一株鸭源H_9亚型禽流感病毒的分离鉴定及HA基因序列分析

本研究从发生产蛋下降疫情的山东某种鸭场采集病料,分离得到一株病毒。经血凝(HA)试验、血凝抑制(HI)试验、测序分析,鉴定该毒株为H_9亚型禽流感病毒。对分离株HA基因进行测序及序列分析,结果显示该分离株HA基因的裂解位点为333PARSSR↓GLF339,符合低致病性AIV的特征;与参考毒株的HA基因组序列进行比较发现,核苷酸的同源性为93.7%~99.3%,推导的氨基酸的同源性为96.4%~98.6%,与Shandong/YT5/2010(H_9N_2)株同源性最高。     

1株HA蛋白S145变异H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定与HA基因序列分析

从山东某发病养殖场采集疑似病料,经RT-PCR检测为H9N2亚型禽流感阳性,采用鸡胚尿囊腔接种法分离病毒(SD089),并进行HA、HI试验和HA基因扩增、测序以及序列的同源性和遗传进化分析。结果显示,分离的SD089株具有血凝特性但不能被H9亚型禽流感标准阳性血清所抑制,其HA基因推导的氨基酸序列与参考毒株相比,第145位由S漂变为N,导致增加糖基化位点NGT,表明S145是血凝抑制抗体结合位点。SD089株属于BJ94分支,与2010―2014年大部分山东流行毒株的核苷酸和氨基酸序列相似性分别为88.9%~97.5%和89.9%~99.6%,而与疫苗株SD696分别降至88.0%和89.1%。试验表明,分离的SD089株HA基因在分子水平上发生了变异,S145位点的突变提示低致病性禽流感的防制面临新的挑战。     

2011年~2012年四川地区J亚型禽白血病分子流行病学调查

为了解2011年~2012年四川地区J亚型禽白血病病毒(ALV-J)流行情况及流行病毒株的分子特征,本研究采集四川地区疑似禽白血病的病料样品784份(血液样品700份,组织样品84份)进行PCR检测,并对部分样品的gp85基因进行序列测定和分析。血液样品和组织样品ALV-J检出率分别为3.1%(22/700)和14.3%(12/84)。核苷酸序列比对结果表明,18个阳性样品的gp85基因核苷酸同源性为87.7%~99.8%,与ALV-J株HPRS-103的核苷酸同源性为87.3%~98.2%,与以前分离的J亚群四川株SCGS-1的核苷酸序列同源性为87.9%~94.4%。遗传进化分析表明,18个样品分别属于不同的分支,其中来自石棉的样品SM与其他样品的遗传距离最远。该调查结果显示四川地区鸡场的ALV-J感染比较普遍,其gp85基因存在明显的遗传多样性,引种是导致这种遗传多样性的重要原因。     

某规模场产蛋量下降鸡群新城疫病毒分离与鉴定

对某规模场鸡群采集的23份鸡咽喉或泄殖腔棉拭子进行病原分离,通过血凝、血凝抑制试验和RT-PCR检测,证实分离出17株新城疫病毒(NDV)。对F、HN基因经RT-PCR扩增、克隆并对其进行测序,选取具有代表性的4个毒株进行序列比对及遗传演化分析。系统发育分析结果表明,4株病毒均属于基因Ⅶe型,F基因裂解位点的氨基酸序列为112R-R-Q-K-R-F117,具备NDV强毒株裂解位点氨基酸排列特征。其F基因与XZ-12-08-Ch株核苷酸和氨基酸的同源性分别介于96.1%~96.7%、97.3%~98.0%;与P1株核苷酸和氨基酸的同源性分别介于95.0%~95.4%、96.2%~96.7%,其HN基因与XZ-12-08-Ch株核苷酸和氨基酸的同源性介于96.2%~96.5%、95.3%~95.9%;与SN-5-08-Ch株核苷酸和氨基酸的同源性介于94.9%~95.3%、96.4%~96.8%。血清学交叉试验显示,NDV分离毒株为抗原测得的同批血清样品抗体效价存在显著差异。近年流行的新城疫疫情主要由基因Ⅶ型NDV引起的,该规模场产蛋量下降可能与F和HN基因的变异有关。     

