微小隐孢子虫TSP3蛋白质的表达与功能

通过对微小隐孢子虫TSP3基因克隆构建原核表达载体,纯化TSP3 His-tag重组蛋白质免疫新西兰家兔,间接ELISA方法检测特异性血清效价并纯化多克隆抗体。纯化TSP3 GST-tag重组蛋白质并与HCT-8细胞进行共孵育,通过Western blot与间接ELISA检测细胞黏附特性。结果表明:成功构建了微小隐孢子虫p ET-TSP3和p GEX-TSP3重组表达质粒,并用亲和层析法成功纯化出较高质量的重组蛋白质。Cp TSP3重组蛋白质具有良好免疫原性,并能与HCT-8细胞黏附。     

微小隐孢子虫核酸疫苗的研究

将编码C.parvum子孢子15kD CP15表面蛋白基因插入真核表达载体pCR.31( ）建重组质粒pCR3.1-15，然后经鼻粘膜免疫怀孕成年山羊，观察其免疫应答的产生情况及其对后代的保护力。结果表明：抗CP15抗体存在于免疫山羊的血浆和初乳中。pCR3.1-15经鼻腔免疫的怀孕山羊产生的免疫力能传给子代，使子代对C.parvum感染产生保护。CP15－DNA免疫母羊的后代比非免疫母羊的后代排出卵囊少，且排卵时间短。     

微小隐孢子虫Cp735基因的克隆及原核表达

采用PCR方法从微小隐孢子虫基因组中扩增cp735基因.与pMD- 18T载体连接后,挑取阳性重组子测序分析.用基因重组技术将Cp735基因克隆入原核表达载体pET-28a中,构建Cp735基因的重组原核表达载体pET28a-Cp735.将pET28a-Cp735在大肠杆菌BL21 (DE3)中诱导表达,并用SDS- ...     

微小隐孢子虫重组蛋白CP21的免疫特性

采用微小隐孢子虫CP21基因的原核表达蛋白的抗血清对微小隐孢子虫感染HCT-8细胞进行了体外阻断试验,检测不同浓度抗血清对HCT-8细胞感染隐孢子虫感染率的影响.同时应用纯化的重组CP21蛋白对小鼠进行免疫,检测体液免疫水平和细胞免疫水平的变化.对免疫后的小鼠接种微小隐孢子虫,检测重组CP21蛋白对微小隐孢子虫感染的保...     

微小隐孢子虫cDNA文库的构建与免疫学筛选

【目的】构建微小隐孢子虫cDNA文库,以筛选出可替代天然抗原用于诊断的重组抗原。【方法】首先纯化微小隐孢子虫卵囊,用Trizol Reagent提取总RNA,构建全长cDNA;分别用蛋白酶K与Sfi消化、酶切处理cDNA,采用Column Spin H-1000分离柱分离cDNA,连接λTriplEx2载体,构建cDNA文库。扩增cDNA文库,用兔抗微小隐孢子虫血清作探针对cDNA文库进行初筛和复筛,将复筛得到的阳性克隆连接PMD18-T载体,测序后进行序列比对。【结果】微小隐孢子虫cDNA文库噬菌斑插入片段长度为1.5kb左右,库容大于107。经过筛选共获得了20个微小隐孢子虫阳性克隆,测序后从中选出了4个主要免疫识别抗原蛋白,分别为MUCIN蛋白、乳酸脱氢酶、微管相关蛋白和子孢子抗原蛋白。【结论】成功构建了微小隐孢子虫cDNA文库,并筛选出了4个主要免疫识别抗原蛋白,为隐孢子虫的血清学诊断提供了重组抗原。     

微小隐孢子虫子孢子表面蛋白CP15/60编码基因核酸疫苗的研究

 将编码CP15 / 6 0的基因插入真核表达载体pcDNA3(+)中构建重组质粒pcDNA3 15 / 6 0 ,然后经鼻粘膜免疫怀孕成年山羊 ,观察其免疫应答的产生情况及其对后代的保护力。结果为抗CP15 / 6 0抗体存在于免疫山羊的血浆和初乳中。pcDNA3 15 / 6 0经鼻粘膜免疫的怀孕山羊产生的免疫力能传给子代 ,使子代对微小隐孢子虫 (Cryp tosporidiumparvum)感染产生保护。CP15 / 6 0 DNA免疫母羊的后代比非免疫母羊的后代排出卵囊少且排卵时间短。这就表明重组质粒pcDNA3 15 / 6 0可作为隐孢子虫候选核酸疫苗     

