齿兰环斑病毒与建兰花叶病毒分子检测研究

齿兰环斑病毒（Odontoglossum ringspot virus,ORSV）与建兰花叶病毒（Cymbidium mosaic virus, CyMV）是严重危害兰科植物的两种主要病毒。本研究根据病毒外壳蛋白基因设计特异性引物,应用ELISA、普通RT-PCR、巢式RT-PCR和免疫捕获RT-PCR4种方法进行了检测研究与比较。结果表明：普通RT-PCR与ELISA方法检测灵敏度相当;巢式RT-PCR检测灵敏度要比普通RT-PCR与ELISA方法高出104倍以上;免疫捕获RT-PCR检测灵敏度介于普通RT-PCR和巢式RT-PCR之间。采用巢式RT-PCR方法对我国台湾进境的蝴蝶兰植株样本检测,1号样本出现与阳性对照一致的特异条带。双向测序分析,扩增产物序列与ORSV外壳蛋白基因具有100％的同源性,表明1号蝴蝶兰样本携带ORSV。     

实时荧光RT-PCR方法检测齿兰环斑病毒与建兰花叶病毒

齿兰环斑病毒（Odontoglossum ringspot virus, ORSV）与建兰花叶病毒（Cymbidium mosaic virus, CymMV）是严重危害兰科植物的2种主要病毒。本研究根据病毒不同分离株外壳蛋白基因的保守序列,分别设计了ORSV与CymMV各自的特异性引物与荧光探针,建立了基于TaqMan探针的实时荧光RT-PCR检测方法。该方法与酶联免疫检测方法相比,灵敏度提高104倍,具有快速、灵敏和高特异性的优点,适合对ORSV和CymMV的快速检测。应用该方法,从来自台湾的蝴蝶兰样品中检出齿兰环斑病毒。     

TaqMan探针双重实时荧光定量PCR法同步检测兰花中的建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒

为建立一种同步定量检测建兰花叶病毒(cymbidium mosaic virus,CymMV)和齿兰环斑病毒(odontoglossum ringspot virus,ORSV)的高效检测方法,本研究根据CymMV和ORSV CP基因高度保守区分别设计引物和探针并筛选,获得156 bp和148 bp的靶标序列及对应的最优特异性引物探针组合,建立了基于TaqMan探针的双重实时荧光定量PCR方法。该方法最低检出限为1拷贝或6.2×10-3fg,最低稳定检出限为10拷贝或6.2×10-2 fg,是RT-PCR的10~100倍;构建的标准曲线线性关系良好,扩增效率分别为97.7%和100.2%,相关系数R2分别为1.000和0.999;对其他5种常见病毒均无扩增曲线,检测特异性强;批组内与批组间重复性试验Ct值变异系数≤0.60%,重复性和稳定性好。利用该方法和基因芯片法分别对4个种属的66个兰花样品进行方法验证,该方法相较于基因芯片法检出率提高了53.85%(CymMV)和162.5%(ORSV)。综上所述,本方法可同时高通量检测CymMV和ORSV 2种病毒靶基因,结果可靠,应用前景广阔,可为开展病毒精准鉴定、科学防控以及从源头遏制病毒传播提供技术支撑。     

南瓜花叶病毒胶体金免疫层析试纸条的研制

使用柠檬酸三钠还原法制备25nm粒径的胶体金颗粒,在pH7.6,蛋白用量13μg/mL条件下,制备形成稳定胶体金蛋白复合物;使用微定量喷头在硝酸纤维素膜上喷好病毒检测线和质控线,组装制成免疫层析检测试纸条。结果表明经过条件优化后制备的南瓜花叶病毒试纸条特异性好,可在10min内检测出结果,且对南瓜花叶病毒阳性材料的检测灵敏度可达到稀释104倍。     

番茄环斑病毒和烟草环斑病毒复合型胶体金免疫层析试纸条的研制

采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记番茄环斑病毒和烟草环斑病毒的兔多克隆抗体,用微定量喷头在硝酸纤维素膜上喷好2条病毒检测线（T线）和1条羊抗兔抗体质控线（C线）,制成复合型免疫层析检测试纸条。一张试纸条在10min内,可同时检测出这两种病毒。试纸条检测番茄环斑病毒和烟草环斑病毒粗提纯液,检测灵敏度在1μg/mL,试纸条检测番茄环斑病毒和烟草环斑病毒的混合病汁液可稀释1000倍（重量/体积）。用健康叶片和缓冲液对照测试,试纸条结果都为阴性。     

