甘蔗赤霉素氧化酶基因ScGA20ox1的克隆及功能分析

GA20-氧化酶(GA20-oxidase,GA20ox)是赤霉素(gibberellic acid,GA)合成过程中的关键限速酶,但甘蔗GA20ox1基因(ScGA20ox1)的功能及其表达模式尚未明确。本研究利用RT-PCR和RACE技术克隆了甘蔗GA20-氧化酶基因(ScGA20ox1), ScGA20ox1基因全长1574 bp,含有一个1125 bp的完整开放阅读框(open reading frame, ORF),编码375个氨基酸。ScGA20ox1蛋白分子量为42.3 kD,理论等电点为5.95,不含信号肽,不含跨膜结构域,为可溶性蛋白。实时荧光定量PCR结果表明该基因在甘蔗幼苗中茎秆的表达量最高,叶片次之,根的表达量最低;干旱、低温和赤霉素处理均会改变该基因在不同组织的表达模式。利用农杆菌介导法转化拟南芥,获得过表达ScGA20ox1的转基因拟南芥植株,转基因拟南芥植株存在株高增高,节间长度增长的表型变异。本研究结果表明,ScGA20ox1参与甘蔗的生长发育并在响应非生物逆境中发挥重要调控作用,过表达转基因拟南芥形态发生变化,这为深入探究ScGA20ox1生物学功能,...     

棉花CML基因家族成员鉴定与功能分析

【目的】类钙调素(Calmodulin-like,CML)蛋白是1种重要的Ca2+传感器,在调节植物应激反应机制中起重要作用。对CML基因家族进行全基因组学分析,以便深入研究CML基因在棉花逆境胁迫下的作用。【方法】利用生物信息学的方法进行了棉花CML家族成员的鉴定。利用转录组数据和反转录聚合酶链式反应分析陆地棉(Gossypium hirsutum L.)CML基因在盐胁迫下的表达模式。利用病毒诱导基因沉默技术对GhCML44-2基因进行沉默并进行功能验证。【结果】在陆地棉(Gossypium hirsutum L.)、雷蒙德氏棉(G. raimondii Ulbrich)、亚洲棉(G. arboreum L.)中分别获得了154个、74个、78个CML蛋白。进化树和保守基序分析表明,GhCML蛋白分为8个亚类,都含有保守的EF-hand结构域;在盐胁迫下,107个GhCML基因在叶和根中有显著的差异表达,且在根和叶中的差异表达模式不同。启动子分析表明,这些基因启动子中存在多种不同的胁迫响应元件;利用病毒诱导基因沉默技术成功沉默GhCML44-2的棉株相较于对照更加不耐盐。【结论】该研究结果有助于了解棉花CML基因家族的进化与功能,为后续研究其功能提供了一定的理论依据。     

小桐子磷酸葡萄糖变位酶cPGM与pPGM基因的克隆及原核表达分析

为了探究磷酸葡萄糖变位酶(PGM)在植物蔗糖与淀粉代谢中的重要作用,基于同源序列比对的方法,在小桐子基因组中鉴定到1个细胞质型PGM基因(命名为JccPGM)与1个叶绿体型PGM基因(命名为JcpPGM),利用qRT-PCR方法检测JccPGM与JcpPGM基因在小桐子不同器官与低温条件下的表达特性,同时,构建了pGE...     

小桐子miR394家族鉴定及其靶基因的低温表达特性

MicroRNA (miRNA)是植物基因转录与翻译的重要调控因子,miR394参与植物多种抗逆性的调节过程。为深入研究miR394在小桐子抗冷性中的调控机制,利用生物信息学方法对小桐子miR394进行鉴定及靶基因预测,并通过实时荧光定量PCR分析了jcu-miR394及其预测靶基因在低温胁迫下的差异表达特性。结果表明,小桐子中共鉴定到两个miR394基因(jcu-MIR394a, jcu-MIR394b),都可形成稳定的茎环结构,成熟体序列都位于茎环结构的5′端,且都为20 nt (5′-UUGGCAUUCUGUCCACCUCC-3′)。靶基因预测与RT-qPCR表达分析显示,小桐子FBXO6是miR394的潜在靶基因,并可能通过miR394b-FBXO6靶向互作参与小桐子抗冷性过程。本研究结果为开展小桐子miR394参与抗冷性机制研究奠定了基础。     

植物赤霉素生物合成关键基因GA3-oxidase的研究进展

在植物赤霉素合成途径中,GA3ox将无活性的GA12和GA53转变为有活性的GA4和GA1,进而实现了调控植物生长发育。GA生物合成及其信号传导途径相关基因的研究备受关注。本研究对高等植物体内GA3-oxidase基因的克隆、组织表达、调控表达、功能鉴定等方面的研究进行综述,并对进一步深入研究GA3ox的互作、抗逆性等方面进行了展望,揭示GA3-oxidase氧化酶信号网络系统及其作用机制。     

