玉米大斑病菌StPEX11基因家族的鉴定及生物信息学分析

PEX11基因家族成员是参与过氧化物酶体增殖调控的关键因子。在玉米大斑病菌基因组中鉴定出2个PEX11基因,根据其相对分子质量分别命名为StPEX11-1和StPEX11-2。利用生物信息学方法,对基因结构、蛋白质的保守结构域及理化性质进行分析,预测其二级结构域。系统发育树分析发现,玉米大斑病菌的2个StPEX11基因分别属于I型和III型的PEX11亚家族。     

黑龙江玉米大斑病菌生理分化研究

用常规鉴别寄主鉴定方法对2005年和2006年采自黑龙江省玉米主产区的48个大斑病菌菌株进行生理分化鉴定。结果表明,在黑龙江玉米产区鉴定出0、1、12、13、23N、123共6个生理小种。黑龙江玉米大斑病菌以0号生理小种为主,所占比例为52.08%;但其他小种有上升为优势小种的趋势,如1、12、13号小种所占比例分别为22.92%、10.42%和8.33%。说明黑龙江玉米产区玉米大斑病菌生理分化组成已发生变化,并且出现了克服多个抗性基因的生理小种,小种毒性组成呈复杂化。     

玉米大斑病菌种群遗传多样性研究

应用随机扩增多态性DNA技术,对采自我国不同地区的玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)39个菌株的DNA遗传多样性进行研究。结果表明,可将39个菌株基本分成5组,并且在同一组内不同菌株间的遗传多样性也有差异。来自不同地区相同品种上的菌株和同一地区不同品种的菌株的DNA多态性存在差异,表明我国玉米大斑病菌中具有丰富的种内遗传多态性。     

玉米对大斑病菌3号小种表达的单基因抗性在不同光温条件下的变异

玉米大斑病是由Exserohilum turcicum(Pass.)(其有性阶段为Setosphaeria turcica)所引起的,可利用多基因和单基因的抗性有效地控制。对于大斑病的多基因抗性早在35年之前已经得到鉴定。后来育种的程序则发展用多基因抗性以改进玉米的群体。玉米大斑病菌小种专化的抗性通常是由单一显性基因所控制,表现为褪绿斑和减少病原孢子的产生。由H t~1     

热激对玉米大斑病菌生长和发育的影响

通过对玉米大斑病菌进行热激处理,观测热激对病菌孢子萌发、菌丝生长速度、菌落形态、菌丝形态等方面的影响。结果表明:热激处理对分生孢子萌发率的影响与热激温度有关,42℃热激促进孢子萌发,45℃热激对孢子萌发没有显著影响,48℃热激则会显著抑制孢子萌发;42℃～48℃热激处理会降低病菌的菌落生长速度,热激温度越高菌落生长速度越慢;42℃～48℃热激对菌丝形态、分生孢子形态、菌落颜色和菌落形态均无明显影响,但菌丝细胞中的内容物减少,有时出现内容物缺失的菌丝细胞。     

氮饥饿对玉米大斑病菌生长和发育的影响

以改良Fries合成培养基为基础,观测氮饥饿胁迫条件下玉米大斑病菌菌株01-11和03-22在菌落生长速度、分生孢子产生时间和数量、菌落形态和颜色等方面的变化。结果发现,在缺氮条件下,培养6 d后菌落生长停滞,颜色变淡;菌丝稀疏,老化程度加快;分生孢子出现时间提前,但产孢数量减少。研究结果说明,氮元素对玉米大斑病菌的生长和发育有非常重要的作用。     

玉米大斑病菌原生质体遗传转化体系的建立

以玉米大斑病菌菌株01-23为出发菌株,对影响原生质体遗传转化的主要条件进行了研究,包括原生质体制备的材料、酶解系统、稳渗剂、载体浓度及线性化程度等。结果表明,改良Fries培养基中培养24 h的分生孢子悬浮液是原生质体制备的首选材料;2%溶壁酶和1%蜗牛酶两种酶混用是最佳的酶解系统;0.7 mol/LNaCl是最适的稳渗剂;环状载体比线性载体转化效率高5倍以上;在载体浓度为100μg/mL时转化效率最高。     