从进境的蝴蝶兰上检出齿兰环斑病毒

齿兰环斑病毒 (OdontoglossumringspotvirusORSV)是兰花上的主要病毒 ,可侵染多种兰科植物 ,在卡特兰和建兰上危害尤为严重。在蝴蝶兰上 ,叶表现轻花叶 ,花畸形或发育不良 ,严重影响花的数量和品质。 2 0 0 2年9月 ,我们从来自台湾的蝴蝶兰中发现可疑症状植株 ,经透射电镜观察和血清学检测为齿兰环斑病毒。1　材料和方法1 1　材料进境的蝴蝶兰苗 ,花叶坏死症状 ( 1号样品 )、没有症状的 ( 2号样品 )取叶片进行检测 ;2 %的磷钨酸 (厦门大学化学系提供 ) ;血清学试剂和阳性对照由国家质检总局动物检所提供 ;本实验室保存的无病毒蝴蝶兰植株…     

胶体金免疫层析法快速检测烟草环斑病毒

采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒 ,标记烟草环斑病毒的抗体 ,制成免疫层析检测试纸条。检测粗提纯病毒的灵敏度为 1 0 0 0ng/ml,病汁液稀释 1 0 0 0倍后仍可快速检出。对大豆病种子、烟草冻干病叶等不同材料进行检测也有良好的效果 ,1～ 2min即可出现结果。用 9种不同的病毒进行测试 ,未出现非特异性反应。     

A蛋白斑点免疫金染色和双抗体夹心酶联检测齿兰环斑病毒的比较

A蛋白斑点免疫金染色检测齿兰环斑病毒提纯病毒的灵敏度为1.56 ng/μl,检测病汁液的稀释倍数为640倍.同时采用碱性磷酸酯酶标记抗体IgG.IgG包被酶联板的浓度为1 μg/ml,酶标抗体以1 /1000稀释使用.DAS-ELISA技术检测ORSV提纯病毒的灵敏度为0.048 ng/μl,检测病汁液的稀释倍数为20480倍.     

黄瓜绿斑驳花叶病毒磁免疫层析试纸条的研制

用磁性纳米颗粒标记黄瓜绿斑驳花叶病毒的兔多克隆抗体建立了简便快速的磁免疫层析试纸条检测方法。该方法检测提纯病毒的灵敏度为0.1 μg/mL,检测葫芦病汁液可稀释10 000倍(重量／体积)。试纸条和黄瓜绿斑驳花叶病毒具有特异性反应,和同属的烟草花叶病毒、番茄花叶病毒、辣椒轻斑驳病毒和齿兰环斑病毒,未出现交叉反应。该试纸条可用于田间病害检测和诊断。     

电化学酶联免疫分析检测烟草花叶病毒和烟草环斑病毒

以邻苯二胺 (OPD)底物为例 ,用抗原直接包被法 (DAC -ELISA)同线性扫描极谱法 (LSV)相结合 ,检测烟草花叶病毒 (TMV)的提纯液 ,检出限可达 0 2 5ng/ml,TMV粗提液的最高稀释比为 1 :1 0 2 4 0 0 ;检测烟草环斑病毒 (TRSV)提纯液 ,检出限为 1 0ng/ml,粗提液的最高稀释比为 1 :1 0 0 0 0 ,该方法的灵敏度比DAC -ELISA光度法提高了 5倍以上     

文心兰病毒病病原鉴定

在云南省昆明市的文心兰栽培基地发现了具有病毒病典型症状的感病文心兰植株。感病样品在电镜下可观察到长460-500 nm的线状病毒粒体和长约300 nm的杆状病毒粒体中的一种或两种,分别与已报道的建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒粒体大小一致。感病样品可以和建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒血清中的一种或两种呈阳性反应。利用建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒的特异性引物,运用RT-PCR方法可以扩增到与引物设计预期大小一致的核酸条带。由此证明,云南文心兰病毒病的病原是建兰花叶病毒和齿兰环斑病毒中的一种或两种。     

瓜类果斑病菌胶体金试纸条的检测应用

瓜类果斑病是一种严重为害西甜瓜作物的细菌病害,胶体金试纸条是对其进行现场检测的主要手段.将中国检验检疫科学研究院研制的瓜类果斑病菌胶体金检测试纸条与市场上商品化的美国Agdia公司同类试纸条进行比较,发现两种试纸条的灵敏度和特异性相当,适用于检测出现疑似果斑病症状的叶片和果实;也可用于种子带菌检测,但易出现假阳性结果....