1群4型禽腺病毒的分离鉴定及Fiber-2蛋白的免疫效果分析

旨在鉴定河南某蛋鸡场以心包积液、肝肿大出血为特征的病原,并对病原的免疫原性蛋白进行表达和效果分析。本研究采用病毒分离、血清学试验、PCR检测及测序分析、动物回归试验、大肠杆菌表达、蛋白纯化、攻毒保护等方法进行研究。结果显示,所采集样品经卵黄囊途径接种7日龄SPF鸡胚,盲传2代后获得病毒;PCR可扩增出约900 bp的Hexon基因片段,经测序,其Hexon基因与血清C4型毒株的相似性为100%;血清中和试验结果表明分离的禽腺病毒为1群血清4型禽腺病毒,命名为HN-ZK株。该毒株可在鸡胚原代肝细胞上产生CPE,病毒含量可达10^7.5TCID₅₀·0.1 mL^-1。动物回归试验表明,该分离毒株可使35日龄SPF鸡100%（10/10）表现出发病症状。以分离株的DNA为模板,利用大肠杆菌原核表达系统,获得相对分子质量约为33 ku的Fiber-2蛋白,离心浓缩、纯化后蛋白含量为300 mg·mL^-1。将表达的Fiber-2蛋白用不同的剂量免疫SPF鸡,结果表明20 μg·只^-1的剂量能使鸡完全抵抗强毒株的攻击,说明Fiber-2蛋白具有较好的免疫原性。本研究可为禽心包积水-肝炎综合征的诊断和基因工程亚单位疫苗的研制提供数据参考。     

Ⅰ群禽腺病毒分离鉴定及hexon基因的序列分析

为调查禽腺病毒的感染状况,2008—2010年从广西南宁市活禽市场采集样品259份,通过SPF鸡胚传代增殖,经PCR鉴定,92份为禽腺病毒阳性,阳性率为35.5%(92/259)。选取不同年份的8株进行免疫琼脂扩散、血凝性、致细胞病变、形态学和鸡胚致病性试验。结果:8株均与Ⅰ群禽腺病毒阳性血清反应,不能凝集鸡红细胞,病毒粒子具有腺病毒典型特征,可致鸡胚肝细胞变圆、折光性增强,使鸡胚发育不良。将克隆的8株hexon基因进行序列比对及遗传进化分析,显示均与Ⅰ群禽腺病毒同源性最高,亲缘关系最近。结果表明,8株分离株均为Ⅰ群禽腺病毒。     

5株Ⅰ群4型禽腺病毒的分离与鉴定

对5份不同来源的临床上疑似禽腺病毒感染鸡组织处理后接种6～7日胚龄SPF鸡胚,经过LMH细胞传代,通过血凝性检测和PCR方法对细胞培养物进行鉴定。血凝性检测表明分离物不能凝集鸡红细胞,对Hexon和52K基因的序列分析显示,分离到5株病毒为Ⅰ群4型禽腺病毒(FAdV-4)。动物回归试验结果表明,5个病毒株均能致40日龄SPF鸡死亡,死亡率达80%以上,并表现与FAdV-4感染临床发病相似的症状。研究结果为探究国内FAdV-4分子流行与毒力演变以及病毒感染的预防提供了基础材料。     

Ⅰ群禽腺病毒山东株的分离鉴定及hexon基因的克隆与分析

从山东省自然发生疑似鸡包涵体肝炎的商品肉鸡群中分离到4株病毒。这些毒株的复制可被5-溴尿嘧啶2-脱氧核苷抑制,表明毒株的核酸类型为DNA;对乙醚和氯仿有抵抗力;耐酸不耐碱;对热敏感。根据已发表的Ⅰ群禽腺病毒hexon基因的保守区域设计合成了2对引物。用这2对引物对4株病毒的核酸模板进行PCR扩增,结果均扩增出与设计片段大小一致的片段。测序分析表明,4株分离株为Ⅰ群禽腺病毒。用本实验室自制的Ⅰ群禽腺病毒12个血清型参考毒株的抗血清进行双向琼脂扩散试验,证明4株病毒中1株为血清2型,其余3株为血清8型。     