玉米大斑病菌亲环素基因的克隆及表达规律分析

利用简并引物PCR结合RACE技术获得S. turcica中亲环素基因的全长,并通过Real-time PCR技术检测该基因在病菌侵染结构发育过程中的表达模式。结果表明,玉米大斑病菌亲环素基因开放阅读框全长1 125 bp,3′UTR 154 bp,5′UTR 93 bp,编码374个氨基酸,将此基因命名为CyPs1,并将其cDNA序列提交GenBank,获得登录号EU679371.1,Protein ID为ACD62431.1。系统发育树分析显示,CyPs1与玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)、蓝莓枯枝病菌(Neofusicoccum parvum)等物种的亲环素同源性可达到90%以上。该基因在病菌分生孢子萌发、附着胞形成及侵染阶段均有表达,至附着胞形成和侵染菌丝形成阶段,转录水平分别升至分生孢子时期的2倍和3倍。     

河北省玉米大斑病菌生理小种组成研究

采用鉴别寄主鉴定技术,对2009～ 2010年采自河北省的120份玉米大斑病菌菌株进行生理小种组成及毒性分析.结果表明,共鉴定出15个生理小种致病类型,即0、1、3、N、12、13、1N、23、2N、3N、123、12N、13N、23N和123N,其中,0号和1号生理小种为优势小种,分别占总分离数的24.2％和20.8％;其次为1N和N号生理小种,分别占总分离数的10.0％和9.2％.春玉米区大斑病菌生理小种的结构较复杂,出现多个生理小种类型,夏玉米区大斑病菌生理小种的结构相对较简单.将各菌株进行毒性分析发现,河北省玉米大斑病菌对Htl和HtN基因的毒性较高,毒性频率分别为57.5％和37.5％;对Ht2和Ht3基因毒性较低.     

甘肃省玉米大斑病菌对啶酰菌胺的敏感性监测

为了明确啶酰菌胺对玉米大斑病菌的毒力水平,采用菌丝生长速率法测定甘肃省玉米大斑病菌对啶酰菌胺的敏感性。结果表明,甘肃省3个生态区160株玉米大斑病菌对啶酰菌胺的敏感性差异较小,平均EC₅₀为0.19μg/mL,EC₅₀范围在0.01～0.88μg/mL。平均EC₅₀高低顺序依次为南部湿润区>东部半湿润半干旱区>中部旱作雨养区,南部湿润区63株菌株的平均EC₅₀为0.21μg/mL,EC₅₀范围在0.02～0.88μg/mL;东部半湿润半干旱区52株菌株的平均EC₅₀为0.19μg/mL,EC₅₀范围在0.04～0.62μg/mL;中部旱作雨养区45株菌株的平均EC₅₀为0.16μg/mL,EC₅₀范围在0.01～0.54μg/mL。正态性检验表明,甘肃省3个生态区160株玉米大斑病菌对啶酰菌胺的EC₅₀值呈现连续性负偏态分布,曲线平坦。甘肃省玉米大斑病菌对啶...     

抑制ZmCol3基因表达调控玉米开花期

采用ZmCol3基因RNAi载体构建、农杆菌介导玉米遗传转化、转基因材料开花期表型鉴定等研究方法,评估抑制ZmCol3基因表达对玉米开花期的影响。转基因玉米基因组PCR结果证实,人工合成RNAi片段已成功整合到玉米基因组中。qRT-PCR结果表明,在不同转基因玉米株系中ZmCol3基因表达受到不同程度的抑制。温室转基因玉米开花期相关性状调查结果表明,抑制ZmCol3表达,可以将玉米抽雄、散粉和吐丝时间提前2~3 d。研究结果证实,ZmCol3具有调控开花期的生物学功能,抑制该基因表达进而缩短玉米开花期可以作为行之有效的方法应用到玉米熟期改良研究中。     

