miRNA对干细胞重编程的影响

miRNA在胚胎干细胞(ES)细胞的自我更新及多能性中扮演重要角色,国内外研究结果表明,在体细胞形成诱导性多能干细胞(IPS)的过程中,许多miRNA与Sox2、Oct4和Nanog等调控因子组成调控网络。miRNA在细胞周期、重编程及表型建立过程中也起着重要的调控作用。另外,在IPS细胞形成中,miRNA很有可能代替关键转录因子。     

哺乳动物细胞核重编程方法学研究进展

多莉羊的成功克隆表明分化细胞在环境因素的影响下可以重编程为胚胎的全能状态,此后体细胞核移植一直是细胞核重编程研究的有力工具。但是技术操作上的繁琐及其伦理上的约束限制了核移植在许多国家的应用。细胞移植、细胞融合、细胞提取物、体外建立诱导模型等方法可以直接并有效地改变细胞命运,并越来越多地应用到细胞核重编程的研究中。已发现卵母细胞、胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、畸胎癌细胞、成体干细胞、甚至终端分化的体细胞都有使细胞核重编程的能力,但是在重编程过程中发挥作用的关键因子还不清楚。     

山羊乳腺上皮细胞重编程过程中细胞上清液外泌体不同提取方法的比较

为了比较不同方法提取山羊乳腺上皮细胞重编程过程中细胞上清液外泌体的效果，试验采用超速离心法和试剂盒法提取细胞上清液中的外泌体，利用透射电子显微镜观察外泌体形态，以纳米流式仪检测外泌体浓度和粒径，Western-blot法检测外泌体表面标志物蛋白并通过Image J软件分析其相对表达量。结果表明：超速离心法和试剂盒法提取的外泌体均具有圆盘状的双层膜结构，且轮廓清晰，但是试剂盒法提取的外泌体中存在其他蛋白质颗粒。超速离心法提取获得的外泌体较为分散，外泌体粒径集中在55～60 nm之间；试剂盒法提取获得的外泌体大小更为均一，外泌体粒径集中在58 nm左右。两种方法提取的外泌体表面特异性标志物CD63和TSG101蛋白均呈阳性。试剂盒法提取的外泌体浓度极显著高于超速离心法(P<0.01),提取的外泌体表面特异性标志物CD63和TSG101蛋白相对表达量也极显著高于超速离心法(P<0.01)。说明超速离心法和试剂盒法均可以从山羊乳腺上皮细胞重编程过程的细胞上清液中提取出外泌体，区别在于超速离心法提取的外泌体纯度更高，试剂盒法提取的外泌体浓度更高。     

基因组表观重编程对体细胞核移植成功率的影响

基因组表观重编程缺陷是影响体细胞核移植效率的主要因素,本文讨论了表观重编程的两大主要机制——DNA甲基化及组蛋白修饰及其对体细胞核移植重构胚胎发育的影响,并综述了几种促进核重编程的方法。     

基于RNA-Seq数据分析葡萄糖诱导绵羊卵泡颗粒细胞衰老的差异表达基因

【目的】 探讨葡萄糖对绵羊卵泡颗粒细胞衰老及其基因表达的影响。【方法】 将原代分离培养的绵羊卵泡颗粒细胞分别用含17.5(H组)和2 mmol/L(L组)葡萄糖的培养基进行体外培养, 细胞处理72 h后, 利用β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老, 采用RNA-Seq技术进行转录组测序, 对差异表达基因进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析, 并用实时荧光定量PCR验证锚定蛋白重复域蛋白1(ANKRD1)、白细胞介素8(IL-8)、催产素(OXT)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NOX4)基因的表达量。【结果】 H组β-半乳糖苷酶染色阳性细胞率极显著高于L组(P<0.01)。转录组测序结果显示, 两组间存在401个差异表达基因, 其中上调基因153个, 下调基因248个, 高糖诱导的细胞异常相关基因9个, 细胞周期相关基因6个。GO功能富集分析发现, 差异表达基因参与了细胞过程、生物调节、代谢过程、多细胞生物过程及细胞运动等生物过程, 在细胞成分上主要富集在胞外区、膜、突触、细胞器及超分子复合体等, 在分子功能主要富集在催化活性、整合、转运活性、分子功能调节剂及结构分子活性等。KEGG信号通路富集分析发现, 差异表达基因主要富集在糖尿病并发症中的晚期糖基化产物(AGE)-晚期糖基化终末产物受体(RAGE)信号通路、肿瘤坏死因子(TNF)信号通路、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)信号通路等。实时荧光定量PCR结果表明, 与L组相比, H组IL-8基因表达水平极显著上调(P<0.01), ANKRD1基因表达水平显著上调(P<0.05), OXT基因表达水平极显著下调(P<0.01), NOX4基因表达量呈上升趋势, 但差异不显著(P>0.05), 实时荧光定量PCR结果与转录组测序结果一致。【结论】 17.5 mmol/L葡萄糖可诱导绵羊卵泡颗粒细胞衰老及衰老相关基因表达变化, 为葡萄糖诱导颗粒细胞衰老的功能和分子机制提供了依据。     

