Ces）和MTR_7g103590（Ces A1）等纤维素合成酶基因表达水平在初花期显著上升,木质素合成途径中,MTR_1g064090（PAL1）、MTR_1g111240（C4H）和MTR_2g104960（CCR）基因表达量在初花期或盛花期相比分枝期上调表达倍数达到10倍以上。本研究中27个与植物生长发育相关的转录因子在紫花苜蓿不同发育时期差异性表达,其中NAC家族和MYB家族转录因子有18个,也有少量WRKY、BHLH、ERF、C3H等转录因子。【结论】获得‘中苜1号’紫花苜蓿在4个生长发育时期茎的基因表达谱数据,共获得54个差异表达基因,其中稳定上调基因24个,稳定下调基因30个。这些基因很有可能参与紫花苜蓿次生壁的合成调控。     

外源蛋白在苜蓿体细胞胚中的表达

【目的】探讨转基因苜蓿植株根、茎、叶和体细胞胚中外源GUS的表达情况,为外源蛋白在苜蓿体细胞胚中的积累提供理论依据。【方法】以在加拿大广泛种植的N4.4.2紫花苜蓿品种的叶柄为外植体,进行农杆菌GV3101介导的苜蓿遗传转化,将感染的苜蓿叶柄外植体置于不同的转化培养基中培养,获得了适合于农杆菌介导的转基因苜蓿植株,将其用于转基因体细胞胚的诱导。采用PCR方法筛选阳性株系,并对其进行GUS组织化学染色分析,对转基因植株根、茎、叶和体细胞胚进行荧光定量分析。【结果】以苜蓿叶柄为外植体成功获得11株阳性转基因植物,转化效率为30.6%。GUS荧光定量分析结果表明,体细胞胚中GUS外源蛋白的表达量明显高于根、茎和叶,是其表达量的3～6倍;根、茎和叶中GUS表达量较低,且三者间没有明显差异。【结论】苜蓿体细胞胚能积累相对高的外源蛋白,是外源蛋白表达的最佳材料,为外源蛋白大量工厂化生产奠定了实验基础。     

赤霉素对根瘤菌运移、定殖及苜蓿幼苗生长的影响

【目的】研究赤霉素对荧光标记根瘤菌运移和定殖的动态及接种对甘农5号紫花苜蓿(Medicago sativa L.Gannong No.5)幼苗生长的影响,为增强根瘤菌向苜蓿体内尤其向繁殖器官转移并定殖的能力,促进苜蓿种植业发展提供理论依据和技术支持。【方法】分别向Ensifer meliloti LZgn5f(gn5f)和Ensifer meliloti 12531f(12531f)两种根瘤菌液内添加0.5、1、10和100 mg·L~(-1)赤霉素,测定第1、3、5、7和9天两种根瘤菌OD600吸光度值,同时将添加不同赤霉素的菌液分别浇灌于幼苗根部,于接种后第15、30、45和60天检测根瘤菌在根和地上各组织内运移和定殖及对苜蓿幼苗生长的情况。【结果】添加10 mg·L~(-1)赤霉素稍可促进12531f生长,但效果并不明显;而1 mg·L~(-1)赤霉素对gn5f生长初期效果较好,但随着时间的延长则无明显作用。10 mg·L~(-1)赤霉素促进12531f运移并定殖到下部茎、上部茎和上部叶内,1 mg·L~(-1)赤霉素促进gn5f运移并定殖到下部茎和下部叶内,以无菌水为对照的各组织内未检测到两种荧光标记根瘤菌。单独接种12531f和gn5f,均促进了叶绿素的形成,而添加赤霉素后接种均抑制了叶绿素的形成,但12531f添加10 mg·L~(-1)赤霉素、gn5f添加1 mg·L~(-1)赤霉素接种可使幼苗单株结瘤数、单株根瘤重、单株叶片数、株高、根长、地上干重和根干重则均达最高。其中12531f添加10 mg·L~(-1)赤霉素接种后苜蓿单株结瘤数分别高出对照和单独接菌处理75.71%和11.82%,但差异不显著(P0.05);单株根瘤重分别高出对照和单独接菌处理1 136.11%和55.05%,差异显著(P0.05);单株叶片数分别高出对照和单独接菌处理113.94%和78.28%,差异显著(P0.05);株高分别高出对照和单独接菌处理83.33%和50.24%,差异显著(P0.05);根长分别高出对照和单独接菌处理115.28%和29.17%,差异显著(P0.05);地上干重分别高出对照和单独接菌处理214.27%和206.43%,差异显著(P0.05);根干重分别高出对照和单独接菌处理1 156.19%和1 049.53%,差异显著(P0.05)。gn5f添加1 mg·L~(-1)赤霉素接种后苜蓿单株结瘤数分别高出对照和单独接菌处理82.86%和4.07%,但差异不显著(P0.05);单株根瘤重分别高出对照和单独接菌处理697.22%和105.00%,差异显著(P0.05);单株叶片数分别高出对照和单独接菌处理32.12%和19.13%,株高分别高出对照和单独接菌处理95.24%和37.82%,根长分别高出对照和单独接菌处理76.39%和5.83%,但各处理间均无显著差异(P0.05);地上干重分别高出对照和单独接菌处理125.98%和121.80%,差异显著(P0.05);根干重分别高出对照和单独接菌处理864.43%和762.21%,差异显著(P0.05)。【结论】分别添加10 mg·L~(-1)和1 mg·L~(-1)赤霉素后利于12531f和gn5f在苜蓿体内的运移和定殖并对结瘤、叶片生长、株高、根长、生物量均有促进作用,表明适宜赤霉素浓度可作为促进目标根瘤菌运移和定殖的方法,进而促进植株生长。     