低温条件下小麦返白系叶片中H2O2累积的原因初探

为了研究低温处理下小麦叶色阶段性白化品种返白系与对照品种矮变1号叶片的H_2O_2含量是否存在差异,并初步分析导致差异的原因,采用DAB组织染色法检测返白系和矮变1号在4℃低温处理90 d、25℃下恢复培养10 d时叶片H_2O_2含量的动态变化,测定4℃低温处理下返白系和矮变1号中表征光合电子传递效率的荧光参数F_v/F_m和qP,并采用qRT-PCR方法分析返白系和矮变1号中几个光合电子传递体基因及质体H_2O_2清除相关基因的表达模式。结果显示,低温处理下,矮变1号叶片中H_2O_2含量变化不大,返白系叶片中H_2O_2会大量累积;低温处理下,返白系叶片的叶绿素荧光参数F_v/F_m、qP都明显低于矮变1号。同时,低温下返白系光合电子传递链中部分电子传递体亚基基因petD、petN、ndhB和ndhK,以及质体H_2O_2清除相关基因 APX4和 HO1的表达量低于矮变1号。这些结果表明,低温处理下,相较于矮变1号,返白系叶片中会累积大量的H_2O_2。返白系质体中光合电子传递受阻引起电子泄露,同时质体中清除活性氧的能力下降,可能是导致返白系叶片中积累大量H_2O_2的原因。     

玉米热激蛋白ZmHSP70-12基因的克隆及表达分析

热激蛋白70(HSP70)是原核和真核细胞中普遍存在的一种高度保守的分子伴侣。从玉米中克隆1个HSP70家族成员。该基因cDNA序列全长为1 992 bp,开放阅读框为2 352 bp,编码663个氨基酸,蛋白质分子量约75.0 kD。蛋白结构预测及同源比对分析表明,该基因编码蛋白含ATPase位点和HSP70保守结构域,与拟南芥AtHSP70-12序列高度相似,命名为ZmHSP70-12。蛋白亚细胞定位显示,ZmHSP70-12蛋白在内质网中表达。实时荧光定量PCR分析表明,ZmHSP70-12对非生物胁迫高温、干旱均具有明显的应答反应,推测ZmHSP70-12是玉米中与胁迫逆境相关的基因。     

玉米氮胁迫响应NRT基因的鉴定及ZmNRT2.5的克隆和表达分析

硝酸盐转运蛋白(Nitrate Transporters,NRTs)在植物根系NO₃^-吸收或转运中发挥重要作用。为探究玉米NRTs基因在氮素吸收中的功能,从前期转录组数据中鉴定出7个响应氮素处理的差异表达ZmNRTs基因。启动子顺式作用元件分析表明,这些ZmNRTs基因的启动子均含有多个植物逆境或激素应答元件,推测他们可能与玉米非生物胁迫应答或植物激素调控氮素吸收相关。从玉米根系中克隆了对氮素处理响应最大的ZmNRT2.5,该基因CDs全长为1 563 bp,编码520个氨基酸。进化树分析结果表明,ZmNRT2.5与AtNRT2.5同源性最高,含有保守的硝酸盐转运结构域,二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,含11个跨膜结构域。实时荧光定量PCR分析表明,ZmNRT2.5主要在根、老叶和叶鞘中表达。低氮处理显著诱导ZmNRT2.5在根中的表达,植物激素脱落酸、赤霉素和乙烯均参与调控ZmNRT2.5的表达。同时,ZmNRT2.5基因的表达受到盐胁迫的显著抑制。     

玉米shrunken2突变体中醇溶蛋白合成相关基因的表达分析

利用SDS-PAGE和荧光定量PCR,研究shrunken2(sh2)突变体子粒胚乳发育不同时期醇溶蛋白的积累以及醇溶蛋白合成相关基因的表达情况。结果表明,与郑58相比较,sh2中氨基酸组分变化与opaque2(o2)相似,赖氨酸含量升高,同时谷氨酸和亮氨酸含量下降。SDS-PAGE结果显示,胚乳发育不同时期sh2中醇溶蛋白的积累均明显低于郑58,而且sh2中19-kDa α-醇溶蛋白积累明显减少。荧光定量PCR结果表明,sh2突变体中对于Z1A、Z1B和Z1D家族基因的抑制较为显著。sh2突变体中prolamine-box binding factor (PBF)表达量升高,opaque2(o2)表达下降。因此,sh2突变体同时影响淀粉、氨基酸、贮藏蛋白等的代谢。     

玉米Opaque-2基因在毕赤酵母中的表达

从玉米自交系辽2345授粉后18 d的胚乳中提取总RNA,经反转录后得到第一链cDNA,利用Opaque-2基因的特异引物克隆出该基因的全编码区,将该编码区的全序列以正确的阅读框架利用Infusion同源重组的方法亚克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9的α因子下游,并置于AOXⅠ启动子控制下,利用pPIC9表达载体上的特异引物进行PCR鉴定,鉴定后的重组质粒用Bgl Ⅱ酶切线性化后,电转化导入甲醇型毕赤酵母菌株GS₁15中,利用MM、MD和菌落PCR的方法筛选出Mut⁺表型,得到的重组子以甲醇诱导表达蛋白。经SDS-PAGE结果显示,Opaque-2蛋白得到表达,其相对分子质量（Mr）约为47 KD。     