云南省禽流感、新城疫与3种免疫抑制性病原共感染的检测

为调查云南省禽流感病毒、新城疫病毒与免疫抑制性病毒混合感染的情况,对云南省2007年1月～2009年10月期间145份禽流感阳性及30份新城疫阳性样品进行禽网状内皮增生病病毒(REV)、J亚群禽白血病病毒(ALV-J)及鸡传染性贫血病毒(CIAV)的检测。禽流感阳性样品中ALV-J的感染阳性率为15.9%,REV的感染阳性率为22.8%,CIAV的感染阳性率为26.9%;新城疫阳性样品中ALV-J的感染阳性率为13.3%,REV的感染阳性率为23.3%,CIAV的感染阳性率为26.7%;共有30份样品发生多重感染,多重感染率为17.1%。对不同区域的4份禽白血病病毒阳性样品、10份禽网状内皮增生病病毒阳性样品、10份禽传染性贫血病毒阳性样品进行了序列比对和系统发育分析。结果表明,云南ALV-J毒株gp85基因与国内外毒株核苷酸及氨基酸同源性分别介于80.4%～96.7%、85.2%～94.5%;REV毒株env基因核苷酸及氨基酸之间的同源性为98.8%～99.8%、97.7%～99.5%;CIAV毒株vp2基因核苷酸及氨基酸之间的同源性为92.4%～100.0%、93.7%～100.0%。     

2016-2021年广西H9亚型禽流感病毒HA和NA基因遗传进化动态分析

【目的】研究H9亚型禽流感病毒(Avian influenza virus, AIV)广西毒株的遗传进化动态,以期掌握其地域流行新特点,为及时优化调整有效防控措施提供数据支持。【方法】采集2016-2021年广西各地的家禽喉头、泄殖腔及环境拭子样品3 600份,接种9～11日龄SPF鸡胚分离病毒,并结合血凝和血凝抑制试验及实时荧光定量RT-PCR方法鉴定AIV亚型,根据毒株检测年限和来源地选取部分H9亚型AIV核酸阳性样品进行HA、NA基因扩增、测序及进化动态分析。【结果】共获得46株H9亚型AIV广西毒株的HA、NA基因序列,其中HA基因全长1 683 bp,编码560个氨基酸;4株NA基因全长1 410 bp,编码469个氨基酸,42株缺失3个氨基酸,编码466个氨基酸。BLAST分析结果显示,越南及国内多个省份的毒株与本研究获得的广西毒株HA、NA基因相似性最高,分别为97.62%～99.88%和93.13%～99.79%,宿主源也不尽相同,表现遗传多样性特征。广西毒株之间HA基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为93.0%～99.1%和94.6%～99.1%,NA基因核苷酸和氨基酸...     

H9亚型禽流感病毒山西株的分离鉴定及其HA基因的遗传进化分析

从山西省某些鸡场采集疑似病料,接种SPF鸡胚后分离病毒,采用A型流感病毒通用引物进行HA基因的扩增,并连接T载体克隆后进行序列测序和遗传进化分析。结果显示:获得4株H9亚型禽流感病毒完整HA序列,开放阅读框1 683nt,编码560个氨基酸,各自之间核苷酸同源性较高,达95.5%~99.6%,且推导的氨基酸同源性介于92.0%~99.6%之间;遗传进化分析结果显示该4株属4.2.5分支,与国内常用疫苗株4.2.3分支存在一定差异,但仍属于4.2大分支;HA蛋白的裂解位点氨基酸顺序为RSSR↓GLF,为低致病性禽流感病毒,并且含有7个潜在的N-糖基化位点以及8个受体结合位点。结果表明:本试验分离的H9亚型禽流感病毒与近年来流行毒株HA基因同源性及蛋白关键位点相似性较高。     