拟南芥低叶绿素荧光LCF3基因的克隆与功能分析

叶绿素荧光动力学技术在测定叶片光合作用中光系统对光能的吸收、传递、耗散、分配等方面具有独特的作用。本研究借助叶绿素荧光成像仪, 从拟南芥EMS诱变突变体库中筛选到一株低叶绿素荧光突变体lcf3-1 (lower chlorophyll fluorescence 3-1)。遗传分析表明lcf3-1突变体为单基因隐性突变。突变基因图位克隆结果显示LCF3是PsbW的等位基因。另外, LCF3基因的T-DNA插入突变体及功能回补转基因植物的叶绿素荧光分析结果, 均证明LCF3基因突变导致拟南芥叶绿素荧光F_v/F_m值降低。进一步实验证明LCF3蛋白定位于叶绿体, 且LCF3基因在植株中普遍表达。PsbW蛋白可能细微调整PSII-LHCII超复合体的组装及稳定。     

不同贮藏条件对贵州小桐子花粉活力的影响

为了实现贵州小桐子花粉的长期贮藏,实现小桐子的高产、稳产,采用TTC法测定花粉活力、培养液培养测定花粉萌发率,研究了室温(20℃)、室温干燥(20℃)、低温(4℃)、低温冷冻(-20℃)及超低温真空冷冻(-80℃)5种贮藏条件对小桐子花粉活力及萌发率的影响.结果表明,20℃室温贮藏和20℃室温干燥贮藏条件下保存的花粉活力及花粉萌发率仅能维持20d和30d,4℃低温可以贮藏60d,-20℃低温冷冻可以贮藏180d,-80℃超低温真空冷冻条件下贮藏360d后,花粉活力可以保持48.62％,花粉萌发率还可以保持45.33％,完全可用于花粉贮藏和种子小年时的人工辅助授粉.     

矮牵牛RCW基因的克隆及功能分析

花色是植物的重要性状,其形成受多种因素影响。为了进一步解析矮牵牛花瓣呈色的分子机制,我们以生物信息分析、基因克隆、基因表达分析、基因沉默等技术,在矮牵牛中克隆和鉴定了一个影响花瓣呈色的基因RCW。不同矮牵牛组织中进行表达分析表明,该基因在雄蕊、雌蕊、花瓣、叶片、根、茎、萼片中都表达,但是在花瓣中的表达随着花瓣发育逐渐增强;并且受到AN1、AN11、PH3等转录因子的调控。在矮牵牛品种M1×V30中进行RNAi沉默RCW基因的表达,其花瓣中的pH值与对照相比明显降低,花瓣呈现更深的紫色。对RCW编码的蛋白进行亚细胞定位发现其位于内质网、高尔基的膜系统上,表明其可能参与pH相关蛋白的转运过程。因此,RCW基因在矮牵牛花瓣细胞中的功能,主要是通过参与pH相关蛋白的转运,调控花瓣液泡中的pH环境,从而影响花瓣的呈色过程。本研究为全面揭示矮牵牛花瓣呈色的分子机制提供了重要依据,并为今后通过分子育种手段改变植物花色提供了理论基础。     

芒果赤霉素氧化酶基因GA3ox的克隆、表达及亚细胞定位分析

赤霉素3-氧化酶(gibberellin 3-oxidases, GA3ox)是赤霉素(gibberellic acid, GA)生物合成途径中的关键限速酶之一。芒果中GA3ox基因的功能及其表达模式未见报道。本研究利用RACE技术克隆了一个芒果GA3-氧化酶基因(GA3ox),该基因全长cDNA序列为1 680 bp,编码氨基酸381个,开放阅读框(open reading frame, ORF)为1 146 bp,蛋白分子量为42.6 kD,等电点为5.13,不含信号肽,不含跨膜结构域。系统发育树分析发现,该基因编码的蛋白主要与开心果亲缘关系较近,其次为克莱门柚、甜橙、麻疯树等植物。通过拟南芥原生质体亚细胞定位分析发现,该基因主要定位在细胞质中。通过对乔化、矮化芒果品种不同发育时期的叶片的实时荧光定量PCR分析发现,该基因主要在矮化品种中表达量较高,在乔化品种各个时期表达量较低,且差异不大。矮化品种中主要在开花期表达量最高,坐果期7～8周含量最低,但都高于乔化品种的任何取样时期。该基因的克隆和表达分析为下一步功能的研究及其在芒果株形调控分子机制提供理论依据。     

