银杏叶提取物抗猪链球菌2型溶血素活性研究

为了筛选猪链球菌溶血素抑制剂并探讨其体外抗猪链球菌感染的作用效果,试验采用溶血试验、最小抑菌浓度测定、生长曲线测定、Trans well小室穿膜试验和细胞毒性试验等方法对其银杏叶提取物进行研究。结果表明:银杏叶提取物在较低浓度时可直接中和猪链球菌培养物上清液介导的成孔活性;在猪链球菌与宿主细胞共感染体系内加入银杏叶提取物可显著降低猪链球菌穿透上皮细胞屏障的能力及细菌介导的细胞毒性作用。说明银杏叶提取物是一种潜在的抗猪链球菌感染药物。     

黄芩提取物对猪链球菌溶血素抑制作用的试验

为了治疗和控制猪链球菌病,本文通过最小抑菌浓度、生长曲线的测定以及溶血试验等筛选针对猪链球菌溶血素(Suilysin,SLY)的抑制剂,研究发现较低浓度的黄芩提取物对猪链球菌几乎没有抗菌活性,但可以显著抑制猪链球菌SLY所诱导的溶血活性;并且黄芩提取物可以显著降低猪链球菌感染所引发的细胞损伤;此外,体内研究发现,黄芩提取物可降低猪链球菌感染小鼠的死亡率。综上,本研究结果表明,黄芩提取物可以通过抑制SLY的生物活性而在猪链球菌感染中发挥治疗作用,是一种具有开发价值、治疗猪链球菌感染的先导复合物。     

双点突变对猪链球菌2型溶血素活性的影响

猪链球菌2型作为一种人兽共患病病原,日益受到关注。而溶血素是其分泌的外毒素,是公认的重要毒力因子之一,具有良好的免疫原性。本试验通过PCR方法获得猪链球菌2型野生型溶血素基因sly和463、464双点突变的溶血素突变体基因slym。将sly和slym克隆至表达载体,构建了2个重组载体并在大肠杆菌中表达了野生型溶血素rSLY和突变型溶血素rSLYm。经过蛋白杂交试验,证明表达的rSLY和rSLYm与提取的猪链球菌的天然野生型SLY分子量完全一致。以提取的野生型SLY为对照,通过溶血试验证明,突变型溶血素rSLYm失去了溶血活性;通过接种PK15、RK13、SUVEC细胞单层,证明突变型溶血素rSLYm失去细胞毒性;通过小鼠试验,证明突变型SLYm对小鼠没有毒力。本试验通过溶血试验、细胞接种和小鼠实验,证明双点突变灭活了野生型溶血素的溶血活性、细胞毒性和小鼠毒力。该溶血素突变体经免疫实验证实后,可作为猪链球菌2型亚单位疫苗的候选抗原。     

黄芩提取物抑制金黄色葡萄球菌α-溶血素溶血活性的研究

α-溶血素(αHL)是金黄色葡萄球菌(S.aureus)重要的毒力因子,为研究黄芩醇提物对αHL溶血活性的抑制作用,本研究通过乙醇回流提取法获得黄芩醇提取物,测定其对S.aureus的最小抑菌浓度(MIC)、对αHL表达和生物学活性的影响以及对αHL介导的A549细胞损伤的保护性作用.试验结果显示,黄芩醇提取物对所测试的S.aureus的MIC均高于2048 μg/mL;黄芩醇提取物能够抑制S.aureus培养物上清中的αHL的溶血活性,并呈浓度依赖关系,但对αHL的表达并无抑制作用;而且黄芩醇提取物也能够呈剂量依赖关系缓解S.aureus αHL介导的对A549细胞损伤作用.该结果表明黄芩醇提取物能够以某种形式导致αHL丧失生物活性,并提示黄芩醇提取物是一种潜在的抗S.aureus感染的复合物.     

