双抗体夹心ELISA检测伪狂犬病病毒的研究

建立了检测伪狂犬病病毒（ＰＲＶ）抗原的双抗体夹心ＥＬＩＳＡ。试验方法的最佳工作条件为,抗体包被量为５μｇ／孔,酶标抗体的浓度为１２００。对人工感染兔和自然感染猪的组织脏器检测,结果发现扁桃体、脑和肺的检出率最高,其次为心、肝、脾、肾等组织。     

双抗体夹心ELISA检测伪狂犬病病毒的研究

建立了检测伪狂犬病病毒（ＰＲＶ）抗原的双抗体夹心ＥＬＩＳＡ,试验方法的最佳工作条件为：抗体包被量为５μｇ／孔,酶标抗体的浓度为１：２００。对人工感染兔和自然感染猪的组织脏器检测,结果发现扁桃体,脑和肺的检出率最高,其次为心,肝,脾,肾等组织。     

猪蓝耳病病毒抗体双抗原夹心ELISA方法的建立及初步应用

根据PRRSV VR-2332株序列设计了1对扩增PRRSV N蛋白基因的特异性引物,从PRRSV北方株感染细胞中提取总RNA,通过RT-PCR获得长约372 bp的N蛋白编码基因片段。将其克隆到pGEX-6p-1质粒,构建了原核表达载体pPRRS-N。重组基因在大肠杆菌中表达出相对分子质量约为41 000的融合蛋白,目的蛋白表达量约占菌体蛋白的28.5%。利用此重组融合N蛋白建立了一种检测PRRSV特异性抗体的双抗原夹心ELISA,并通过与商品化试剂盒的应用比较对本方法进行了系统评价。分析了来自北京、山东、河南、河北4省区13个养猪场的260份血清,结果表明,本方法的敏感性和特异性分别为93.5%和86.7%,与IDEXX PRRSV抗体检测试剂盒检测结果的符合率达到91.5%。     

双抗体夹心ELISA检测牛病毒性腹泻病毒的研究

建立了从粪便中检测牛病毒性腹泻（ＢＶＤ）病毒抗原的双抗体夹心ＥＬＩＳＡ。试验方法的最佳工作条件为，抗体包被量为１００μｇ／孔，酶标抗体的浓度为１：４００。对不同地区牛、羊、鹿粪样检测结果，牛的ＢＶＤＶ感染率为１６．５％￣８９．０％，羊为１４．６％￣８３．３％，鹿为１９．６％￣４４．４％，并且从许多地区的牛、羊同时检测到ＢＶＤＶ，表明本病在国内某些地区存在着严重的感染。     

牛病毒性腹泻病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

将牛病毒性腹泻病毒超免疫血清以常规方法提取IgG，采用过碘酸钠法标记辣根过氧化物酶（HRP），建立了从粪样中检测牛病毒性腹泻病毒抗原的双抗体夹心ELISA。结果，抗体的最佳包被量为150μg／mL，酶标抗体最适工作浓度为1：200；封闭液为50mL／L的兔血清；待检粪样及酶标抗体的感作时间为37℃ 120min；底物显色时间为室温15min。应用建立的检测方法对河北省8个大中型奶牛场298份乳牛腹泻粪样进行了检测，结果，阳性检出率为42．6％。     

水泡性口炎病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

为建立方便快捷的水泡性口炎病毒(VSV)检测方法,本研究以抗VSV单克隆抗体(MAb)为捕获抗体,兔抗VSV多克隆抗体为检测抗体,建立VSV双抗体夹心ELISA检测方法。结果显示,该方法的最佳工作条件为:抗VSV MAb 1A2的包被浓度为3.09μg/mL,兔抗VSV多克隆抗体和酶标抗体的工作浓度分别为5.16μg/mL和1∶5 000,以OD450nm≥0.231作为阳性判定标准。该ELISA方法对猪水泡病病毒、猪水疱疹病毒及羊传染性脓疱病毒等均无交叉反应;敏感度可达3.125μg/mL(101TCID50);其重复性变异系数小于10%。采用建立的ELISA方法与RT-PCR方法同时检测187份临床样品,符合率达到97.9%,具有良好的相关性。本实验建立的VSV双抗体夹心ELISA检测方法具有特异性好、敏感性高、成本低及方便快捷等优点,可以用于VSV的快速检测。     

