一株肉鸽强毒新城疫的分离鉴定和分子特性分析

从山东地区发病肉鸽中分离到一株新城疫病毒(SDZ08),经测定,其鸡胚半数致死量(ELD50)、鸡胚平均死亡时间(MDT)、1日龄雏鸡脑内接种的致病指数(ICPI)、6周龄鸡静脉接种的致病指数(IVPI)分别为107.85、52.5h、1.8、2.2,表明该新城疫病毒为强毒.通过分析其融合蛋白(F)发现,F蛋白多肽裂解位点为112RRQKRF117,符合NDV强毒株裂解位点氨基酸序列.F基因分型及氨基酸同源性比较发现,SDZ08株属于基因Ⅵ,与La Sota、F48E9、B1、V4等传统毒株同源性较低,与鸽源NDV同源性较高.     

一株肉鸽新城疫强毒的分离鉴定

用SPF鸡胚从病死鸽的内脏组织中分离到一株新城疫病毒(命名为GD-09株),该病毒能使鸡红细胞发生凝集,且这种凝集能被鸡新城疫标准阳性血清所抑制。经测定,其鸡胚平均死亡时间（MDT）、1日龄雏鸡脑内接种的致病指数（ICPI）分别为57.6 h、1.74,表明该新城疫病毒为强毒。通过分析其融合蛋白（F）发现,F蛋白多肽裂解位点为¹¹²RRQRRF¹¹⁷,符合NDV强毒株裂解位点氨基酸序列。F基因分型及氨基酸同源性比较发现,GD-09株属于基因Ⅵ型,与La sota、F48E9、B1、V4等传统毒株同源性较低,与鸽源NDV同源性较高。     

鸭源新城疫病毒TH-1株的分离鉴定及遗传进化分析

试验从吉林省通化某地发病死亡鸭子病料中分离到1株具有血凝性的病毒,通过血凝试验、血凝抑制试验、血清中和试验及融合蛋白(F)基因的扩增测序,初步鉴定为新城疫病毒,命名为TH-1株。该病毒鸡胚平均死亡时间(MDT)、1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)及6周龄鸡静脉接种致病指数(IVPI)分别为53.4 h、1.85和2.575,表明该新城疫病毒为强毒。F蛋白多肽裂解位点为112-RRQKRF-117,符合新城疫强毒株裂解位点氨基酸序列,进一步证明该毒株为新城疫强毒株。F基因核苷酸及氨基酸同源性比对发现,TH-1株与中国野鸭源新城疫病毒分离株mallard China HLJ株的同源性最高,核苷酸同源性达到了99.3%,同为新城疫基因Ⅶ型毒株,与目前新城疫流行的主要基因型Ⅶ型相一致,为鸭源新城疫的有效防制提供了理论基础。     

两株鸽源新城疫强毒株的分离鉴定及分子特性分析

从山东地区疑似新城疫病毒(NDV)感染鸽群中分离到两株新城疫病毒分别命名为pigeon/China/bz12和pigeon/China/bz11,经蚀斑纯化后测定其鸡胚平均死亡时间(MDT)分别为76.6 h、78.8 h,1日龄雏鸡脑内致病指数(ICPI)分别为1.98、1.95,符合NDV强毒特征.设计NDV F基因特异性引物,使用RT-PCR从纯化后鸡胚尿囊液中扩增获得了约1 662 bp基因条带,序列测定确认为NDV F基因,其氨基酸一级结构包含553位氨基酸残基,F0蛋白裂解位点含112-RQKRF-117氨基酸序列,具有NDV强毒株分子特性.依据yellow基因序列同源性对获得2株NDV分离株和42株NDV参考毒株基因型分型,结果显示,2株鸽源NDV分离株都属于基因Ⅶ型,其与基因Ⅶ型NDV不同分离株同源性达93.5％～99.8％,与鸡源强毒NDV分离株Chicken/China/SD8/2010同源性高达99.8％,表明这两株鸽源分离毒株可能来源于感染的鸡群.     

