猪链球菌2型溶血素基因的检测

根据GenBank发表的猪链球菌2型(SS2)溶血素基因(sly)全序列,利用O ligo(7.0)软件设计并合成了可扩增长度为495 bp的引物,从SS2参考菌株ATCC43765和SS2江苏分离株HA9801中扩增出495 bp的条带,利用HindⅢ限制性内切酶对具有相应单一酶切位点的PCR扩增产物进行酶切,获得预期的314 bp和181 bp的2个DNA片段,检测灵敏度达到2.5×102CFU.mL-1;但不能从马链球菌兽疫亚种ATCC35246、大肠埃希氏菌ATCC25922、单增李斯特杆菌ATCC19115/413、金黄色葡萄球菌ATCC25923、粪肠球菌ATCC29212中扩增出相应的条带。PCR扩增产物的测序结果与GenBank的猪链球菌sly基因(Z36907)核苷酸序列完全一致。该方法可快速、敏感、特异地检测SS2的溶血素基因。     

猪链球菌2型溶血素融合蛋白的制备及免疫活性测定

[目的]研究四川资阳脑膜炎病例猪链球菌2型分离株ZYH33溶血素（suliysin,sly）基因的克隆表达及融合蛋白生物活性分析。[方法]从sly中获取第230~593氨基酸残基区域的基因片段,克隆至pMD18-T载体并鉴定,以重组pMD18-T/sly为模板PCR扩增基因片段,与表达载体pQE-30连接,转化至大肠杆菌TG1,重组子经PCR、酶切、测序鉴定。IPTG诱导重组蛋白表达,Western blot法鉴定融合蛋白的抗原性。[结果]基因片段在大肠杆菌中得到了表达,表达的融合蛋白可被猪链球菌2型菌体ZY05719抗血清识别,具有抗原性。[结论]所克隆、表达的溶血素区域可作为猪链球菌的诊断抗原,为基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

猪链球菌2型溶血素基因PCR快速检测方法研究

根据猪链球菌2型的溶血素(haemolysin)的基因序列设计一对引物,成功地扩增了溶血素基因,并建立了检测溶血素的PCR方法.用EcoRⅠ限制性内切酶进行酶切,获得了与预期大小一致的869 bp和633 bp的两个片段.同时另设计一对内引物,进行巢式PCR,亦能扩增出预期片段.PCR检测的敏感程度可达100个细菌;对马链球菌兽疫亚种、猪丹毒杆菌和猪放线杆菌等的PCR检测结果均呈阴性.表明建立的猪链球菌2型溶血素PCR检测方法,其特异性和敏感性均很高,可作为猪链球菌病快速诊断的方法.     

毛蕊花糖苷抑制2型猪链球菌的溶血素蛋白活性而降低其小鼠致病性

为了探究天然化合物毛蕊花糖苷(verbascoside, VBS)对2型猪链球菌(Streptococcus suis serotype 2, SS2)致病性的作用,本研究通过测定最低抑菌浓度、绘制细菌生长曲线及红细胞溶血试验,发现低浓度下的毛蕊花糖苷不影响猪链球菌的正常生长,但对其溶血活性有显著抑制作用;免疫印迹试验表明,毛蕊花糖苷不影响2型猪链球菌分泌溶血素蛋白(suilysin, SLY);通过分子对接预测毛蕊花糖苷可与SLY的2个氨基酸残基(SER-388、GLN-441)形成3条氢键结合从而使毛蕊花糖苷嵌入SLY蛋白的第4结构域,同时体外溶血活性试验进一步证实毛蕊花糖苷可直接抑制SLY介导的溶血活性;最后,小鼠体内试验结果表明,毛蕊花糖苷可明显提高2型猪链球菌感染小鼠的存活率。综上,毛蕊花糖苷在不影响2型猪链球菌生长活性的情况下,可通过抑制溶血素活性来降低2型猪链球菌对小鼠的致病性。     

猪链球菌2型溶血毒素的产生条件及其特性分析

猪链球菌２型江苏分离株ＨＡ９８０１产生一种溶血毒素,培养条件影响其产量。最佳培养条件为Ｔｏｄｄ－Ｈｅｗｉｔｔ肉汤（ｐＨ７．５）中接种Ｖ（种子液）：Ｖ（肉汤）＝１：１００的种液,３７℃静置培养１２ｈ。培养基中的胰蛋白的胨对该溶血素的产生起决定性作用。该溶血素可被还原剂活化,被氧化剂和胆固醇及蛋白酶Ｋ抑制,亦被抗链球菌溶血素Ｏ阳性血清和抗猪链球菌２型全菌阳性血清抑制。该溶血素在－２０℃较稳定,在４,２     