禽流感病毒WUDI-H9N2株的分离鉴定及 HA基因的分子特征研究

本研究于2011年8月从山东省某鸡场鸡群中分离一株病毒,通过对分离株进行病毒血凝试验及血凝抑制试验、RT-PCR、动物回归试验等方法证实已分离到禽流感病毒(avian influenza virus,AIV) H9N2,命名为WUDI-H9N2株。根据GenBank上发表的AIV H9病毒的HA基因序列,用Oligo 6.0生物学软件设计引物,对分离株WUDI-H9N2株HA基因进行扩增、测序及序列分析。将分离的AIV H9毒株与其他血清型代表参考毒株分别进行核苷酸和氨基酸系统发生进化关系分析。WUDI-H9N2株 HA基因全序列长为1708 bp,无核苷酸的插入和缺失,cDNA包含了1个完整的开放阅读框(ORF),编码区由1683 bp组成,共编码560个氨基酸。HA序列与国内参考毒株的核苷酸序列的同源性在92.9%~98.1%之间,其中与安徽分离株A/chicken/China/AH-10-012010(H9N2)同源性为98.1%。     

一株鸡新城疫病毒的分离鉴定及HN基因的序列分析

为了检测引发昆明地区某鸡场鸡群疑似新城疫(ND)的毒株基因型,试验将采集到的疑似ND病料接种至9日龄鸡胚尿囊腔,对鸡胚尿囊液进行血凝(HA)试验、血凝抑制(HI)试验和RT-PCR鉴定,对RT-PCR扩增产物进行克隆、测序,然后分析HN基因编码区序列同源性及绘制遗传进化树。结果表明:HA试验凝集价为1∶2~8,HI试验凝集价为1∶2~5,禽流感病毒(AIV)的HI试验均为阴性,初步鉴定分离株为新城疫病毒(NDV),将其命名为KM-16;RT-PCR扩增出的目的条带大小为1 759 bp;KM-16分离株与China-Guangxi14-2002和Japan-SG106-1999的HN基因的同源性为98.6%和98.7%,与经典毒株F48E9和La Sota C5的HN基因的同源性为84.7%和81.9%,与其他参考毒株的HN基因的同源性在95.2%～96.4%之间;KM-16毒株与China-Guangxi14-2002和Japan-SG106-1999等基因Ⅶ型毒株处于同一进化分支上。说明KM-16分离株为基因Ⅶ型NDV毒株。     

2017—2018年华东地区H9亚型禽流感病毒分离毒株的抗原差异分析

为掌握华东地区H9亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的流行情况及变异程度,采集临床疑似病料和活禽交易市场家禽的棉拭子样品,通过鸡胚接种、HA和HI试验及RT-PCR等方法分离鉴定H9 AIV,对其中部分毒株进行测序和序列分析,筛选4个代表毒株免疫SPF鸡制备抗血清,利用交叉血凝抑制试验测定抗原差异性。结果如下:共分离鉴定出62株H9亚型禽流感病毒,分离率为2.02%(62/3 074)。对25株H9亚型禽流感病毒株序列分析发现,分离株属于h9.4.2.5谱系,并进一步细分为A和B亚系。 HA 基因裂解位点氨基酸为PSRSSR↓G,符合低致病性禽流感病毒的特征。与Y280代表株 HA 基因的推导氨基酸相比,分离株受体结合位点左侧臂全部变为NGLMGR。在抗原位点92位氨基酸出现R(64%)/K(36%)的变化。交叉血凝抑制试验结果表明分离株间的HI抗体滴度相差2~8 log2,可分为2类抗原型。因此,目前流行的H9亚型AIV发生了抗原变异,至少同时存在两种抗原型。     