2株Ⅰ群禽腺病毒的分离鉴定及致病性分析

为了解山东省禽腺病毒(fowl adenovirus,FAdV)毒株的基因遗传演化情况及致病性,本试验对山东省两家疑似暴发鸡包涵体肝炎和心包积液综合征鸡场采集的病料(肝脏、脾脏)进行PCR鉴定,并将鉴定为FAdV的2份阳性病料提取病毒液,接种鸡肝癌细胞(LMH)进行毒株传代培养和细胞病变(CPE)观察、PCR检测、TCID50测定、鸡胚致病性试验、SPF鸡回归试验、病毒hexon部分基因扩增及序列分析。结果显示,试验成功分离到2株FAdV,2株分离株细胞传第1代即可观察到CPE,PCR均可扩增出大小为500bp的片段,且2株分离株细胞F5代TCID50分别为10-7.75/0.1mL和10-7.60/0.1mL,均对7日龄SPF鸡胚有强致病性;第1分离株和第2分离株对21日龄SPF鸡攻毒死亡率分别为80%和15%。hexon基因核苷酸同源性分析结果显示,第1分离株与FAdV-4株同源性最高(99.57%),第2分离株与FAdV-8b株同源性最高(99.18%)。这2株FAdV分离株均与Ⅰ群禽腺病毒同源,与火鸡出血性肠炎病毒(HEV)所在的血清Ⅱ群及减蛋综合征病毒(EDSV)所在的血清Ⅲ群禽腺病毒位于不同分支。第1分离株基因型为C型,血清型为4型,命名为FAdV-SDC4株;第2分离株基因型为E型,血清型为8b型,命名为FAdV-SDE8b株。综上所述,FAdV-SDC4和FAdV-SDE8b株属于近几年国内流行毒株。本研究结果可为鸡包涵体肝炎、心包积液综合征的防控工作和疫苗株的选择提供科学依据。     

2株Ⅰ群禽腺病毒的分离鉴定及致病性分析

为了解山东省禽腺病毒（fowl adenovirus,FAdV）毒株的基因遗传演化情况及致病性,本试验对山东省两家疑似暴发鸡包涵体肝炎和心包积液综合征鸡场采集的病料（肝脏、脾脏）进行PCR鉴定,并将鉴定为FAdV的2份阳性病料提取病毒液,接种鸡肝癌细胞（LMH）进行毒株传代培养和细胞病变（CPE）观察、PCR检测、TCID₅₀测定、鸡胚致病性试验、SPF鸡回归试验、病毒hexon部分基因扩增及序列分析。结果显示,试验成功分离到2株FAdV,2株分离株细胞传第1代即可观察到CPE,PCR均可扩增出大小为500 bp的片段,且2株分离株细胞F5代TCID₅₀分别为10^-7.75/0.1 mL和10^-7.60/0.1 mL,均对7日龄SPF鸡胚有强致病性;第1分离株和第2分离株对21日龄SPF鸡攻毒死亡率分别为80%和15%。hexon基因核苷酸同源性分析结果显示,第1分离株与FAdV-4株同源性最高（99.57%）,第2分离株与FAdV-8b株同源性最高（99.18%）。这2株FAdV分离株均与Ⅰ群禽腺病毒同源,与火鸡出血性肠炎病毒（HEV）所在的血清Ⅱ群及减蛋综合征病毒（EDSV）所在的血清Ⅲ群禽腺病毒位于不同分支。第1分离株基因型为C型,血清型为4型,命名为FAdV-SDC4株;第2分离株基因型为E型,血清型为8b型,命名为FAdV-SDE8b株。综上所述,FAdV-SDC4和FAdV-SDE8b株属于近几年国内流行毒株。本研究结果可为鸡包涵体肝炎、心包积液综合征的防控工作和疫苗株的选择提供科学依据。     

Ⅰ群禽腺病毒4型Penton基因的克隆及原核表达

通过对Ⅰ群禽腺病毒(Fowl adenovirus,FAdV)血清4型毒株Penton基因的克隆及原核表达,获得可溶性表达的Penton蛋白。依据GenBank已公布的Ⅰ群禽腺病毒4型Penton全基因设计引物,对实验室保存有Ⅰ群禽腺病毒血清4型毒株进行PCR扩增及测序分析,并将Penton基因克隆至pCold-SUMO载体,然后进行诱导表达。测序结果及序列分析表明,Ⅰ群禽腺病毒血清4型毒株为近几年国内流行毒株的新型突变株,命名为SX17株(GenBank登录号为MF592716);SDS-PAGE电泳及Western blot结果表明,获得可溶性表达的Penton蛋白,且Penton蛋白表达、过柱的效果较好,分离后蛋白纯度可达到80%~90%。原核表达获得了可溶性表达的Penton蛋白,且纯化出的蛋白具有较高的纯度,为后续研究Ⅰ群禽腺病毒4型Penton蛋白的生物活性以及制备其蛋白抗体奠定了基础。     