双抗体夹心法ELISA检测传染性法氏囊病病毒

利用双抗体夹心法ELISA从腔上囊悬浮液检测传染性法氏囊病病毒(IBDV)。50羽五周龄的没有IBD的白色来亨鸡,以IBDV作实验感染。在感染后4、8、12、24、36和48小时,以及3、4和5天时,分別采集法氏囊。另外,用相同数量的鸡作为对照。用肉眼明显区分阳性和阴性反应之间的不同颜色。ELISA阴性和阳性吸收值之间的分界线是阴性对照平均吸收值加三倍标准差。     

检测非洲猪瘟病毒抗原的双抗体夹心ELISA方法的建立

利用非洲猪瘟病毒(ASFV)p72蛋白不同抗原表位的2株单克隆抗体,1株作为捕获抗体,另1株用辣根过氧化物酶(HRP)标记后作为检测抗体,采用方阵法对ELISA反应条件进行优化,建立了检测ASFV抗原的双抗体夹心ELISA方法。结果显示,该方法中捕获抗体包被质量浓度为1.25 mg/L,酶标单克隆抗体的最适稀释度为1∶4 000。通过试验确定该方法的临界值为0.299,当样品D₄₅₀值≥0.3,且P/N大于2时,判定为阳性。该双单抗夹心ELISA方法可特异性检测ASFV抗原,其他抗原检测结果均为阴性,特异性强;重复性好,批内和批间变异系数(CV)均小于8%。应用本研究建立的方法与荧光PCR方法同时对225份临床样品进行检测,总符合率为96.89%。结果表明,本研究建立的双抗体夹心ELISA方法可用于ASFV抗原的大量样品检测,为ASF防控提供了技术支持。     

SIVp27抗原双抗体夹心ELISA检测方法的研究

目的建立检测SIVp27抗原的双抗体夹心ELISA方法并进行初步应用。方法使用ProteinA亲和层析柱纯化腹水中的SIVp27单抗,用过碘酸钠法对单抗进行辣根过氧化物酶标记。经抗体配对实验确定包被抗体和检测抗体,再用棋盘滴定法确定抗体工作浓度后,探索构建检测SIVp27抗原的双抗体夹心ELISA法。应用建立的双抗体夹心ELISA法,对SIV模型猴血浆标本和SHIV模型猴病毒分离培养上清标本进行了检测,并将其结果与Coulter公司试剂盒检测结果进行比较。结果以稀释至20ug/mL的2E12为包被抗体、1:400稀释的酶标3G3为检测抗体为ELISA最优体系。模型猴血浆标本和病毒分离培养上清标本的检测结果表明自建体系可以用于SIVp27抗原的检测,特异性良好,灵敏度略低于Coulter公司试剂盒。结论检测SIVp27抗原的双抗体夹心ELISA方法初步建成,为研制有独立知识产权的检测试剂奠定了一定的基础。     

ELISA双抗原夹心法检测乳牛白血病病毒的抗体

<正> 用辣根过氧化物酶(Sigma Ⅵ型)标记牛白血病病毒gp69和p24混合抗原(南京农学院微生物组生产),在塑料微量滴定板上作ELISA双抗原夹心法试验,以检测牛白血病抗体。操作过程如下:(1)滴定板的每个小孔加50μg/ml     

马流感病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

为建立一种快速、有效的检测马流感病毒(Equine influenza virus,EIV)的方法,以EIV中国分离株A/马/新疆/07(H3N8)制备的多克隆抗体为捕获抗体,原核表达的核蛋白(NP)制备的单克隆抗体为检测抗体,在国内首次建立了检测EIV的双抗体夹心ELISA方法.用该检测方法分别检测EIV、马动脉炎病毒、马疱疹病毒1型、马疱疹病毒4型和马乙型脑炎病毒阳性样品.结果表明,该ELISA方法具有良好的特异性;与常规检测EIV的血凝试验相比,其敏感性是后者的2.5～10倍;同时与H7N7亚型EIV有交叉反应.攻毒试验结果表明该方法可有效检测鼻腔分泌物中的EIV.该方法的建立为EIV的检测及早期防控提供了有效工具.     