1株乌鸡新城疫病毒强毒株的分离鉴定与F基因的遗传进化分析

从山西省吕梁市郊区某养禽场送检的病死乌鸡中分离到1株新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)。经血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验鉴定,该分离株具有血凝性,血凝效价为2~9,且可被NDV阳性血清抑制,而不能被禽流感(H5、H9亚型)阳性血清所抑制。试验通过RT-PCR扩增了分离毒株F基因高度变异区362 bp的核苷酸序列。序列分析表明,该毒株含有1个开放阅读框(ORF),编码88个氨基酸;F蛋白裂解位点的氨基酸序列为~(112)R-R-Q-K-R-F~(117),符合强毒株裂解位点特征;同源性分析表明,分离毒株与典型毒株—LaSota、Clone30、F_(48)E_9、V_4及云南分离株KMLY-YM的核苷酸同源性为83.7%~86.5%,与山东分离株P914039S101同源性最高,达96.8%;遗传进化分析表明:分离毒株与山东分离株P914039S101处于同一进化分支内,属基因Ⅶd亚型。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)协同感染细菌性疾病的分析研究

为了解湖北某养殖场猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）流行毒株的遗传变异和临床感染情况,试验采集10份疑似PRRS发病仔猪的肺脏、淋巴结等临床样品,应用RT-PCR方法扩增PRRSV的Nsp2部分基因用于定性检测分析,并对扩增的其中2份PRRSV阳性样品进行ORF5基因核苷酸序列测定,结合不同疫苗毒株开展同源性比对分析。为进一步揭示病因,通过多重PCR方法对10份发病猪的肺脏和12份鼻拭子样品进行了相关致病菌的鉴定,并对其中的2株不同病原菌开展药敏试验。结果显示,10份临床样品中有5份检测到美洲型变异PRRSV,病原阳性率为50%。ORF5全基因序列分析表明,2个流行毒株间的核苷酸同源性为99.7%,与以TJM-F92、JXA1-R、HuN4-F112等为代表的高致病性致弱疫苗毒株核苷酸同源性最高,为96.7%~97.0%;与美洲型标准毒株VR2332的同源性分别为87.6%和87.9%;与国内较早分离的经典毒株（CH-1R和R98株）的核苷酸同源性分别为92.9%和87.4%、87.7%。患病猪临床常见感染模式为PRRSV+PM+SS、PRRSV+PM或PRRSV+HPS,2株主要致病菌药敏试验表明,多杀性巴氏杆菌对头孢曲松、阿莫西林等药物高度敏感,猪链球菌对阿莫西林、氨苄西林、阿奇霉素等药物高度敏感。本研究揭示了该场保育猪的发病病原,并从分子水平明确了临床PRRSV与不同疫苗毒株的亲缘关系,为弱毒疫苗的合理选择使用和综合防控PRRS提供了实践依据。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)协同感染细菌性疾病的分析研究

为了解湖北某养殖场猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)流行毒株的遗传变异和临床感染情况,试验采集10份疑似PRRS发病仔猪的肺脏、淋巴结等临床样品,应用RT-PCR方法扩增PRRSV的Nsp2部分基因用于定性检测分析,并对扩增的其中2份PRRSV阳性样品进行ORF5基因核苷酸序列测定,结合不同疫苗毒株开展同源性比对分析。为进一步揭示病因,通过多重PCR方法对10份发病猪的肺脏和12份鼻拭子样品进行了相关致病菌的鉴定,并对其中的2株不同病原菌开展药敏试验。结果显示,10份临床样品中有5份检测到美洲型变异PRRSV,病原阳性率为50%。ORF5全基因序列分析表明,2个流行毒株间的核苷酸同源性为99.7%,与以TJM-F92、JXA1-R、HuN4-F112等为代表的高致病性致弱疫苗毒株核苷酸同源性最高,为96.7%~97.0%;与美洲型标准毒株VR2332的同源性分别为87.6%和87.9%;与国内较早分离的经典毒株(CH-1R和R98株)的核苷酸同源性分别为92.9%和87.4%、87.7%。患病猪临床常见感染模式为PRRSV+PM+SS、PRRSV+PM或PRRSV+HPS,2株主要致病菌药敏试验表明,多杀性巴氏杆菌对头孢曲松、阿莫西林等药物高度敏感,猪链球菌对阿莫西林、氨苄西林、阿奇霉素等药物高度敏感。本研究揭示了该场保育猪的发病病原,并从分子水平明确了临床PRRSV与不同疫苗毒株的亲缘关系,为弱毒疫苗的合理选择使用和综合防控PRRS提供了实践依据。     