血清1型Ⅰ群禽腺病毒Fiber-2蛋白的表达及其中和作用研究

为研究血清1型Ⅰ群禽腺病毒(FAdV-1)的Fiber-2蛋白对FAdV-1在细胞水平上的中和作用,研究根据FAdV-1亚型Fiber-2基因序列设计引物,进行Fiber-2全基因序列PCR扩增并构建重组质粒,转入BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达,表达产物纯化后免疫SPF鸡制备抗血清,通过鸡LMH细胞研究Fiber-2蛋白抗血清对FAdV-1感染的中和作用。结果显示,FAdV-1 Fiber-2基因扩增产物大小为1 233 bp,构建了pCold-FAdV-1-Fiber-2重组质粒,表达的FAdV-1 Fiber-2蛋白分子量大小为105 ku;FAdV-1 Fiber-2蛋白的抗血清孵育LMH细胞后,与阳性对照组相同第4天细胞出现病变,而阴性对照组细胞均无病变。结果表明,FAdV-1 Fiber-2蛋白抗血清在体外试验中不能中和本血清型病毒的感染,FAdV-1 Fiber-2蛋白作为亚单位疫苗的研究存在风险。     

禽脑脊髓炎病毒陕西分离株VP1基因的克隆及序列分析

对禽脑脊髓炎病毒(AEV)陕西分离株SX株VP1基因进行克隆和序列分析,了解VP1基因的分子生物学特征。根据发表的AEV VP1基因序列,设计并合成一对特异性引物,采用RT-PCR方法扩增出AEVSX分离株的VP1基因,将其克隆到pMD18-T载体上,进行序列测定后与已知的AEV毒株序列进行比较分析。结果表明,获得的AEV SX分离株VP1基因的全长为810bp,编码270个氨基酸残基;SX株与参考毒株VP1基因的核苷酸同源性为91.5%～99.4%,推导的氨基酸同源性为88.5%～98.9%;在1～7、19～25、149～155处有3个潜在抗原位点。系统进化树表明,SX株与1143、L2Z参考毒株的亲缘关系较近。     

Ⅰ群禽腺病毒血清4型QD株的分离与鉴定

为了对Ⅰ群禽腺病毒血清4型(FAdV-4)的毒株进行分离,试验采用病毒分离、DNA提取、PCR鉴定、Hexon基因序列分析、病毒毒价测定、病毒形态学观察及动物回归试验等方法对青岛地区疑似心包积水及包涵体肝炎病鸡的肝脏进行了研究。结果表明:该分离毒株提取的DNA经PCR鉴定为阳性;该分离毒株序列与已发表的Ⅰ群禽腺病毒4型序列同源性为97.7%,病毒毒价为1×10~8TCID_(50)/0.1 mL;病毒形态为球形、无囊膜、二十面体对称的粒子结构;在动物回归试验中,病死肉鸡心包有积液,发病鸡肝脏的中央静脉广泛淤血,肝细胞发生空泡样变性,细胞浆和细胞核内可见嗜碱性包涵体。说明该分离株为Ⅰ群禽腺病毒血清4型毒株。     

