猪MSTN基因双筛选标记打靶载体的构建及其功能鉴定

【目的】利用正负筛选策略,构建猪肌肉生长抑素（Myostatin,MSTN）基因的双筛选标记打靶载体。【方法】以猪胎儿成纤维细胞DNA为模板,PCR扩增MSTN基因同源长、短臂;采用PCR和Overlap PCR扩增打靶载体正筛选标记嘌呤霉素和绿色荧光蛋白基因及负筛选标记单纯疱疹病毒胸苷激酶基因。以pUC57载体为骨架载体,在其多克隆位点连接一段包括Frt序列在内的酶切位点的多克隆位点序列,在2个Frt序列之间连接正筛选标记嘌呤霉素基因和绿色荧光蛋白基因,在Frt序列两侧分别连接5.7和1.9 kb的MSTN基因同源长、短臂;在同源短臂后连接负筛选标记单纯疱疹病毒胸苷激酶基因,将目的片段与载体定向连接克隆。用脂质体法将打靶载体转染猪肾细胞（PK15细胞）,用嘌呤霉素和丙氧鸟苷进行正负筛选,验证正负筛选标记基因的功能。【结果】成功克隆了猪MSTN基因同源长、短臂及正筛选嘌呤霉素和绿色荧光蛋白基因及负筛选单纯疱疹病毒胸苷激酶基因,构建了猪MSTN基因双筛选标记打靶载体,打靶载体长14 kb。在打靶载体转染的PK15细胞中,正负筛选标记基因均有生物学活性。【结论】成功构建了猪MSTN基因双筛选标记打靶载体。     

无选择标记转基因植物研究进展

在植物基因转移过程中,筛选标记基因常被用于筛选转化细胞或组织,给转基因工作带来很大方便;但在获得转基因植物之后,筛选标记基因的表达往往对环境及植物体的生长发育产生不良影响,且不利于使用相同标记基因进行多重转化。为了消除这些弊端,一种全新的发展策略即获得无选择标记转基因植物应运而生。文章主要综述获得无选择标记转基因植物的方法。     

转Wx-cDNA基因水稻无抗性选择标记植株的筛选

本试验以直链淀粉含量不同的粳稻品种武香9915和糯稻品种苏御糯、广陵香糯为受体材料,运用根癌农杆菌介导的双载体共转化技术分别将含有潮霉素抗性(HPT)选择标记基因和Wx-cDNA的2个T-DNA区序列导入上述受体中,获得了大量转基因水稻植株。对转基因水稻植株进行PCR检测,结果表明:目的基因和潮霉素抗性选择标记基因可以共整合到细胞中,并可以在后代中发生分离,从而可以筛选出仅含有目的基因而不含选择标记基因的转基因植株。     

植物无选择标记转基因技术的研究进展

在植物基因转移过程中,标记基因常被用于筛选转化细胞或组织,给转基因工作带来很大方便.但在获得转基因植物之后,筛选标记基因的表达往往对环境及植物体的生长发育产生不良影响,且不利于使用相同标记基因进行多重转化.因此,使转基因植物释放后不带选择标记基因,对从事转基因的工作人员及消费者来说都是极为重要的.本文在对几种去除标记基因的方法进行总结的基础上,对该技术未来的发展趋势进行了展望.     

转基因植物及其安全性研究进展

介绍了目前常用的植物转基因方法,并简要就转基因植物的生态安全性、35S启动子安全性、载体骨架序列安全性、抗生素抗性标记基因安全性和食品安全性五个方面进行了综述.     

利用CRISPR/Cas9技术敲除转基因水稻中的潮霉素标记基因

【目的】在植物转基因研究中,使用选择标记基因(Selectable Marker Gene, SMG)使得转化子的筛选更准确便利,但存在SMG的转基因植株可能对人类健康及生态环境造成潜在危害,这也限制了转基因植物商业化的应用前景。因此去除转基因植物中的SMG十分必要。【方法】本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,针对水稻转基因中常用的SMG潮霉素抗性基因(hygromycin phosphotransferase II,hptII)设计构建了编辑载体,利用农杆菌(LBA4404)介导的遗传转化方法转化水稻日本晴,得到转化植株,再将转化植株与带有hptII基因的植株进行杂交。【结果】通过遗传转化及分子鉴定,本研究得到了18株可用于编辑hptII基因的转化植株,进一步对转化植株与带有hptII基因的植株杂交的F_1代进行检测,经PCR检测及测序验证表明,在杂交F_1代植株中,hptII基因的DNA确有编辑发生,包括碱基缺失、替换以及插入等,使得hptII基因不能成功转录。【结论】利用CRISPR/Cas9技术,成功获得了删除hptII基因的转基因水稻。这为植物转基因研究实现无选择标记基因(marker-free)奠定了基础。     