苜蓿黄酮对脂多糖诱导下奶牛乳腺上皮细胞凋亡的影响

研究苜蓿黄酮对脂多糖(LPS)诱导下奶牛乳腺上皮细胞凋亡的影响。将奶牛乳腺上皮细胞分成4个组,即基础培养基、基础培养基中加入1 μg·mL^-1的LPS、基础培养基中加入1 μg·mL^-1的LPS和75 μg·mL^-1苜蓿黄酮、基础培养基中加入75 μg·mL^-1苜蓿黄酮。细胞在37 ℃, 5% CO₂的培养箱中培养。结果表明:1)LPS刺激12 h后奶牛乳腺上皮细胞活性下降,而添加苜蓿黄酮能够极显著抑制LPS诱导下细胞活性的下降(P<0.01)。2)在LPS刺激下,细胞内的活性氧(ROS)浓度升高,而添加苜蓿黄酮能够显著降低其浓度(P<0.05)。3)LPS显著上调细胞的IL-1β、IL-6、TNF-α、TLR2、TLR4和MyD88表达(P<0.01),而苜蓿黄酮能够显著下调细胞的IL-1β、IL-6、TNF-α和TLR2表达(P<0.01或P<0.05)。4)在LPS刺激下,p53、Caspase3、p38和P-p38蛋白的表达显著升高(P<0.01或P<0.05),而添加苜蓿黄酮能够显著降低p53和p38蛋白的表达(P<0.05)。在LPS诱导下,苜蓿黄酮能够通过降低ROS浓度,抑制细胞凋亡,提高细胞活性;可能通过抑制TLR2/MyD88信号通路来降低细胞炎症因子的表达,从而保护细胞免受炎性损伤。     

WT1基因组蛋白乙酰化修饰对细胞核重编程的影响

利用体细胞移植技术获得克隆动物的成功是几十年来生命科学领域取得的重大突破之一,这项技术引起了社会的广泛关注。然而,由于哺乳动物克隆效率低下,且克隆后代发育异常等问题,已成为目前制约动物克隆技术发展和应用的瓶颈。克隆动物中经常出现后代过大综合征（LOS）,该病导致克隆动物早产、难产和易夭折。LOS类似于人的伯-伟综合征（BWS）,BWS也称为Wlims瘤,表现为巨舌、内脏肿大等症状。研究发现BWS的发病机理与WT1基因（Wilms’tumor 1gene）异常表达有关。本文对体细胞核重编程和表观遗传学调控细胞重编程的研究进展进行综述,并对WT1基因组蛋白乙酰化修饰与体细胞重编程之间的联系进行简要介绍,以期为生命科学领域的进一步探索与研究提供借鉴。     

植物雌激素大豆黄酮对牛乳腺上皮细胞增殖及细胞周期的影响

本试验采用大豆黄酮(DZ)作用于牛乳腺上皮MAC-T细胞,探讨其通过上调雌激素受体β(ERβ)表达对细胞体外增殖及细胞周期的影响,为DZ改善乳腺发育提供依据。采用不同浓度DZ(0～160.0μmol/L)处理MAC-T细胞24 h,通过检测细胞活力确定DZ作用浓度;然后采用不同浓度DZ(0、2.5、5.0和10.0μmol/L)处理MAC-T细胞12、24、36和48 h,通过检测细胞活力确定DZ作用时间;再用生理剂量的雌二醇(E2)作为阳性对照,对各处理细胞进行细胞计数,采用Western blot分析细胞内细胞周期相关蛋白、ERβ蛋白相对表达量,并用流式细胞技术分析细胞周期变化。结果表明：1)与对照组相比,2.5和5.0μmol/L DZ处理细胞均能提高MAC-T细胞活力,其中5.0μmol/L DZ处理显著提高细胞活力(P <0.05);而在浓度高于10.0μmol/L后,细胞活力均有下降,因此确定了DZ作用的低、中和高浓度分别为2.5、5.0和10.0μmol/L;而与对照组相比,处理12 h后,5.0μmol/L DZ处理使得细胞活力显著提高(P<0.05),其他...     