蛋鸡输卵管积液中新城疫强毒的分离鉴定与分子特征

从病鸡输卵管积液中分离了一株新城疫病毒(命名为SHY06),经蚀斑纯化后测定其鸡胚平均死亡时间和1日龄雏鸡脑内致病指数分别为52 h和2.0,F蛋白裂解位点氨基酸序列为112-RRQKRF-117,符合强毒NDV的特征.根据F基因(1-374 bp)对SHY06和19个NDV参考毒株进行基因分型结果表明SHY06属于基因Ⅶ型.F基因氨基酸序列同源性比较显示SHY06与基因Ⅶ型NDV分离株同源性为97.5%～99.5%,与基因Ⅸ型NDV(F48E9等)同源性为91.7%～92.4%,与基因Ⅱ型(疫苗株LaSota等)同源性为89.2%. HN基因氨基酸序列同源性比较显示SHY06与近年来分离株同源性较高,为92.1%～99.7%,与疫苗株(LaSota)和标准强毒株(F48E9)同源性较低,分别为87.6%和89.9%.     

2004年黑龙江省新城疫病毒分子流行病学分析

2004年从黑龙江省部分鸡场疑似新城疫(ND)病死鸡和鸽体内分离到9株NDV。对这9株NDV生物学特性进行测定,并对其F基因包括裂解位点在内的540bp片段进行了克隆、测序和同源性分析。结果表明,9株NDV鸡胚平均死亡时间(MDT)和1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)分别在47.8h～78.4h和1.51～2.00之间;8个分离株在F蛋白裂解位点氨基酸顺序为112RRQKRF117,1个分离株F蛋白裂解位点氨基酸顺序为112RRQRRF117,表明了它们全为ND中、强毒株。同源性分析显示,9株NDV分离株之间核苷酸与推导的氨基酸同源性分别为79.7%～99.7%和79.8%～100%;系统发生树分析表明,6株分离株与台湾株(TW98、TW99和TW2000等)遗传距离较近,可能有共同的起源,为基因Ⅶe型NDV,2株为鸽源NDV基因Ⅵ型,1株与我国特有的F48E9遗传距离最近,为基因Ⅸ型NDV。     

鸭新城疫病毒山东分离株的生物学特性与F基因遗传进化分析

从山东规模化鸭场采集棉拭子样品并接种SPF鸡胚分离鉴定NDV,通过测定鸡胚平均致死时间(MDT)和1日龄雏鸡脑内接种致死指数(ICPI)来确定分离株的毒力,采用RT-PCR方法对分离株F基因进行测序并进行遗传进化分析。结果显示,从正常鸭群棉拭子中分离到4株NDV,F蛋白裂解位点的氨基酸序列表明4个分离株中2株氨基酸序列为112 ERQERL117,1株为112 GKQGRL117,符合弱毒株序列特征;1个分离株为112 RRQKRL117,符合强毒株序列特征。系统进化分析表明,其中2株属于ClassⅠ分支、2株属于ClassⅡ分支,ClassⅡ分支中的2个分离株1个为基因Ⅶ型强毒株,1个属于基因Ⅰ型弱毒株,与Queensland V4等毒株的同源性较高。     

一株基因Ⅱ型新城疫病毒的检测及HN、F基因序列分析

为了掌握辽宁省新城疫病毒(NDV)的分布特点,试验采用新城疫荧光RT-PCR方法检测到1株新城疫病毒,通过接种鸡胚分离鉴定后将其命名为CK/YK1/2013,通过PCR扩增得到HN、F基因全长片段并测定了基因序列。结果表明:该毒株可以使接种鸡胚在38 h内死亡,具备强毒株的生物学特性。CK/YK1/2013的F基因在裂解位点的氨基酸序列为111GGRQGRL117,与弱毒株LaSota序列相同,与其他已知强毒株的裂解位点不同。CK/YK1/2013的HN、F基因与Ⅱ型LaSota毒株的同源性为99.6%,与F48E9及Ⅶ型的同源性分别为89.1%和83.0%,基因进化树分析表明该毒株属于Ⅱ型NDV。     