重组猪链球菌2型溶血素的表达及其溶血活性和致炎作用

PCR扩增溶血素(suilysin, SLY)基因,克隆后测序,利用原核表达载体pET-28a及表达宿主菌E.coli BL21(DE3)构建SLY原核表达系统,采用SDS-PAGE检测蛋白表达情况,借助Ni-NTA亲和层析法纯化蛋白,获得具有序列保守且可溶性的SLY蛋白。显微镜形态学观察显示,质量浓度为0.4 mg/L的SLY在37℃条件下作用2 h可使贴壁hCMEC/D3(人脑微血管内皮细胞)全部死亡。通过分光光度法测定SLY对人红细胞的溶血活性,结果显示1μg SLY可使2.25×10¹⁰个人红细胞完全溶解。Real-time RT-PCR结果显示,SLY处理所致破碎的红细胞上清可使hCMEC/D3细胞炎性因子IL-6和IL-8转录水平分别升高80倍和100倍以上,且该作用效果显著高于超声破碎红细胞的方式。结果表明,SLY具有显著的细胞毒性,其导致红细胞溶血可能是猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2,SS2)引起机体炎症反应的原动力。     

猪链球菌2型Ⅲ型溶血素的研究

为了探讨猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2,SS2)的Ⅲ型溶血素是否具有溶血活性以及Ⅲ型溶血素在SS2致病过程中的作用,本研究利用同源重组基因敲除法成功构建了SS205ZY的Ⅲ型溶血素(slyrp)基因缺失突变菌株△slyrp及双基因缺失突变菌株△sly/△slyrp,并比较了野生菌株和基因缺失突变菌株的溶血能力以及对小鼠的致病力.结果表明,slyrp基因敲除后可导致SS2裂解红细胞的能力有所下降,而双基因缺失突变菌株△sly/△slyrp的溶血能力完全丧失;slyrp基因敲除后对小鼠的致病力没有影响.结果提示猪链球菌2型Ⅲ型溶血素具有一定的溶血能力,该Ⅲ型溶血素在SS2感染过程中,对溶血素(sly)起协同作用,不是SS2主要的毒力相关基因.     

黄芩提取物对单增李斯特菌溶血素的作用

为了研究黄芩提取物对单增李斯特菌溶血素(LLO)溶血活性及单增李斯特菌致病力的影响,试验采用测定最小抑菌浓度(MIC)、绘制生长曲线、分析溶血活性、蛋白免疫印迹分析和细胞毒性试验的方法分析了黄芩提取物对单增李斯特菌增殖、单增李斯特菌溶血素溶血活性和单增李斯特菌对细胞的毒性作用。结果表明:黄芩提取物可通过直接中和单增李斯特菌溶血素活性而降低溶血活性,且这一作用与黄芩提取物的抗菌活性无关;在细菌与细胞共培养体系内加入黄芩提取物可有效抑制细菌对细胞介导的细胞毒性作用。说明黄芩提取物是一种潜在的抗单增李斯特菌感染的先导化合物。     

猪链球菌2型江苏分离株溶血素的纯化

将猪链球菌2型(Streptococcus suis type2)江苏分离株HA9801接种于THB培养基中培养，得到含溶血素的培养液，其溶血价为128，再经50％饱和硫酸铵沉淀，脱盐，得到溶血素粗提物，溶血价为2048。粗提物用阴离子交换柱层析及凝胶过滤层析，所得活性峰收集液溶血价分别为4096、1024。通过以上三步的纯化，溶血素的比活提高200倍。纯化蛋白在SDS-PAGE中呈现一条带，达电泳级纯度。     

中草药连翘提取物抑制金黄色葡萄球菌α-溶血素分泌活性研究

通过乙醇回流提取获得中草药连翘粗提物,利用MIC值测定、溶血活性测定、免疫印迹、RT-PCR、LDH及live/dead等试验方法研究连翘提取物对金黄色葡萄球菌α-溶血素分泌的影响.结果表明:连翘提取物对金黄色葡萄球菌的最小抑菌质量浓度(MIC)均大于2 048 mg/L,表明连翘提取物不影响金黄色葡萄球菌生长.连翘提取物在16～128 mg/L时,抑制了金黄色葡萄球菌α-溶血素的分泌,而且这种抑制作用呈剂量依赖性.研究结果提示连翘提取物可作为一种潜在的抗金黄色葡萄球菌感染药物,可进一步开发.     