蛋白酶抑制剂MG-132对牛核移植重构胚重编程的影响

旨在探讨MG-132对牛体细胞核移植重构胚重编程的影响。将牛卵母细胞体外培养至MI期,添加不同浓度的MG-132(0、3、5、7、10μmol·mL-1),至成熟后进行激活,通过胚胎的发育情况得出MG-132的合适浓度,并用此浓度的MG-132作用于核移植全过程,来研究MG-132的作用,用免疫组化的方法进一步验证结果。结果,5、7μmol·mL-1MG-132组卵裂率和囊胚率均显著低于对照组和2μmol·mL-1组(P0.05),但这2组间无显著差异(P0.05),而10μmol·mL-1组卵裂率只有23.44%,低于其他各组(P0.05);成熟卵母细胞在5μmol·mL-1MG-132中分别作用0、2、4h激活后,卵裂率、囊胚率均无显著差异(P0.05),而6h组激活后卵裂率、囊胚率均明显降低(P0.05);核移植操作过程中添加MG-132组的卵裂率与对照组相比无显著差异(P0.05),而桑葚胚和囊胚率都较对照组显著升高(P0.05);未添加MG-132组,融合后1h供体细胞几乎无变化,4h后核纤层蛋白(lamin)着色显著,说明染色体凝集不完全;添加组融合4h后,核膜不完全着色,明显发生了染色体凝集。上述结果说明5μmol·mL-1MG-132能够促进重构胚的重编程,但对重构胚移植后的附植和妊娠作用还有待进一步研究。     

动物体细胞核移植后核重编程可能的机制

近年来,核移植在多种动物上取得了成功，但是其效率依然很低。研究表明．核供体不完全或者不正确的后成性重编程可能是核移植效率低下的主要原因，从基因印记、端粒长度变化、X染色体失活、核的变化及参与该变化的酶等方面讨论了核重编程可能的机制。了解核重编程的机制．有助于解决核移植技术中存在的问题．提高核移植的效率．从而更好的为农业和生殖医疗等行业服务．     

牛乳腺上皮细胞的分离培养

为了对牛乳腺上皮细胞(MECs)进行分离、培养和鉴定,并研究细胞分泌功能,试验通过胶原酶消化法分离得到了牛乳腺上皮细胞,采用传代法对细胞进行纯化,对细胞标志蛋白进行免疫荧光染色鉴定,通过体外诱导和RT-PCR分析鉴定细胞的分泌功能。结果表明:分离到的牛乳腺上皮细胞具有典型乳腺上皮细胞的形态特征,表达广谱角蛋白,经诱导后可分泌β-酪蛋白。     

哺乳动物体细胞重编程机制的研究进展

体细胞重编程面临的进程缓慢和效率低下等问题,限制了其向临床应用的转化,该过程涉及细胞内基因表达的变化,认识和调控DNA的表观修饰是成功重编程的关键。本文对体细胞重编程过程中基因表达的表观影响以及去分化和转分化的表观控制进行了阐述,并综述了通过表观遗传修饰或信号转导途径增强重编程效率或替代特殊重编程转录因子的物质,不仅有利于阐明体细胞重编程的机制,也为仅采用化学物质即可诱导出多能干细胞的研究提供参考。     

体细胞重编程为诱导多能干细胞的研究进展

诱导多能干( induced pluripotent stem,iPS)细胞在维持多能的同时能够持续自我更新。由于诱导多能干细胞能够创造病人特异或者疾病特异的多能干细胞,这些细胞对于研究疾病的机理和药物的发现非常有用。作者主要从iPS细胞建立的优化、被重编程的细胞类型、iPS细胞的发育潜能、iPS细胞产生的2种模型及iPS细胞的应用等5个方面进行了综述。     

哺乳动物体细胞核移植的DNA甲基化重编程研究进展

DNA甲基化是基因组主要的表观遗传修饰方式之一.核移植重构胚在对供体细胞基因组进行甲基化重编程过程中会出现异常的甲基化模式,而异常的甲基化重编程是导致克隆胚早期死亡及克隆动物发育畸形的主要原因.论文针对体细胞克隆动物基因组DNA的甲基化模式、造成克隆胚胎甲基化异常的原因及异常甲基化对重构胚胎发育的影响等进行了综述.深入研究核移植重构胚甲基化重编程的机制,有助于完善核移植技术,提高克隆效率,使其更好地应用于基础研究和生产实践.     

供体细胞核在小鼠重构胚胎重编程中的变化

将所观察的细胞固定后,用电子显微镜观察获得微型图片,再利用三维模拟处理器对所采集的图片进行分析,获得了注入的卵丘细胞核的一系列发育图像。从卵丘细胞中的三维模拟图像和核物质中的核仁图像中,发现在这些细胞表面上出现胞质微绒毛,在细胞膜附近存在有细胞骨架的功能性活动。卵丘细胞正处于细胞分裂间期,90%以上的卵丘细胞在排卵时正处于G0/G1期。卵丘细胞中的核物质和染色体在注入到核卵母细胞中后,核物质重编是一个动态的,全部的和显著的过程。     