一株Ⅶb型新城疫病毒的生物学特性研究

本研究对2013年新分离的一株鸡源新城疫病毒(NDV)(P1125)进行了致病指数测定、F基因测序和遗传进化分析,并对La Sota疫苗免疫的保护效力进行了评价。结果显示,该分离株致死鸡胚平均死亡时间为44 h,1日龄雏鸡脑内接种致病指数为1.988,6周龄雏鸡静脉接种致病指数为2.71。F基因测序表明其编码区长度为1 662 bp,共编码553个氨基酸,F基因裂解位点氨基酸序列为112R-R-Q-K-R-F117,具有NDV强毒典型的分子特征,HN蛋白由571个氨基酸残基组成,属于C类NDV,表明该分离株为强毒株。遗传进化分析表明该分离株属于Ⅶb亚型。同源性分析显示该分离株与La Sota氨基酸相似率为88.4%。免疫保护试验表明,La Sota灭活疫苗能够对该分离株标准剂量攻击提供临床保护,但在攻毒1 d、3 d、5 d后均可以检测到排毒现象。本研究为研制专门针对我国流行株的新城疫新型疫苗及我国新城疫的防控具有重要意义。     

新城疫病毒山东流行株F基因的序列测定和分析

用 SPF鸡胚从发生新城疫鸡群分离到一株病毒 ,进行了生物学特性的研究 ,结果表明 ,最小致死量鸡胚平均死亡时间 (MDT)为 5 0 ,1日龄鸡脑内接种致病指数 (ICPI)为 1.82 ,6周龄鸡静脉接种致病指数 (IVPI)为 2 .6 2 ,属强毒力毒株。以异硫氰酸胍法提取病毒基因组 RNA,RT- PCR扩增其融合蛋白 F基因重要功能区片段 ,经回收后 ,克隆到 p GEM- T载体上进行酶切鉴定与核苷酸序列测定 ,并与多株已报道的 NDV国内外参考株相应片段进行序列比较 ,F基因的同源性在 84% - 91%之间 ,氨基酸同源性为 82 % - 93% ,经基因进化树分析 ,证实流行株为基因 型毒株     

1株基因Ⅶ型新城疫病毒的生物学特性研究及全基因组序列分析

为研究当前流行的新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）基因型、致病性及其与传统新城疫病毒疫苗株（La Sota等）的核苷酸差异,试验从某发病鸡场病死鸡体内分离到1株疑似NDV毒株,经红细胞凝集试验（HA）和红细胞凝集抑制试验（HI）初步确定为鸡源NDV。参照GenBank公布的NDV F基因部分片段（登录号：JF950510.1）设计1对引物,通过RT-PCR技术扩增分离株的F基因并克隆、测序,测序结果与NCBI中NDV F基因序列进行比对,构建系统进化树并分析其基因型;通过测定鸡胚平均致死时间（MDT）、1日龄鸡脑内致病指数（ICPI）和6周龄鸡静脉致病指数（IVPI）判断病毒致病性;参照GenBank公布的NDV全基因组序列（登录号：JF950510.1）设计9对引物对分离株进行全基因组序列测定,并分析其基因组结构。结果表明,RT-PCR扩增得到F基因长约500 bp,基于F基因构建的系统进化树显示分离株为基因Ⅶ型NDV;MDT、ICPI和IVPI分别为52.8 h、1.675和2.46,表明分离株属于强毒株。全基因组序列分析显示,分离株全基因组全长15 192 bp,与传统La Sota株基因组相比,序列多出6个碱基,核苷酸序列同源性82.8%。本研究成功分离到1株基因Ⅶ型NDV强毒株,且与传统疫苗毒株La Sota的核苷酸序列同源性差异较大。     

4株NDV流行株的分离鉴定、生物学特性及遗传学特性的研究

为研究近年国内的新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）流行株与传统疫苗株（Mukteswar、La Sota及Clone 30）的亲缘关系和遗传演化情况,试验从广东、广西和海南地区患病的免疫鸡群病料中分离鉴定得到4株NDV流行株。通过RT-PCR技术对各毒株的F和HN基因进行扩增、克隆与序列分析,然后与GenBank上发表的NDV序列进行同源性比对、遗传进化树分析,并测定各毒株致病指数。结果显示,本试验中HN-08株的鸡胚半数感染量（EID₅₀）、平均死亡时间（MDT）、脑内致病指数（ICPI）和静脉致病指数（IVPI）分别为10^-8.37/0.2 mL、58.5 h、1.78和2.45,XX-08株分别为10^-6.50/0.2 mL、75.0 h、1.61和2.41,YS-09株分别为10^-7.75/0.2 mL、64.5 h、1.71和2.38,LF-09株分别为10^-7.60/0.2 mL、63.8 h、1.84和2.38。4株鸡源NDV流行株彼此间F和HN基因推导的氨基酸序列同源性在95.8%以上,与鸡源流行株GX11/03、GM株的同源性为96.8%~98.6%,而疫苗株Mukteswar、La Sota及Clone 30株的同源性为86.7%~90.6%,与标准强毒株F₄₈E₉的同源性为88.4%~91.3%。表明4株NDV流行株均为强毒株,与近年来国内流行的GX11/03、GM株有较近的亲缘关系,而与传统疫苗株的关系相对较远。     