2株胶东地区Ⅰ群禽腺病毒分离株的致病性试验

将从胶东地区疑似Ⅰ群禽腺病毒(FAdV)感染的发病鸡的肝组织病料中分离鉴定出的FAdV-8b(FXWH-8b)株和FAdV-4(FXWH-4)株,通过腿部肌肉注射方式,以TCID_(50)10~(8.0) 0.2 mL/羽的剂量,接种15日龄的SPF鸡,临床观察其发病情况及临床表现,研究其毒力和致病性。临床观察和剖检结果显示:FXWH-8b株和FXWH-4株均能在24 h引起试验鸡只发病,表现明显的临床症状和典型的剖检病理变化。H.E.染色结果显示:2株分离株均在脑、胸腺、气管、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、腺胃、胰腺、十二指肠、空肠、盲肠和法氏囊有较明显的病理变化,但均未发现核内包涵体。PCR检测结果显示:FXWH-8b株攻毒后72 h,FXWH-4株攻毒后48 h,在肝脏、肺脏、肾脏、腺胃、空肠和盲肠呈现100%的阳性率。免疫组化结果显示:FXWH-8b株和FXWH-4株均在肝脏存在强阳性信号;FXWH-4株在肾脏、十二指肠和空肠存在阳性信号。表明FXWH-8b株和FXWH-4株均对15日龄SPF鸡有较强的致病性,可侵害多个组织和器官。     

4株禽腺病毒hexon基因片段序列分析

目的验证购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心（China Veterinary Culture Collection Center,CVCC）的4株禽腺病毒（FAdV-1 AV208、FAdV-4 AV211、FAdV-8 AV215、FAdV-11 AV218）的血清型。方法采用PCR的方法对4株FAdV hexon基因片段进行特异性扩增、克隆与测序,并与GenBank上公布的FAdV各血清型进行亲缘性分析。结果hexon基因片段核苷酸及其编码Hexon蛋白氨基酸亲源性分析结果表明,FAdV-1 AV208为禽腺病毒A血清1型;FAdV-4 AV211为禽腺病毒C中的血清4型;FAdV-8 AV215为禽腺病毒E中的血清8b型;FAdV-11 AV218为禽腺病毒C中的血清10型。结论FAdV-1 AV208、FAdV-4 AV211的血清型与CVCC标注一致;FAdV-8 AV215为FAdV-8b,相比CVCC该研究进一步细化了其血清型;而FAdV-11 AV218为FAdV-10,与CVCC标注的血清型不一致。该研究为今后正确使用CVCC标准毒株FAdV-8 AV215、FAdV-11 AV218提供了参考。     

1株禽4型腺病毒JS株的分离鉴定

自2015年以来,心包积液-肝炎综合征在我国部分地区暴发并造成大量肉鸡死亡,从而给养殖户带来巨大的经济损失。2017年从江苏省某发病鸡场的患鸡肝组织中分离获得了1株禽腺病毒4型(fowl adenovirus 4, FAdV-4),将其命名为JS株。Hexon基因同源进化分析显示,该病毒株为我国近期流行株。为了验证该病毒株对鸡的致病性,将10~(6.0)TCID_(50)的病毒用肌肉注射或口服的方式感染3周龄SPF鸡,连续观察14 d。结果发现:肌注组鸡在攻毒后24 h有精神沉郁的症状,在攻毒后第2～3天大批量死亡,死亡率达90%;而口服组鸡一直没有观察到明显的精神症状且死亡率为0。病死鸡剖检可见心包积液、肝脏肿大发黄、肾脏肿大出血、脾肿大等明显病变;荧光定量PCR检测结果显示,病毒在鸡体内多个组织器官均有分布。结果表明本研究分离获得了1株对鸡有较强致病性的FAdV-4毒株,为有效防控心包积液-肝炎综合征奠定基础。     

9株Ⅰ群禽腺病毒的分离鉴定及hexon基因的遗传变异分析

为了解山东省肉鸡场禽腺病毒的感染流行特点,为其科学防治提供依据,通过临床症状观察、病毒分离鉴定、鸡胚致病性试验、血凝试验、PCR检测及克隆测序等方法进行病原检测分析。结果表明,发病肉鸡主要表现为精神沉郁、采食减少等临床症状。鸡胚致病性试验可见死亡胚体呈全身出血、体型小、肝肿大现象。血凝试验显示,分离株不具凝集鸡、鸭、大鼠红细胞的特性。对hexon基因进行克隆测序分析显示,LY9株与Ⅰ群禽腺病毒血清8型亲缘性近,与参考株(58株)的核苷酸同源性为98.8%,氨基酸同源性为98.6%。其余8株分离株间的核苷酸同源性为91.3%~99.8%,氨基酸同源性为97.8%~100%;与Ⅰ群禽腺病毒血清4型参考株(HB1510株)属同一进化分支,核苷酸同源性为93.1%~100%,氨基酸同源性为98.9%~100%。结论:从山东省4家肉鸡场分离到的9株病毒均为Ⅰ群禽腺病毒。     