牛微小隐孢子虫子孢子表面抗原p23基因的克隆及原核表达

从已构建的牛微小隐孢子虫子孢子cDNA文库中,用PCR方法扩增出子孢子表面抗原p23基因,将其插入到编码谷胱肽转移酶(GST)的质粒(pGEX-4T-2)多克隆位点,构建原核表达载体pGEX-p23。重组质粒经EcoRI/Sal I酶切、测序鉴定后转入大肠杆菌BL21中,IPTG诱导表达目的蛋白,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达蛋白。结果成功构建了pGEX-p23原核表达载体,经IPTG诱导,转化的大肠杆菌表达出分子质量为47kDa的GST融合蛋白,且该蛋白能与抗p23抗体发生特异性结合反应。本研究为进一步研究p23的生物学功能和临床应用奠定了基础。     

利用间接荧光抗体技术对微小隐孢子虫Cp16蛋白进行抗原定位

Cp16基因是从核糖体展示文库中筛选的微小隐孢子黏附相关基因,为了确定Cp16蛋白是否是微小隐孢子虫卵囊或子孢子表面抗原,构建了Pet-28 a-Cp16原核表达载体,将其转化至BL21大肠杆菌中进行诱导表达,经纯化获得重组蛋白Cp16。将纯化的重组蛋白免疫BAILB/c小鼠,ELISA方法测定IgG抗体滴度。利用间接荧光抗体技术进行抗原定位的初步研究。结果表明:隐孢子虫卵囊表面及子孢子表面富含Cp16蛋白。     

不同Ⅱd亚型微小隐孢子虫对BALB/c小鼠的感染性

为比较微小隐孢子虫不同亚型对小鼠的感染性,分别从河南和宁夏的犊牛体内获得两株微小隐孢子虫,利用分子方法进行基因亚型鉴定后,分别感染提前免疫抑制的3~6周的BALB/c小鼠,对感染前后小鼠粪样进行显微观察和PCR检测。结果显示,2个微小隐孢子虫分离株的亚型分别为ⅡdA19G1和ⅡdA15G2R1;2个亚型均可感染BALB/c小鼠,其中ⅡdA15G2R1感染小鼠后2d和3d可在显微镜下观察到卵囊,而感染ⅡdA19G1的小鼠在任何时间均未在显微镜下观察到卵囊;PCR检测发现2个亚型的小鼠排卵囊周期分别为18d和20d。该研究结果为微小隐孢子虫感染小鼠模型的建立提供一定理论依据。     

微小隐孢子虫子孢子表面蛋白CPl5／60编码基因核酸疫苗的研究

将编码CPl5／60的基因插入真核表达载体pcDNA3( )中构建重组质粒pcDNA3-15／60，然后经鼻粘膜免疫怀孕成年山羊，观察其免疫应答的产生情况及其对后代的保护力。结果为抗CPl5／60抗体存在于免疫山羊的血浆和初乳中。pcDNA3-15／60经鼻粘膜免疫的怀孕山羊产生的免疫力能传给子代，使子代对微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)感染产生保护。CPl5／60-DNA免疫母羊的后代比非免疫母羊的后代排出卵囊少且排卵时间短。这就表明重组质粒pcDNA3-15／60可作为隐孢子虫候选核酸疫苗。     

Vaccination with pcDNA3-15/60 Naked DNA Encoding the Surface Protein of Sporozoites in Cryptosporidium parvum

The CP15/60 gene encoding the CP15/60 surface protein of sporozoites in Cryptosporidium parvum was obtained by PCR so as to research the nucleic vaccine against C.parvum. The eukaryotic expressing vector pcDNA3-15/60 was constructed by inserting CP15/60 gene into pcDNA3 (+) in Xho Ⅰ and EcoR Ⅰ. A vaccination protocol was the adult pregnant goats inoculated intranasally with the pcDNA3-15/60 plasmid and their offspring were infected with C.parvum oocysts. The results showed that the pcDNA3-15/60 plasmid can induce the immune response of goats and the vaccinated goats can transfer the immunity to offspring conferring protection against C.parvum infection. These suggested that the recombinant plasmid could be a DNA vaccine candidate.     

间接ELISA法检测贝氏隐孢子虫特异性IgY抗体的研究

应用蔗糖密度梯度离心法纯化贝氏隐孢子虫卵囊,冰浴超声波破碎、反复冻融卵囊,低温离心获得贝氏隐孢子虫卵囊蛋白质抗原.免疫产蛋鸡,6次免疫后获得高免特异性卵黄抗体IgY.制备辣根过氧化物酶(HRP)标记免抗鸡IgG,其最佳工作浓度为1:4 000～1:6 000,贝氏隐孢子虫卵囊抗原包被浓度8.15 mg·L-1,4℃包被过夜(≥10 h);1×106mg·L-1 BSA-PBST稀释卵黄,建立了检测抗贝氏隐孢子虫特异性卵黄抗体的间接ELISA方法.     

应用巢式PCR-RFLP方法鉴别我国常见的几种隐孢子虫

应用巢式聚合酶链反应(Nested PcR)-限制片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism,RFLP)方法对微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)、安氏隐孢子虫(C.andersoni)、贝氏隐孢子虫(C.baileyi)和猪隐孢子虫(C.s...