Isolation,Identification of Four Newcastle Disease Virus Strains and Study on Their Biological Characteristics and Genetic Characteristics

In order to study the relationship and evolution between the latest Newcastle disease virus (NDV) epidemic strain and the vaccine strain (Mukteswar,La Sota and Clone 30 strains),four NDV epidemic strains were initially isolated and identified from immunized chicken groups in Guangdong,Guangxi and Hainan provinces. Fusion (F) gene and hemaglutinin neuraminidase (HN) gene of four isolated stains were amplified,cloned and sequenced by RT-PCR method,and the homology analysis of amino acid sequences deduced by F and HN genes of NDV and other strains published in GenBank were studied, the phylogenetic tree were build,and the pathogenicity index of each strain (EID₅₀,MDT, ICPI and IVPI) were determined. The results showed that the EID₅₀,MDT,ICPI and IVPI of the HN-08 strain were 10^-8.37/0.2 mL,58.5 h,1.78 and 2.45,that of the XX-08 strain were 10^-6.50/0.2 mL,75.0 h,1.61 and 2.41,that of the YS-09 strain were 10^-7.75/0.2 mL,64.5 h,1.71 and 2.38,and of the LF-09 strain were 10^-7.60/0.2 mL,63.8 h,1.84 and 2.38.In this experiment,the similarity of amino acid sequences of F and HN genes was over 95.8% among four strains of NDV isolated from chicken,the similarity of four NDV strains with chicken epidemic strains (GX11/03 and GM strains),vaccine strains (Mukteswar,La Sota and Clone 30 strains) and standard virulent strain (F₄₈E₉ strain) were from 96.8% to 98.6%,86.7% to 90.6% and 88.4% to 91.3%,respectively. The results showed that four NDV epidemic strains were virulent strains,which were closely related to the GX11/03 and GM strains that were popular in China in recent years,but relatively far from the traditional vaccine strains.     

一株鸭源新城疫病毒强毒株的分离与初步鉴定

从表现腹泻、神经症状、肠道粘膜局部出血、坏死以及卵泡充血、出血为特征的病死产蛋鸭分离到一株病毒,经血凝（hemagglutinin,HA）、血凝抑制（hemagglutination inhibition,HI）和血清中和试验（seium neutralization,SN）及部分融合蛋白（F）基因的序列测定初步鉴定为新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）,命名为JSD0812株。该毒株10日龄SPF鸡胚平均死亡时间（mean deathtime,MDT）为54．6h,1日龄SPF鸡脑内接种致病指数（intracerebral pathogenicity index,ICPI）为1．75,6周龄SPF鸡静脉接种指数（intravenous pathogenicity index,IvPI）为2．68,其F蛋白裂解位点氨基酸序列为^112R—R—Q—K—R—F^117,上述结果符合NDV强毒株的分子特征,证实该毒株为NDV强毒株。致病性试验表明该毒株对鸡、鸭和鹅均有很强的致病性．     