紫花苜蓿对Cd胁迫的响应及品种差异研究进展

为利用紫花苜蓿对Cd污染土壤进行修复和综合利用提供理论基础。综述了紫花苜蓿对Cd胁迫的响应,包括:紫花苜蓿的生长对Cd的响应存在"低促高抑"现象;紫花苜蓿对Cd吸收的可能途径包括根表皮质膜的H+交换、Ca~(2+)和Mg~(2+)阳离子通道,根际环境和Cd元素在土壤中的有效态等因素会影响紫花苜蓿对Cd的吸收;在Cd由根部向地上部转运的过程中,随着土壤Cd含量的增加,更多的Cd被累积在紫花苜蓿的根部;紫花苜蓿应对土壤Cd胁迫的调控机理包括信号分子调控、抗氧化系统调控、生物巯基化合物对Cd的螯合、调节Cd的亚细胞分布和耐Cd基因的表达等多个方面。总结了紫花苜蓿对Cd胁迫响应的品种差异,主要表现在:种子萌发和幼苗生长;根瘤生长、植株形态和生物量;生理指标;对Cd的吸收与累积等方面。今后的研究工作可重点关注品种差异评判标准的建立、差异显著品种的系统筛选、在分子水平上的响应机理及品种差异机理的分析等方面。     

新疆野生樱桃李PsoRPM2与PsoLFY互作调控植株开花的分子机制

为明确新疆野生樱桃李PsoRPM2基因引起植株的早开花现象,本研究通过形态学、转基因以及酵母双杂等试验对PsoRPM2基因进行了分析。结果显示:新疆野生樱桃李极早花、早花、中花、晚花和极晚花的比率分别为11%、24%、44%、18%和3%。早花类型的花芽分化明显快于晚花类型,早花花芽中的PsoLFY和PsoFT基因表达高于晚花,而PsoFLC基因则在晚花中表达较高。转PsoRPM2基因烟草表现为早花,并且NtLFY基因表达明显升高。在新疆野生樱桃李早花花芽中,PsoRPM2基因表达高于晚花,同一时期的PsoLFY基因表达也较高。酵母双杂试验显示,PsoRPM2与PsoLFY可以互作。综上,新疆野生樱桃李之所以早花是通过PsoRPM2与PsoLFY互作,提高花芽中PsoLFY和PsoFT基因表达,从而加快花芽分化进程,导致植株提前开花。     

转抗坏血酸过氧化物酶基因（APX）菊苣抗旱相关生理特性

在获得转抗坏血酸过氧化物酶基因(APX)菊苣株系的基础上,对3个转基因株系的抗旱相关生理特性进行分析。结果表明：正常供水条件下,转基因株系与非转基因植株各项生理指标差异不显著;干旱条件下, 3个转基因株系菊苣叶片APX质量摩尔浓度均显著高于非转基因对照。3个转基因株系中有2个株系丙二醛（MDA）质量摩尔浓度低于非转基因对照,表明APX基因可显著提高菊苣APX活性,降低氧自由基浓度,减轻对细胞的伤害。3个转基因株系叶片相对含水量、脯氨酸质量分数、叶绿素质量分数、单株幼苗的根系生长量,均高于非转基因对照。可见,转APX基因菊苣具有较强的抗旱能力,从而验证APX基因的抗旱功能,为转基因材料应用于菊苣的抗旱育种提供依据。     

Enhanced Stem Nematode Resistance of Transgenic Sweetpotato Plants Expressing Oryzacystatin-I Gene

Enhanced stem nematode resistance of transgenic sweetpotato (cv. Lizixiang) was achieved using Oryzacyslatin-I (OCI)gene with Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. A. Tumefaciens strain EHA 105 harbors a binary vector pCAMBIA1301 with OCI gene, gusA gene and hptⅡ gene. Selection culture was conducted using 25 mg L-1 hygromycin. A total of 1715 plants were produced from the inoculated 1 450 cell aggregates of Lizixiang via somatic embryogenesis. GUS assay and PCR analysis of the putative transgenic plants randomly sampled showed that 90.54% of them were transgenic plants. Transgenic plants exhibited significantly enhanced resistance to stem nematodes compared to the untransformed control plants by the field evaluation with stem nematodes. Stable integration of the OCI gene into the genome of resistant transgenic plants was confirmed by Southern blot analysis, and the copy number of integrated OCI gene ranged from 1 to 4. Transgene overexpression in stem nematode-resistant plants was demonstrated by quantitative real-time PCR analysis. This study provides a way for improving stem nematode resistance in sweetpotato.