2015—2016年广州市部分活禽市场H9N2亚型禽流感病毒的流行病学调查

为了解广州市活禽市场禽流感病毒(AIV)的流行和变异情况,本研究于2015年5月至2016年6月从广州市部分活禽市场采集禽咽喉拭子1 579份,对样品处理之后进行分离和RT-PCR鉴定,通过对HA、NA基因进行遗传进化分析后,共检测到9株H9N2亚型禽源流感病毒。9株分离株的HA基因属于BJ/94-like分支,核苷酸相似性为93.2%~99.7%;有8株分离株的HA基因裂解位点的序列为P-S-R-S-S-R,1株的HA基因裂解位点的序列发生了P/L-S-R-S-S-R的替换。HA蛋白第226受体结合位点的氨基酸均为亮氨酸(Leu),具有人流感受体结合的特征。6株分离株的NA基因属于BJ/94-like分支,3株属于HK/G9-like分支,说明不同分支的病毒开始出现重组。本研究通过对广州市部分活禽市场分离到的禽流感病毒序列分析,掌握活禽市场流感病毒的流行变异趋势,为流感病毒的综合防控及保障公共卫生健康提供参考。     

一起禽肺病毒与H9亚型禽流感病毒混合感染的研究报道

从山东省一起疑似禽肺病毒感染的病例中分离到1株H9亚型禽流感病毒(H9 subtype Avian influenza virus,AIV-H9),未分离到禽肺病毒(Avian metapneumovirus,APV),但血清学检测发现APV-ELISA抗体参差不齐。根据已公布的APV的G基因和AIV-H9的HA基因序列分别设计合成引物,进行RT-PCR扩增,结果得到大小为692 bp和1683 bp的目的条带;测序分析发现,该发病鸡场感染的APV(SD/RZ/15)G基因片段与Genbank中登录的B型APV核苷酸序列同源性最高(92.1%~-94.5%)且遗传距离最近,处于同一个分支。分离到的AIV-H9毒株(CK/SD/RZ/H9/15)的HA基因与参考毒株的核苷酸序列同源性为87.3%~98.9%,遗传进化关系分析表明该分离毒株与近几年分离的H9处于同一个分支上。综合上述试验结果,确定该病例为B型APV与AIV-H9的混合感染引起。     

2006-2007年云南流行H9N2禽流感病毒血凝素全基因序列分析

为调查云南省H9N2亚型禽流感病毒的分子流行病学情况,对2006年6月至2007年4月从云南省16地州随机采集了各种家禽、家猪的5 728份喉气管和口腔棉拭子样品进行RT-PCR检测,276份样品呈H9N2阳性.将具有代表性的17份阳性样品的HA全长基因序列测定和分析.结果表明:株间HA基因同源性为91%～100%,推导氨基酸同源性95%～100%,所测序列与云南1999年分离H9N2毒株ackynkenxie-1-99的同源性仅为93%.根据HA基因同源性,可将17个毒株可分为2个亚群,一个亚群的12株HA基因同源性高达97%以上,与Qa/ST3143/05和C/Bei1/94同源性是97%和93%,其中的11株毒株HA基因全长1 671,编码556aa,存在第6～9位4 aa缺失,只有AC/Yndq/06株HA基因1 683.编码560 aa.另外一个亚群的其余5株,同源性98%以上,HA基因全长1683 bp,编码560 aa.17个毒株中3个存在218～220 aa糖基化位点变异,1个毒株551～553 as糖基化位点发生变异.所有毒株在HA裂解位点处没有连续性碱性氨基酸插入,受体结合位点处的氨基酸没有变异.     