猪链球菌2型溶血素B细胞表位预测

目的预测猪链球菌2型(SS2)溶血素(SLY)B细胞表位。方法以DNAstar分析为主,综合分析二级结构、亲水性、表面可及性及抗原性指数,辅以吴玉章氨基酸抗原指数计算方法进行SS2溶血素B细胞表位预测。结果推测最有可能的B细胞表位位于溶血素N端第74～85、231～244区域位。结论应用多参数预测SS2溶血素的特征,为表位疫苗的研制奠定了基础。     

猪链球菌2型溶血素重组亚单位疫苗的研制

根据已报道的猪链球菌2型(Streptococcus suistype 2,SS2)重要毒力因子溶血素的基因序列,利用DNAstar软件选择抗原性好的一段基因序列,设计并合成该段序列的1对特异性引物。以四川强毒株ZY05719的基因组为模板,PCR扩增后定向克隆至pET-32 a表达载体中;重组质粒转化至原核系统大肠杆菌B21中,经诱导表达目的蛋白后,利用小鼠进行免疫效果的测定和佐剂筛选,结果使用ISA206佐剂的溶血素(Hly)蛋白亚单位疫苗保护率高。     

猪链球菌2型溶血素基因的检测及其序列分析

根据猪链球菌2型的溶血素基因合成了一对可扩增长度为1496bP目的片段的引物，建立了检测溶血素基因的PCR方法。该方法对猪链球菌2型参考株SS2—N株的检测结果为阳性，对马链球菌善疫亚种(C群)参考株ATCC35246、分离株SESZ—Y、SESZ—T、SESZ—C和猪葡萄球菌、大肠埃希氏茵的检到结果均为阴性；用EcoR I内切酶进行酶切．获得了与预期结果一致的863bP和633bP的2个片段。经对SS2—1株的PCR产物进行测序及序列分析，表明其与1933株、P1／7株的核苷酸同源性分别为99．7％和100％。     

猪链球菌ZJ株溶血素基因的克隆和序列分析

猪链球菌ZJ株溶血素（suilysin）基因（sly)用特异引物进行PCR扩增后，采用T-A克隆策略将其克隆至E.Coli DH5a。PCR产物和重组质粒酶切分析表明该基因与已报道的sly基因一致，核苷酸序列分析表明sly基因与P1/7株和1933株的同源性分别为99.6%和99.7%。     

表达猪链球菌溶血素基因的减毒沙门氏菌的构建及鉴定

将猪链球菌溶血素（suilysin，SLY）基因克隆入原核表达栽体pBV220，将重组质粒再导入减毒鼠伤寒沙门氏菌SV4089株，经PCR和酶切鉴定，构建成携带猪链球菌溶血素基因的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌。结果表明：该减毒株具有相对安全性；用酶切和PCR鉴定法证实在无抗生素存在的条件下携带重组质粒的减毒株比较稳定；SDS-PAGE显示SLY能在宿主菌中进行表达。该结果为进一步研究制备猪链球菌口服活疫苗奠定了基础。     

紫锥菊提取物对小鼠免疫器官指数及血清溶血素水平的影响

探索紫锥菊提取物对小鼠免疫功能的影响。试验选取健康成年小鼠80只,随机分为8组,每组10只,分别为空白对照组(生理盐水灌胃),免疫抑制模型组(腹腔注射环磷酰胺100 mg/kg),免疫抑制小鼠紫锥菊提取物高、中、低剂量组,正常对照小鼠紫锥菊提取物高、中、低剂量组,免疫抑制小鼠紫锥菊提取物组和正常对照小鼠紫锥菊提取物组高、中、低剂量组分别按100mg/kg、50 mg/kg、25 mg/kg灌胃,连续灌胃21d,测定其脾脏指数、胸腺指数和血清溶血素水平。试验结果表明,与空白组比较,模型组小鼠脾脏指数、胸腺指数显著降低(P0.05),血清溶血素水极显著降低(P0.01);正常小鼠高剂量试验组脾脏指数显著提高(P0.05);紫锥菊高、中剂量组胸腺指数显著提高(P0.05),血清溶血素水平显著提高(P0.05)。与模型组相比,免疫抑制小鼠紫锥菊高、中剂量组脾脏指数极显著提高(P0.01);各试验组胸腺指数极显著提高(P0.01);紫锥菊高、中剂量试验组血清溶血素水平有极显著提高(P0.01),低剂量组差异显著(P0.05)。     