用单克隆抗体建立双抗体夹心ELISA检测传染性法氏囊病毒

利用抗传染性法氏囊病病毒(IBDV)特异性单克隆抗体建立单抗克隆抗体夹心ELISA,本方法对16株IBDV均呈阳性反应.对人工感染和自然发病的鸡法氏囊病的检出率为100％;同时对其它脏器进行了检测,以脾和肾的检出率最高,肝次之,心和肺较低.本法对IBDV蛋白的最小检出量为7.5ng/ml,因而是一种高度灵敏、特异、简便、快速的检测IBDV的方法。     

对虾白斑综合症病毒双抗体夹心ELISA方法的建立

用将纯化的对虾白斑综合症病毒VP28蛋白免疫BALB/c小鼠,分离免疫鼠脾细胞,与SP2/0细胞融合,经间接ELISA筛选,得到了2株（2G9,3E5）可以稳定分泌抗对虾白斑综合症病毒特异性单抗的杂交瘤细胞株。用纯化的VP28蛋白免疫家兔,按常规方法制备多抗。选用单抗（3E5）包被ELISA板,用兔多抗作为捕获抗体,建立了对虾白斑综合症病毒的双抗体夹心ELISA检测方法。该方法具有良好的特异性和敏感性,为对虾白斑综合症病毒的检测提供了有效工具。     

用双抗体夹心ELISA法检测鸡病毒性关节炎病毒的研究

应用鸡病毒性关节炎病毒Ｕ．ＣｏｎｎＳ１１３３株，建立了检测鸡病毒性关节炎病毒抗原的双抗体夹心ＥＬＩＳＡ法。用该法检测三组接毒鸡的关节液，接毒后３天即可检出阳性，阳性率为５８．３％；发病严重的４～１１天阳性检出率达９５７％，１４天阳性率为５０％；１７天阳性率为３１．３％；２０天以后则全部为阴性。用该法对大肠杆菌（Ｅ．ＣｏＬｉ）、葡萄球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、败血支原体（ＭＧ）、滑膜支原体（ＭＳ）、新城疫病毒（ＮＤＶ）、传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）、传染性脑脊髓炎病毒（ＡＥＶ）进行检测，结果均为阴性。试验表明，我们建立的双抗体夹心ＥＬＩＳＡ法，能早期、特异、敏感地检出鸡病毒性关节炎病毒抗原，从而解决了对该病早期诊断及类症鉴别带来的困难。     

应用ELISA双抗体夹心法检测鸡病毒性关节炎病毒的研究

本试验建立了检测鸡病毒性关节炎病毒的ELISA双抗体夹心法.取代反应、阻断试验均为阴性,与NDV、MDV和IBDV无交叉反应,对已知阳性标本的检测均为阳性;其敏感性比琼扩试验高80倍以上,这表明ELISA夹心法具有较高的特异性和敏感性.在人工感染后2～27d,关节滑膜、腱鞘和脾脏中病毒检出率为100％;还从肝脏、法氏囊和脑组织中检测到病毒.     

用双抗体夹心ELISA法检测鸡病毒性关节炎病毒的研究

应用鸡病毒性关节炎病毒Ｕ．Ｃｏｍ Ｓｕｎ株，建立了检测鸡病毒性关节炎病毒抗原的双抗体夹心ＥＬＩＳＡ法。用该法检测三组接毒鸡的关节液，接毒后３天即可检出阳性，阳性率为５８．３％；发病严重的４￣１１天阳性检出率达９５．７％；１４天阳性率为５０％；１７天阳性率为３１．３％；２０天以后则全部为阴性。用该法对大肠杆菌、葡萄球菌、败血支原体、滑膜支原体、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性脑脊髓炎病毒进行检     

禽白血病病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立和标化

利用原核表达的禽白血病病毒(ALV)P27蛋白作为抗原制备的单抗作为包被抗体,以制的酶标兔抗P27作为酶标抗体,在国内首次建立了检测ALV抗原的双抗体夹心ELISA方法.该方法对禽白血病P27抗原的最小检出量为5 ng/mL,通过统计学试验证明自制的诊断试剂具有良好的特异性和稳定性.与IDEXX试剂盒的平行实验确定自制诊断试剂S/P＞O.17为阳性判定标准.应用此方法对北京附近鸡场对抽样检测687份蛋清样品,检测结果与IDEXX的禽白血病抗原检测试剂盒符合率达到100%.