我国部分省份猪流行性腹泻病毒M基因的克隆测序及遗传进化分析

为了解我国部分省份猪流行性腹泻病毒(PEDV)的遗传进化情况,试验采用RT-PCR方法对2014—2017年采集的源自河南、河北、山西、山东、甘肃、湖北、江西等地区不同猪场的98份腹泻样品进行了PEDV检测,并对25份PEDV阳性样品进行M基因的克隆与测序和遗传进化分析。结果表明:25株M基因序列长度均为618 bp;25株M基因序列间核苷酸同源性为98.2%~100%,其编码的氨基酸序列同源性为97.8%~99.6%,与经典毒株CV777及国内外流行毒株核苷酸同源性为97.7%~98.6%,氨基酸序列的同源性分别为97.8%~98.7%;25株M基因序列与国内外早期分离株(如CV777、CH/S等代表毒株)不在一个进化分支上,与近年来分离株处在一个进化分支上。说明PEDV M基因一直处于变异进化过程中。     

滁州地区2例H9亚型禽流感病例病原HA基因的克隆与序列分析

采集滁州地区5县市范围内11例疑似流感病鸡的气管和肺脏组织,参照Gen Bank已经发表的禽流感病毒H9N2的HA基因序列,采用RT-PCR技术成功的扩增出2例流感病毒HA基因的完整读码框,分别命名为AH1、AH2,并进行序列测定及分析。序列分析显示:AH1、AH2 HA基因全长都为1 683 nt,二者基因的同源性为98.9%,只有18个核苷酸存在差异。AH1、AH2 HA基因与Gen Bank登陆的鸡源禽流感病毒H9N2HA基因的同源性在90%~97%之间。AH1和AH2两株裂解位点均为RSSR↓GLF,具有典型的低致病性禽流感病毒的特征,未发生太多突变。     

山东部分地区H9N2亚型禽流感病毒分离鉴定及HA和NA基因的遗传进化分析

为了解山东省H9亚型禽流感病毒变异情况和流行规律,于2013年从山东省潍坊、淄博、青岛、临沂、济南、滨州和烟台等地区疑似禽流感病鸡病料中分离到14株病毒,通过病毒分离培养、血凝与血凝抑制试验、RT-PCR技术进行了鉴定,并对获得病毒的HA基因和NA基因序列进行了同源性和遗传进化分析。结果显示,分离病毒均能凝集鸡的红细胞并能被禽流感病毒H9标准阳性血清抑制,RT-PCR方法从分离株中扩增出HA基因和NA基因保守片段,序列比对表明分离株与山东日照分离株A/Chicken/Rizhao/853/2013(H9N2)具有较高同源性,达94.4%以上,证实分离毒株为H9N2亚型禽流感病毒。HA裂解位点处的氨基酸序列为-PSRSSR/GL-,符合低致病性禽流感病毒的分子特征。HA、NA基因遗传进化分析表明,分离株与代表株DK/Y280/97亲缘关系最近,核苷酸同源性分别达90.3%和93.6%以上,属于国内常见的CK/BJ/94分支中的Y280-like亚分支。     

云南2株H4N6亚型禽流感病毒株的分离与鉴定

采集家禽喉气管作为检测样品,用甲型流感病毒M基因检测引物进行RT-PCR检测,确定样品为甲型流感病毒感染。用已建立的PCR法检测H5、H9亚型及新城疫结果为阴性。在9日龄鸡胚中进行病毒分离培养,收集48 h后死亡鸡胚尿囊液进行血凝和血凝抑制试验,有血凝效价但不能被H5、H7、H9和新城疫阳性血清抑制。为进一步确定病毒的亚型,用甲型流感病毒血凝素基因通用引物进行RT-PCR扩增、克隆及测序,将测得的HA基因序列与血凝素亚型标准序列进行比对,同源性为34.9%～87.3%,与H4亚型的同源性为87.3%;设计神经氨酸酶基因测序引物,将所测序列与神经氨酸酶亚型标准序列进行比对,同源性为47.7%～90.8%,与N6亚型的同源性高达90.8%。通过进行HA和NA基因序列比对,可以确定试验所分离到的2株甲型流感毒株为H4N6亚型禽流感病毒。