化脓隐秘杆菌溶血素蛋白的原核表达及其溶血活性鉴定

为研究化脓隐秘杆菌致病机制及其病原学诊断方法,本研究克隆了编码化脓隐秘杆菌溶血素蛋白的plo基因,并构建重组表达质粒pET-plo,转化大肠杆菌Rosetta (DE3)感受态细胞中诱导表达.SDS-PAGE检测结果显示,表达的重组蛋白约为62 ku,western blot分析表明表达的重组蛋白可以与鼠抗化脓隐秘杆菌血清发生反应.采用重组蛋白免疫新西兰白兔制备的多克隆抗体效价达到1∶128 000,western blot和琼脂双扩散试验表明制备的多克隆抗体能够与天然PLO蛋白发生反应.溶血试验表明重组蛋白能够溶解红细胞,制备的多克隆抗体能有效中和重组蛋白的溶血活性.     

李氏杆菌溶血素基因的表达及活性分析

根据LMO溶血素基因hlyA设计引物,PCR扩增hlyA,将扩增产物与pMD18-T连接,重组质粒经酶切鉴定、PCR分析以及确证性测序。将由重组质粒pMD18-hlyA上扩增的缺失信号肽序列的目的片段与表达载体DGEX-4T-1分别酶切连接后,转化BL21细胞。筛选阳性克隆,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析,纯化重组融合蛋白进行溶血试验、小鼠致病力试验和间接ELISA分析。结果表明hlyA基因在大肠杆菌中成功表达分子量82Ku的融合蛋白,能裂解红细胞,且能被LMO阳性血清所识别。一定剂量腹腔注射能将小鼠致死。以此为包被抗原的间接ELISA可以将LMO阴、阳性血清分开。这表明GST-LLO融合蛋白具有良好的生物活性,可用于李氏杆菌病的间接ELISA诊断。     

猪链球菌2型溶血素基因缺失株构建及其生物学特性分析

猪链球菌溶血素(SLY)是较早确定的猪链球菌毒力因子之一,具有细胞毒性,在猪链球菌致病过程中发挥重要作用.利用同源重组技术成功构建了猪链球菌2型(SS2)sly基因缺失的突变株SS2-△sly,缺失株的体外溶血活性消失,对小鼠脑血管内皮细胞的细胞毒性显著低于亲本菌株(P＜0.01),但不影响猪链球菌2型在巨噬细胞中的存活.该菌株可以用于研究SS2溶血素在感染细胞中的作用机制.     

猪链球菌2型江苏分离株溶血素基因检测及序列分析

根据猪链球菌2型（Streptococcus suis type 2）溶血素基因（sly）设计和合成了一对可扩增其完整阅读框的引物，对HA9801等6株猪链球菌2型江苏分离株，1株德国分离株SS2-D及猪链球菌C群参考株ATCC35246的核酸进行PCR扩增，结果显示HA9801等6株江苏分离株及德国株SS2呈阳性．ATCC35246呈阴性。HA9801株PCR产物纯化后测序．序列分析表明该DNA片段与猪链球菌2型1933株的sly基因同源性为99％。     

猪链球菌2型江苏分离株溶血素基因的检测及序列分析

根据猪链球菌2型(strep tococcus su is type 2)溶血素基因(sly)设计和合成了一对可扩增其完整阅读框的引物,对HA 9801等6株猪链球菌2型江苏分离株、1株德国分离株SS2-D及猪链球菌C群参考株ATCC 35246的核酸进行PCR扩增,结果显示HA 9801等6株江苏分离株及德国株SS2呈阳性,ATCC 35246呈阴性。HA 9801株PCR产物纯化后测序,序列分析结果表明该DNA片段与猪链球菌2型1933株的sly基因同源性为99%。