玉米大斑病病菌对热带玉米种质CML493的DNA甲基化变异与mRNA表达分析

以热带高抗大斑病玉米种质CML493幼苗为试验材料,采用人工接种大斑病病菌处理,采用甲基化敏感扩增多态性（MSAP）技术和转录组测序（mRNA-seq）技术,对经过接种大斑病病菌处理不同时间的CML493基因组DNA胞嘧啶甲基化进行DNA甲基化模式、DNA甲基化水平分析和mRNA表达分析。结果表明,接种大斑病病菌6、12 d的甲基化敏感扩增多态性分别为78.21%和76.13%,甲基化敏感扩增单态性分别为21.79%和23.87%。接种大斑病病菌6 d时,总甲基化率上升5.49%,全甲基化率上升14.24%,半甲基化率上升6.11%。接种大斑病病菌12 d时,总甲基化率上升6.40%,全甲基化率上升16.73%,半甲基化率上升5.57%。接种大斑病病菌0、6、12 d共检测到2 298个共表达基因,共检测到1 434个共表达上调基因,检测到769个共表达下调基因,上调基因数目显著多于下调基因数目。     

玉米ZmWRKY45基因克隆及盐碱逆境胁迫下的表达分析

通过水稻中OsWRKY45基因在NCBI中进行同源序列比对,电子克隆ZmWRKY45基因并与其他物种中的同源基因进行进化树分析。利用该基因的CDS区设计特异引物,在3叶期对吉单441进行不同浓度NaHCO_3处理,对玉米杂交种吉单441及其双亲自交系进行验证。结果表明,在吉单441及其父本中含有ZmWRKY45,在盐碱胁迫下吉单441中该基因随着盐碱浓度的升高而表达量升高,初步判断该基因可能在吉单441的耐盐碱过程中起到正向调控作用。     

玉米ZmGAPDH2基因的克隆及表达特性分析

研究通过同源比对查找GAPDH基因的保守区,运用逆转录PCR和同源克隆技术从玉米叶片中克隆出GAPDH2基因的全长cDNA序列。采用qRT-PCR分析两个玉米品种登海605和蠡玉35幼苗叶片中GAPDH2基因在非生物胁迫和ABA 处理下的表达特性,利用二维凝胶电泳（2-DE）和基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱法（MALDI-TOF）,对登海605和蠡玉35幼苗在干旱胁迫下叶片中的GAPDH蛋白表达水平进行分析。结果表明,ZmGAPDH2基因开放阅读框（ORF）全长1 014 bp,编码337个氨基酸。ZmGAPDH2蛋白分子量为36.53 kDa,属于亲水性蛋白。生物信息分析发现,玉米 ZmGAPDH2 蛋白和单子叶植物小米 GAPDH2 蛋白的亲缘关系最近,同源性高达94.66%。qRT-PCR分析表明,ZmGAPDH2在登海605和蠡玉35叶片中均能被ABA和PEG处理诱导表达,登海605在NaCl和蠡玉35幼苗在低温处理下其表达量均有所下降。干旱对登海605和蠡玉35幼苗叶片中ZmGAPDH2蛋白表达量也有影响。     

酸碱度对StRALF基因表达量的影响及初步分析

快速碱化因子(RALF)是一种能够参与植物发育调控的植物肽激素,在真菌中也广泛存在并且影响真菌对寄主的侵染状况。通过外源添加酸碱来明确pH值对玉米大斑菌生长的影响,使用实时荧光定量PCR技术分析玉米大斑病菌中StRALF基因在外源添加酸、碱时表达量的变化。运用预测网站对克隆得到的StRALF基因编码区蛋白序列的基本性质进行分析。结果表明,玉米大斑瓋菌在碱性环境下生长状态较好。碱性条件下,StRALF基因比酸性条件下基因表达量高。在侵染寄主过程中,96 h及以后表达量达到最大。经预测分析,初步确定其为分泌蛋白或膜蛋白。在弱碱性条件下,StRALF基因表达量较高并参与侵染过程及侵染后的生长阶段。