小桐子WOX基因家族全基因组鉴定与表达分析

WOX转录因子在植物的生长发育和非生物胁迫响应中起重要的调控作用。基于全基因组和转录组测序数据,本研究首次对小桐子WOX转录因子保守域、保守基序,染色体定位和不同条件下的表达模式进行了全面的分析。总共12个WOX蛋白在小桐子基因组中被鉴定。保守域分析表明,12个小桐子WOX蛋白的结构域均含有螺旋-环-螺旋-拐角-螺旋基序。染色体定位分析表明,小桐子12个WOX蛋白不均匀地分布在7个连锁群(LGs)上,然而,没有WOX蛋白定位于LG1、LG5、LG7和LG8。系统发育树的结果表明,12个小桐子WOX蛋白被分成3个组即Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ。在这12个WOX基因中,部分基因在被检测的组织中(根,茎皮层,叶和种子)显示出差异表达模式,如1个WOX基因(JcWOX1)在根中表达最高,3个WOX基因(JcWOX3, JcWOX7, JcWOX12)在种子中表达最高。此外,表达模式和qRT-PCR分析显示,3个小桐子WOX基因的表达在至少一个胁迫(干旱或者盐)条件下显示出至少2倍的增加或者降低。在这3个差异表达小桐子WOX基因中,2个WOX基因(JcWOX1, JcWOX6)在至少一个处理时间点表现出对干旱和盐胁迫响应,1个基因(JcWOX5)仅仅对干旱胁迫响应。该结果将为进一步研究WOX基因在调控小桐子生长发育和非生物胁迫响应中的作用提供一些有价值的信息,为小桐子WOX基因的功能研究与利用提供科学依据。     

Rht12矮秆小麦GA3ox基因的克隆与表达分析

赤霉素3-氧化酶(GA3ox)是赤霉素生物合成途径中的一种关键酶,在茎的伸长中起着重要的作用。为探讨GA3ox基因和Rht12矮秆小麦矮化之间的关系,本研究利用同源克隆方法分离得到了小麦品种中国春和宁98-2105(含矮秆基因Rht12)的GA3ox1和GA3ox2基因,并对其在茎的不同部位进行了表达模式分析。研究结果表明,小麦GA3ox1和GA3ox2均含有3个外显子和2个内含子,其编码的蛋白具有2-酮戊二酸依赖性的双加氧酶典型的保守结构域,但中国春和宁98-2105的GA3ox1和GA3ox2之间存在部分碱基的差异。实时定量表达分析结果显示,GA3ox1和GA3ox2在中国春和宁98-2105茎的不同部位的表达趋势基本一致,但表达量具有较大差异,GA3ox1和GA3ox2在宁98-2105茎的倒一节结节中的转录水平显著高于中国春,推测宁98-2105中赤霉素的信号转导通路可能受到了影响,即矮秆基因Rht12可能影响了赤霉素信号的传导。本研究结果为进一步研究矮秆基因Rht12的致矮机理和利用提供了理论依据。     

外源甜菜碱对渗透胁迫下小桐子幼苗生物膜伤害的缓解效应

由于小桐子种子具有较高的含油量,因此被认为是最重要的能源植物之一。利用外源甜菜碱对小桐子种子和幼苗进行浸种或灌根处理,结果发现,外源甜菜碱浸种或灌根处理都可提高幼苗茎和叶中内源的甜菜碱含量,缓解PEG胁迫下小桐子幼苗根、茎和叶中的丙二醛积累以及电解质渗漏率的增加,暗示外源甜菜碱处理对生物膜伤害的缓解效应可能与内源甜菜碱含量的提高有关。     

水稻赤霉素代谢基因 OsGA2ox4 的两种检测方法比较

针对水稻赤霉素代谢基因 OsGA2ox4,利用 PARMS 试剂盒及基于 PCR 引物 3'' 末端核苷酸双脱氧修饰两种检测方法,对 236 份水稻材料进行基因型检测,两种检测方法结果符合率为 93.18%,均可以通过 SNP 分型对水稻赤霉素代谢基因OsGA2ox4 进行基因型鉴定。对两种方法的优缺点具体说明,并且提供这两种方法的选择或使用条件,可以为 SNP 检测技术的进一步研究及两种方法在水稻其他基因 SNP 分型中的应用提供参考。     