葎草黄酮对牛乳腺上皮细胞相关基因表达的影响

以奶牛乳腺上皮细胞为细胞模型,用MTT法检测细胞的存活和生长情况,用不同浓度的黄酮溶液(0、100、200、400、600、800mg/L)刺激奶牛乳腺上皮细胞12h,再用相同浓度的黄酮溶液(400mg/L)作用于奶牛乳腺上皮细胞不同时间(1、4、9、12、16、24h),分别提取细胞总RNA,用荧光定量PCR法测定GHR、β-CN、IL-6、IL-8、TNF-α和IFN-γ泌乳相关基因的表达,研究葎草提取物总黄酮对乳腺上皮泌乳及炎性相关因子表达的影响。结果表明,试验组与空白组相比,奶牛乳腺上皮细胞中IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-8的表达水平降低(P0.05);生长激素受体(GHR)、β-酪蛋白(β-CN)的表达量高于对照组(P0.05)。说明葎草黄酮能上调奶牛乳腺上皮细胞β-CN和GHR的表达量,以浓度为400mg/L培养4h~12h的效果最佳。     

脂多糖对牛乳腺上皮细胞自噬和凋亡的影响

为探究脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)对牛乳腺上皮细胞(MAC-T)自噬和凋亡的影响,以MAC-T细胞为试验对象,用CCK-8和乳酸脱氢酶(LDH)法检测不同浓度LPS(100、150、200、250μg/mL),检测细胞的存活率和损伤,从上述分组中挑选浓度为0(对照)、50、100、200μg/mL的LPS建立试验组,Hoechst33342检测细胞核形态,qPCR法检测MAC-T细胞中自噬和凋亡基因(LC3B、p62、BAX、BCL-2、ATG5、ATG7、Beclin-1、caspase-3)mRNA的表达量,Western blot检测MAC-T细胞中自噬和凋亡(LC3B、p62、BAX、BCL-2、ATG5、ATG7、Beclin-1、caspase-3)相关蛋白表达。结果显示,MAC-T细胞的活力会随着LPS的浓度和时间的推移下降,细胞上清中的LDH随着LPS浓度上升而增加,Hoechst33342染色后可以发现细胞核形态出现异型性,染色质碎裂、固缩。qPCR和Western blot检测结果显示LPS在50～100μg/mL浓度下可引起MAC-T细...     

TSA处理供体细胞对组蛋白乙酰化和核重编程效果的影响

克隆胚胎基因组的不完全重编程是克隆动物成功率低的主要原因.试验中以第5代牛胎儿成纤维细胞作为供体核,以牛卵母细胞作为受体胞质进行体细胞核移植,用75 nmol·L-1曲古抑菌素A(Trichostatin A,TSA)分别处理供体细胞6、12和24 h,通过核移植检测克隆胚胎发育率,并应用激光共聚焦显微镜技术和流式细胞术检测处理细胞和克隆囊胚组蛋白H3K18乙酰化水平和细胞周期.结果显示:随着TSA处理时间的延长,供体细胞组蛋白H3K18乙酰化水平不断提高;以75 nmot·L-1TSA处理供体细胞12 h的克隆胚的囊胚发育率显著高于未处理组(23.5%vs 15.7 %,P<0.05);供体细胞经TSA处理的克隆囊胚组蛋白H3K18乙酰化水平与未处理组相比差异不显著(P>0.5);处理组和对照组细胞G0/G1期和S期比例间存在显著差异(P<0.05).结论:TSA对核供体细胞的处理存在时间效应,75 nmol·L-1TSA处理12 h的牛胎儿成纤维细胞更易被卵母细胞重编程,显著提高了克隆胚的体外发育能力,初步证实TSA是通过提高供体细胞组蛋白乙酰化水平来促进供体细胞重编程的.     

CAF-1在体细胞重编程中的作用机制

染色质组装因子1(chromatin assembly factor-1,CAF-1),是由p150、p60、p48三个亚单位组成的组蛋白伴侣.CAF-1主要功能是在DNA复制中与增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)相互作用,负责募集组蛋白H3、H4沉积在新合...     

哺乳动物早期胚胎端粒酶活性的研究进展

端粒位于真核染色体末端，是稳定染色体末端的重要元件。端粒酶（TER）是一种特殊的细胞核蛋白（RNP）反转录酶（RT），其核心酶包括蛋白亚基和RNA元件。在DNA复制过程中的端粒丢失可以被有活性的端粒酶补偿回来。哺乳动物端粒酶在发育中受调控，端粒的重编程可能是由于早期胚胎不同时期的端粒酶活性而造成的，因此，研究胚胎发育早期端粒和端粒酶重编程是非常重要的。本文对端粒和端粒酶的结构和功能，及其与哺乳动物早期胚胎发育的关系进行了综述．并在此基础上展望了端粒和端粒酶在克隆动物胚胎发育上的基础作用。