双T-DNA反式串联植物表达载体构建与验证

通过对双T-DNA串联结构的改变,构建2个双T-DNA反式串联的植物表达载体p1300-DMAR-LF-GCMSAGS和p1300-DMAR-LF-GLCMSAGS。经过转化水稻后验证,结果表明:能够获得无选择标记基因的转基因植株;与顺式串联植物表达载体比较,反式串联的植物表达载体成功地将非连锁共整合的频率分别由47.37%和45.83%提高到了55.81%和51.28%,提高无选择标记基因转基因植株的筛选效率。     

转基因植物中的标记基因

随着转基因植物的商业化 ,植物转基技术将为农业生产带来一场新的革命。但目前仅仅把基因导入植物已经不能满足现代农业的要求。新的转化技术不仅要求把基因导入农艺性状优良的品种中 ,呈单拷贝 ,不带辅助序列 (标记基因 ) ,而且转基因的表达必需可预测 ,并在不同的转化体中表达一致。论文讨论标记基因及与标记基因消除的转化体系有关的问题     

OsRhoGDI2过表达转基因水稻的筛选鉴定及外源基因拷贝数的初步分析

水稻Rho GDP解离抑制基因OsRhoGDI2是从幼穗中分离出的功能未知基因。为鉴定该基因的功能,笔者所在实验室前期构建了植物过表达载体pCAMBIA1302-OsRhoGDI2-GFP,并对水稻进行了遗传转化。对OsRhoGDI2过表达转基因水稻T_2代进行筛选和鉴定,采用PCR技术鉴定转基因植株,采用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR检测OsRhoGDI2在转基因水稻中的表达水平,结果显示,其中6个株系为过表达转基因植株,OsRhoGDI2表达水平上调1.69～13.35倍。为检测外源基因在转基因水稻中的拷贝数,分别以蔗糖磷酸合成酶基因SPS和潮霉素抗性基因HYG为内参基因和标记基因,采用实时荧光定量PCR(qPCR)技术结合内参基因和标记基因的标准曲线进行分析,结果显示在所检测的6个转基因株系中,外源基因的拷贝数均为1,提示已经获得稳定遗传的OsRhoGDI2过表达转基因水稻,为后续OsRhoGDI2基因的功能研究奠定基础。     

无选择标记的植物转基因方法研究技术进展

植物遗传转化中,标记基因起着非常重要的作用。目前使用的抗性标记基因大多数是抗生素或除草剂抗性基因,其引发的转基因植物安全性问题越来越受重视。笔者综述了近年来发展的各种无选择标记转基因植物方法及其在转基因植物中的应用,主要有共转化法、位点特异性重组系统、转座子系统、同源重组法和多元自主转化载体系统。通过评述各种方法的优缺点,以期推动安全型转基因植物培育和转基因植物产业化进程。     

一种无标记基因植物表达载体的改造方法

利用无标记基因表达载体开展转基因植物研究,是获得无标记基因转基因植物、保证转基因生物安全的手段之一。文章报道了一种无标记基因植物转化载体的改造方法,通过AseⅠ单酶切可去除pCAMBIA1300植物转化载体内潮霉素标记基因完整表达框架。试验应用结果表明,利用此表达载体进行共转化研究,可获得不含标记基因、只含目的基因的转基因植株。此方法可在植物共转化研究中广泛应用。     

Breeding of Selectable Marker-Free Transgenic Rice Lines Containing AP1 Gene with Enhanced Disease Resistance

In order to obtain marker-free transgenic rice with improved disease resistance, the AP1 gene of Capsicum annuum and hygromycin-resistance gene （HPT） were cloned into the two separate T-DNA regions of the binary vector pSB130, respectively, and introduced into the calli derived from the immature seeds of two elite japonica rice varieties, Guangling Xiangjing and Wuxiangjing 9, mediated by Agrobacterium-mediated transformation. Many cotransgenic rice lines containing both the AP1 gene and the marker gene were regenerated and the integration of both transgenes in the transgenic rice plants was confirmed by either PCR or Southern blotting technique. Several selectable marker-free transgenic rice plants were subsequently obtained from the progeny of the cotransformants, and confirmed by both PCR and Southern blotting analysis. These transgenic rice lines were tested in the field and their resistance to disease was carefully investigated, the results showed that after inoculation the resistance to either bacterial blight or sheath blight of the selected transgenic lines was improved when compared with those of wild type.     