烟草Nt14-3-3-like C基因的克隆与功能分析

烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus,TMV）寄主范围广泛、传染性极强,严重影响作物的产量和品质。实验室前期在不同耐受 TMV侵染的烟草品种中筛选出1个表达显著差异的蛋白14-3-3-like C,在此基础上,对Nt14-3-3-like C基因进行了克隆、生物信息学分析和亚细胞定位;通过农杆菌介导遗传转化,获取转基因植株;通过qPCR对转基因植株中TMV侵染响应相关基因的表达进行分析。结果显示,14-3-3-like C蛋白序列长度为780bp,编码260个氨基酸,具有14-3-3蛋白的典型沟槽结构,但没有跨膜结构和信号肽;定位于细胞核和细胞膜;转基因材料的qPCR分析发现,在Nt14-3-3-like C基因抑制的植株中,病原防卫和光合途径相关的基因表达显著下降,表明Nt14-3-3-like C可能通过抑制病原防卫和光合途径相关基因表达参与TMV对烟草的侵染。     

小桐子bZIP转录因子的全基因组鉴定及表达分析

为明确小桐子bZIP转录因子家族的结构特征以及其在植物响应生物与非生物胁迫中的作用,利用生物信息学方法,从全基因组水平鉴定小桐子bZIP转录因子家族,并对其基因结构、进化关系、染色体定位、共线性关系及组织与低温表达特性进行分析。结果表明,共鉴定到51个小桐子bZIP基因,系统进化树分析将其分为10个亚族(A-I及S)。基因定位显示,51个小桐子bZIP基因不均匀地分布于11条染色体,其中2号与4号染色体鉴定到基因的串联复制。基因结构分析表明,小桐子bZIP基因包含1～13个外显子,其中,S亚族基因包含1～2个外显子,而G亚族基因包含12～13个外显子。bZIP转录因子主要定位在细胞核,氨基酸数目为113～768个,等电点4.70～10.30。启动子顺式作用元件鉴定发现3～27个响应激素如赤霉素、脱落酸、乙烯及生长素与非生物胁迫如低温、高温及创伤等调控元件。转录组表达分析显示,小桐子bZIP基因具有器官表达特异性,26个bZIP基因在叶片、根及种子中均有表达,其他基因仅在特定器官中表达。同时,鉴定到14个小桐子bZIP基因在低温条件下上调表达。在叶片中,qRT-PCR试验显示JcbZIP3与JcbZIP14表达量在低温处理24 h时上调达到显著水平,与小桐子抗冷性的形成及低温信号转导过程直接相关。研究结果为小桐子bZIP基因的克隆与调控机制研究奠定了基础。     

紫心甘薯IbCHS基因启动子的克隆及功能分析

利用hi Tail-PCR从紫心甘薯‘A5’基因组DNA中扩增得到查尔酮合成酶IbCHS基因5'端上游2470 bp的一段序列,用PlantCARE软件序列分析表明,该序列含有启动子基本元件CAAT-box和TATA-box,还有赤霉素应答元件、光应答元件、MYB和bHLH转录因子结合元件,初步推测其为IbCHS基因的启动子,命名为PIbCHS基因启动子。将PIbCHS启动子从5'端进行截短克隆,得到了4个长度不同的启动子5'缺失片段,由长到短分别命名为PS1、PS2、PS3和PS4。分别构建了PIbCHS、PS1、PS2、PS3和PS4驱动GUS基因的真核超表达载体,瞬时转化烟草叶片发现,PIbCHS、PS1、PS2、PS3均有启动子活性,但是PS4不能驱动GUS基因的表达,说明PIbCHS启动子的驱动核心区域主要位于PS3和PS4之间的部位。稳定转化拟南芥表明,PIbCHS能够启动GUS基因的表达。     

茶树赤霉素受体基因CsGID1a的克隆与表达分析

GID1作为赤霉素信号转导的受体,在赤霉素作用中具有重要作用。采用同源克隆方法,利用RT-PCR和RACE技术在茶树中克隆到赤霉素受体基因GID1的cDNA全长,命名为CsGID1a (GenBank登录号为JX235369)。该基因全长1411 bp,开放阅读框1 023 bp,编码341个氨基酸。生物信息学分析显示,CsGID1a编码的蛋白分子量为38.53 kD,理论等电点为5.62;无信号肽位点,是非分泌性蛋白,具有1个跨膜区,基因被定位于细胞核内;CsGID1a氨基酸序列具有激素敏感性脂肪酶(HSL)家族蛋白的HGG、GXSXG功能域以及羧酸酯酶典型的三级结构;与其他物种的GID1相似性均在60％以上,与葡萄的相似性最大达87％、进化关系最近。荧光定量PCR结果显示,高浓度(1.0×10^–5 mol L^–1)GA₃能够下调CsGID1a的表达,5 h内的表达呈下降趋势;随着越冬茶芽萌动进程,CsGID1a表达量逐渐降低,特别在3月初萌发以后变化较大,推测赤霉素及其受体基因可能与茶树越冬芽解休眠相关。