Ⅰ群禽腺病毒hexon基因分型与序列分析

对鸡群中感染的Ⅰ群禽腺病毒hexon基因进行分型与序列分析,以期明确Ⅰ群禽腺病毒基因型的分布和hexon基因变异情况。参考GenBank上FAdV基因序列,设计2对引物,采用套式PCR技术扩增临床病料中Ⅰ群禽腺病毒hexon基因,测序后获得了8株FAdV hexon基因片段。结果表明,构建系统进化树发现,其中HM、SXFS、LQQD、HXGB、GSPL、DYQY和FP共7株属于FAdV-4型,而GS株属于FAdV-1型。7株FAdV-4型毒株核苷酸同源性在99.9%～100%之间,推导的氨基酸序列同源性均为100%,提示这7株FAdV-4型流行毒株高度同源。FAdV-1型的GS与CELO株核苷酸、推导的氨基酸序列同源性均为99.2%,提示GS与CELO株亲缘关系较近。在鸡群中发现存在FAdV-1型和FAdV-4型Ⅰ群禽腺病毒,各血清型毒株之间高度同源,毒株遗传稳定性高。     

禽Ⅰ群腺病毒血清1型株灭活疫苗的研制

优化病毒的增殖条件,获得108.14 TCID50/mL,病毒粒子数为108.74 copies/mL的FAV-1抗原液,制备禽Ⅰ群腺病毒血清1型(FAV-1)油乳剂灭活苗.比较甲醛及β-丙内酯的灭活效果,并进行疫苗成分最佳配比的优化,最后确认HLB 7.0,乳化剂含量10％,油水比为4∶1的比例稳定性最好、免疫效果最...     

1株Ⅰ群血清4型禽腺病毒对SPF鸡的致病性

用实验室保存的1株血清4型禽腺病毒(FAdV-4)W株对雏鸡(1dSPF鸡)进行攻毒试验,研究其致病性及免疫原性,每日观察鸡只精神状态,持续14d,计算死亡率,对每组死亡鸡只立即剖检,记录眼观组织病变,并将肝脏固定于10%的福尔马林中用于组织学观察。SPF鸡攻毒试验结果表明,口服接种100TCID50病毒量对1dSPF鸡的致死率高达100%,死亡时间在144~150h之间;对死亡鸡只剖检均可见到明显的心包积液,肝脏出血坏死;肝组织切片HE染色可见典型的嗜碱性核内包涵体。用该病毒制备的灭活疫苗具有良好的免疫保护作用,制作的高免血清也具有良好的治疗效果。     

四株Ⅰ群禽腺病毒的分离与鉴定

将从临床采集的发病鸡组织处理后经绒毛尿囊膜接种7日胚龄SPF鸡胚,通过PCR方法对鸡胚培养物进行鉴定,确定分离到4株Ⅰ群禽腺病毒。结合免疫学试验、病理学试验以及动物回归试验对病毒进行特性研究,结果表明分离的病毒均能致鸡死亡并表现出临床症状。使用针对Ⅰ群禽腺病毒Hexon基因的特异性引物对病毒进行基因测序分析发现,分离株均属于基因C型血清4型禽腺病毒。     

4型禽腺病毒分离株SDLC202011的致病性及全基因组序列分析

为了掌握4型禽腺病毒(FAdV-4)山东聊城分离株SDLC202011的致病特点及遗传变异情况,对其进行了致病性试验和全基因测序分析。结果表明：该分离株对21日龄SPF鸡的致死率为100%,感染鸡的心脏、肝脏、肾脏等器官均具有典型的病理变化,免疫组化显示肝脏、胰腺和肾脏中均检测到该病毒的抗原;全基因组序列长度为43 826 bp,编码34个开放阅读框。与国外参考毒株相比,该毒株和国内其他毒株在35 473～37 439 bp均有1 966 bp的缺失,该区域包含ORF19、ORF48和ORF27;与非致病性毒株相比,高致病力毒株在hexon、fiber1和fiber2分别有1、3和12个氨基酸位点突变,突变主要集中在fiber2。本研究结果表明分离株SDLC202011为高致病力毒株,可在肝脏、胰腺和肾脏等脏器中增殖,为进一步研究FAdV-4的致病机制及疫苗研发奠定了基础。