无选择标记的甜瓜a-ACO1基因植物表达载体的构建及对烟草的共转化效果

从植物表达载体pCB-aACO1的T-DNA区段上切去nptⅡ基因,构建了无选择标记植物表达载体pCD-aACO1,其T-DNA区段只含有目的基因a-ACO1和GUS基因.从另一植物表达载体pCAMBIA2301的T-DNA区段切去GUS基因,构建了植物表达载体pCAMBIA2302,其T-DNA区段其只含有nptⅡ基因.用这2种新载体共转化烟草,在对40株抗性转基因烟草的PCR检测中,有14株扩增出a-ACO1基因,共转化率为35%.     

无抗性选择标记转AP1基因抗病水稻新品系的选育

 为获得无任何抗生素抗性基因的抗病转基因水稻新品系，将克隆自甜椒的两亲性蛋白AP1基因与潮霉素抗性选择标记基因（HPT）分别构建位于同一农杆菌双元载体上的两个独立的T-DNA区中，并经农杆菌介导，将其导入江苏省推广的两个粳稻品种广陵香粳和武香粳9号中，获得了一批转基因水稻植株。PCR和Southern杂交分析表明，AP1基因和HPT基因已同时导入受体基因组中，并从共转化植株的自交后代中筛选到了无HPT基因的转AP1基因水稻植株。结合田间农艺性状考察，选育了多个无抗性选择标记基因的纯合转AP1基因水稻新品系；抗病性鉴定结果表明，转AP1基因水稻对稻白叶枯病的抗性与未转化对照相比有显著提高，部分转基因水稻对纹枯病的抗性与未转化对照相比也有一定程度的提高。     

水稻规模化转基因技术体系构建与应用

水稻作为重要的粮食作物和遗传转化的模式植物,其遗传转化一直受到广泛重视。自世界首例转基因水稻于1988年获得成功以来,水稻遗传转化技术体系迅猛发展,尤其是1994年首次通过农杆菌介导实现对粳稻的高频转化,经过近20年的发展,水稻遗传转化技术体系已经比较完善。目前,应用于水稻中的转基因技术主要包括基因枪介导法和农杆菌介导法,一些实验室也采用花粉管通道法、电击法、PEG转化法等。其中,农杆菌介导的转基因方法以其低成本、易操作、转化效率高、单位点插入比例高、后代表达稳定等特点已经成为水稻转化的主流方法,约占水稻转基因报道总数的80%以上。虽然国内外刊物时有转基因方法改进的报道,但是由于种种原因,水稻的转化还受一些因素的限制,例如部分粳稻品种和籼稻受基因型的限制十分明显,转基因效率普遍较低,严重制约了转基因技术在水稻生产中的应用;某些转基因程序过于繁琐,耗时长,成本高,不但导致效率低,而且长时间的组织培养诱发逆转座子转座引起无性系变异干扰了功能研究和育种工作。因此,迫切需要建立高效、安全、规模化和标准化的水稻转基因技术体系。文章综述了国内外水稻转化技术的发展历程,重点回顾了近5年中国水稻规模化转基因技术研究进展,包括围绕不同水稻基因型高效转化体系优化及建立,对影响农杆菌转化效率及植株分化频率等诸多因素如水稻基因型、外植体类型、农杆菌菌株和质粒载体、培养基组分、共培养时间、侵染方式等方面的研究和探索。整合国内外已有研究结果进行技术集成创新,分别以粳稻和籼稻成熟胚、幼胚为外植体,采用农杆菌转化方法,通过优化受体材料和愈伤状态、农杆菌侵染浓度和分化温湿度、工艺流程标准化等多种组分,突破了成熟胚分化难的技术瓶颈,整合了无选择标记等安全转基因技术,实现了粳稻和部分籼稻转化技术的标准化和工厂化,初步建立了安全、高效、规模化水稻转基因技术体系。但与国际先进水平相比,尤其与一些跨国生物技术公司相比,在转化规模和转化效率方面仍然存在较大差距。认为安全、高效、规模化是转基因水稻新品种培育和产业化的重大技术瓶颈。建立水稻主栽品种快速、高效、稳定的转化系统,开发安全型转化技术,开展多基因、大片段基因转化,实现转基因的定点整合和时空控制表达等是水稻转基因技术的发展趋势,针对水稻规模化转基因技术体系存在的问题,提出了相应的对策,对于促进转基因水稻新品种培育和功能基因组学研究具有一定参考价值。     