基于F和HN蛋白的基因Ⅶ型新城疫病毒嵌合疫苗的构建及免疫效力评估

【目的】试验旨在构建一种基因Ⅶ型新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)嵌合疫苗,并对其免疫效力进行评估。【方法】利用反向遗传学技术,以含有禽偏禽腮腺炎病毒2型(Avian metaavulavirus-2,AMAV-2)Y2株基因组的重组质粒pT7-Y2为模板,将Y2株的F和HN蛋白的胞外区替换为基因Ⅶ型NDV HB0901株的F和HN蛋白的胞外区,将HB0901株的F蛋白裂解位点突变为LaSota弱毒株的F蛋白裂解位点,构建嵌合重组病毒rY2-FHNR株。对rY2-FHNR株的增殖特性、致病力及遗传稳定性等生物学特性进行检测,并通过接种2周龄SPF鸡评估rY2-FHNR株的免疫原性及其免疫血清与Y2株的交叉反应性,利用NDV NP蛋白的间接ELISA方法对免疫血清进行检测,验证其鉴别诊断效果。【结果】试验成功获得了嵌合重组病毒rY2-FHNR株,生物学特性检测结果显示,rY2-FHNR株在鸡胚中的增殖滴度和致病性符合弱毒特征,其鸡胚传代的遗传稳定性良好。rY2-FHNR株可诱导机体产生针对NDV的抗体,且免疫血清不与rY2株抗原发生交叉反应。通过NDV...     

新城疫病毒弱毒骨架表达强毒F基因的重组病毒生物学特性研究

为了解目前中国新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）优势基因VIId型的毒力机制,应用反向遗传技术将我国优势流行基因VIId型强毒株I4的F基因替换弱毒LX的F基因,获得表达NDV强毒株I4F基因的重组病毒NDV/LX-If。测定重组病毒的致病指数和组织分布,结果发现,重组病毒NDV/LX-If毒力比骨架病毒有了显著的提高。NDV/LX-If的鸡胚平均致死时间（mean death time,MDT）为56 h,雏鸡脑内接种致病指数（intracebral pathogenicity index,ICPI）为1.49,属于中等毒力,毒力比亲本病毒毒力低,但都能使自然途径感染的鸡100%死亡,同时获得了亲本毒株的组织嗜性。可见,新城疫病毒F基因是毒力和组织嗜性的主要决定因素,但是其它基因对新城疫病毒的毒力也可以产生影响。     

肉鸽新城疫强毒的分离与鉴定

从山东地区发病的肉鸽群中分离到一株新城疫病毒,经测定,其鸡胚半数致死量(ELD50)为107.8,10日龄鸡胚平均致死时间(MDT)为52.5h,1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)为1.8,6周龄幼鸡静脉接种致病指数(IVPI)为2.2,证明该NDV为强毒.将该病毒回归非免疫肉鸽,能产生典型的新城疫症状与病变.     

新城疫病毒西藏分离株的生物学特性鉴定及遗传进化分析

从西藏病死藏鸡中分离到具有血凝活性的病毒、经血凝抑制试验、电镜观察、PCR扩增和测序鉴定为新城疫病病毒(NDV),通过动物致病性试验证明该病毒对鸡具有致病性;分离毒株毒力测定结果显示,MDT为120h,EID50为10-8.44、IVPI为0.5、ICPI为0.6,均符合NDV弱毒株特征。血凝解脱及血凝素热稳定性试验显示:各分离株的血凝解脱时间短,血凝素热稳定性较差,符合NDV弱毒株的特征。F基因的序列测定遗传进化分析表明,西藏分离毒株之间的核苷酸序列具有99%的同源性,与疫苗株LaSota的同源性为90%;与国内标准强毒株F48E8同源性为81%。推导其氨基酸序列分析表明,各分离株的F蛋白的裂解位点氨基酸112 G-K-Q-G-R-L117,具有NDV弱毒株特征,与毒力测定结果相符。本研究首次报道了NDV西藏分离毒株遗传进化情况和生物学特性情况,为进一步研究高海拔、缺氧环境下NDV生物学特性变化研究奠定了基础。     

半番鸭源禽1型副粘病毒FM01株的分离鉴定与F蛋白基因分析

从表现类似新城疫症状的病死半番鸭中分离到1株病毒FM01株，经血凝及血凝抑制试验证实为禽1型副粘病毒、以SPF鸡胚测定其平均致死时间为113，4h，对1d雏鸡脑内接种致病指数为0．23，表明为温和型毒株。利用RT-PCR技术一次性扩增其F蛋白全基因，克隆到pMD 18-T质粒载体，测序后获得F基因全序列，并推导出其相应的氨基酸序列。FM01株的F蛋白基因完整的编码区全长1662bp，编码553个氨基酸，其裂解位点的氨基酸序列为112G-R-Q-G-R-L117，具有温和型毒株特有的氨基酸序列结构．与常见新城疫毒株的核苷酸同源性在88．4％～99.6％之间，氨基酸同源性在89．2％～99.1％之间。