转叶绿体超氧化物歧化酶基因水稻的获得

[目的]研究转叶绿体超氧化物歧化酶（SOD）基因水稻的获得。[方法]在构建叶绿体超氧化物歧化酶基因转化载体的基础上,采用农杆菌侵染法,使用C418作为筛选剂,经筛选和分化获得转基因植株,并对其进行PCR检测。[结果]确定G418的最佳浓度为200mg／L,采用尽可能短的筛选时间获得了好的转化效果,最终获得237株再生苗;经PCR检测,65株呈阳性,转化率为27％。[结论]确定了G418的筛选效果,为其进一步应用提供科学依据。     

以DsRed2基因为可视标记的双T-DNA共转化载体的构建

本研究构建了以红色荧光蛋白基因DsRed2作为可视标记的双T-DNA共转化载体PCDMAR-DsRed2-hpt.该载体含有2个独立的T-DNA结构区,其中一个T-DNA区同时含有选择标记基因hpt和红色荧光蛋白基因DsRed2;另一个T-DNA区含有一个通用的多克隆位点,可任意插入目的基因,在多克隆位点两端含有两段顺式重复的烟草Rb7MARs,用来增强目的基因的稳定表达.此载体可用于高效培育无选择标记的转基因植物.     

利用CRISPR/Cas9技术编辑水稻香味基因Badh2

【目的】稻米香味是水稻品质改良的一个重要内容,其性状主要受1个隐性基因Badh2的控制。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将常规品种中的Badh2进行编辑,从而获得Badh2发生突变的基因编辑株系,使香味性状得到改良。【方法】利用CRISPR/Cas9基因编辑的原理,在水稻Badh2的第2和第7外显子处设计靶点,通过BLAST分析确定其特异性并构建到CRISPR/Cas9表达载体。以浙江省主要推广的水稻品种嘉58和秀水134的愈伤组织为受体,利用农杆菌介导的遗传转化法,通过潮霉素抗性筛选获得阳性转基因植株。转基因株系经测序明确其在Badh2的突变类型,经PCR分析与鉴定获得Badh2发生突变并无转基因标记成分的稳定株系。利用气相色谱质谱联用仪（GC-MS）检测基因编辑株系糙米米粉中2-AP的含量,明确其香味成分与非转基因对照之间的差异。【结果】在水稻第2和第7外显子处设计靶点构建表达载体,通过遗传转化转基因株系的Badh2完成了定向突变。共获得T₀代嘉58基因编辑的株系15株,在第2外显子处发生突变的有8株5种不同的突变类型,均为不同单碱基插入不同位点;在第7外显子处发生突变的有7株5种不同的突变方式,均为碱基或片段缺失。获得秀水134基因编辑的株系11株,在第2外显子处共有5株,均为单碱基插入;在第7外显子处有6株,均为片段缺失。48株T₁代秀水134基因编辑株系中,共获得16株无转基因标记的基因编辑株系,其中5株在第2外显子发生突变,11株在第7外显子处发生突变。4个T₂代基因编辑株系的米粉中2-AP平均含量分别为0.309、0.347、0.332和0.295 μg·g ^-1,极显著（P<0.01）高于非转基因对照（0.046 μg·g ^-1）。【结论】利用CRISPR-Cas9技术可对水稻香味基因Badh2进行定向编辑,并且可获得无转基因成分的基因编辑株系,其香味性状得到明显改良。     

Genetic and agronomic traits stability of marker-free transgenic wheat plants generated from Agrobacterium-mediated co-transformation in T_2 and T_3 generations

Genetically modified wheat has not been commercially utilized in agriculture largely due to regulatory hurdles associated with traditional transformation methods. Development of marker-free transgenic wheat plants will help to facilitate biosafety evaluation and the eventual environmental release of transgenic wheat varieties. In this study, the marker-free transgenic wheat plants previously obtained by Agrobacterium-mediated co-transformation of double T-DNAs vector were identified by fluorescence in situ hybridization(FISH) in the T_1 generation, and their genetic stability and agronomic traits were analyzed in T_2 and T_3 generations. FISH analysis indicated that the transgene often integrated into a position at the distal region of wheat chromosomes. Furthermore, we show that the GUS transgene was stably inherited in the marker-free transgenic plants in T_1 to T_3 generations. No significant differences in agronomic traits or grain characteristics were observed in T_3 generation, with the exception of a small variation in spike length and grains per spike in a few lines. The selection marker of bar gene was not found in the transgenic plants through T_1 to T_3 generations. The results from this investigation lay a solid foundation for the potential application of the marker-free transgenic wheat plants achieved through the co-transformation of double T-DNAs vector by Agrobacterium in agriculture after biosafty evaluation.