定点突变阻止金黄色葡萄球菌α-溶血素溶血活性

金黄色葡萄球菌分泌的α-溶血素是导致肺炎的重要致病因子。为进一步研究金黄色葡萄球菌α-溶血素(α-hla)的分子致病机理以及对其进行免疫预防,对α-hla第35位氨基酸进行了定点突变。用聚合酶链式反应(PCR)技术,从S.aureus wood46株基因组中扩增出α-hla基因,再利用重叠延伸PCR技术,将第35位带正电荷的组氨酸(密码子为CAC)突变为非极性的亮氨酸(密码子为CTC)。hlaH35L基因测序结果显示第35位的组氨酸突变为亮氨酸,构建的重组表达质粒pET-28a-c(+)/hla和pET-28a-c(+)/hlaH35L在E.coli BL21(DE3)中得到表达,重组蛋白α-Hla及hlaH35L大小均为33.4 kDa,α-Hla引起兔红细胞溶血,hlaH35L未引起兔红细胞溶血。成功表达并获得了失去溶血毒性的重组蛋白hlaH35L。     

细菌溶血素的分类及代表性溶血素研究进展

 【研究目的】溶血素作为细菌致病的重要毒力因子,在动物细菌性疾病的发病过程中起着不容轻视的作用。但是,目前国内尚未见到关于细菌溶血素的系统介绍。另外,细菌溶血素的英文命名并不统一,检索时容易造成漏检或误检;【方法】通过查阅大量英文文献资料,归纳汇总近20年报道的溶血素研究进程;【结果】该文详细列出了细菌溶血素名称、分类以及各溶血素家族列表。并且分别介绍了其中三种典型的穿孔毒素：葡萄球菌α-毒素、链球菌溶血素-O（胆固醇结合家族代表）、埃希氏大肠杆菌溶血素HlyA (RTX家族成员代表)。【结论】最近十几年,溶血素的家族成员、分子结构、分类、作用机理日趋明朗。这无疑是寻找代替抗生素治疗细菌性疾病方法的一条新路。     

日本沼虾血清溶血素的活性研究

[目的]为深入了解虾类的免疫机制提供科学依据和基础材料。[方法]以日本沼虾为材料,利用溶血试验和糖抑制试验测定其血清溶血素的溶血活性和糖抑制性,分析外界因子对其活性的影响。[结果]日本沼虾血清溶血素对鱼和鸡血细胞的敏感性较高。D-葡萄糖对日本沼虾血清溶血素有促进作用,而D-甘露糖、D-山梨糖、α-乳糖、L-鼠李糖,D-阿拉伯糖则有抑制作用。在50～60℃条件下溶血素的溶血作用较强,70℃及以上血清发生变性,无溶血活性。该溶血素pH作用范围广,在pH 2～12内对鸡血细胞都有溶血作用,其中pH 6～9溶血效果较好。最适盐度范围为3～5。溶血素对金属离子Cu2+敏感,其活性被完全抑制。敌百虫和乙酰甲胺磷可影响溶血素活性。葎草、生姜黄酮和葎草、桑叶多糖可增强日本沼虾血清的溶血活性。[结论]日本沼虾血清溶血素活性可随环境条件的影响而变化,具有一定的稳定性,是虾类免疫反应的重要组成部分。     

国内病猪中猪链球菌2型分离株溶血素基因的PCR检测及序列分析

以探明猪链球菌2型(SS2)国内病猪分离株的溶血素基因(sly)的分布情况及其序列为目的.通过聚合酶链反应(PCR)方法检测29株不同年代、不同地区SS2国内分离株的sly,并将其中的5株(SS2-1、HA9801、HA0507、JR0507和ZY05719)sly 进行克隆及序列分析.结果显示:29株菌都有sly,其中5株菌的sly的ORF的碱基数目都为1 494 bp、编码497个氨基酸,核苷酸序列的同源性为99.7%～100.O%,所推导的蛋白质序列的同源性为99.8%～100.O%,其中SS2-1、HA9801、HA0507、JR0507与国外参考株P1/7的序列完全一致.表明中国猪链球菌2型病猪分离株普遍具有sly,且基因序列极为保守.     

牛角地黄汤对α-溶血素诱导红细胞溶血的抑制作用研究

[目的]牛角地黄汤是中国传统医学中用于清热解毒凉血化瘀的基础方剂,由水牛角、地黄、赤芍、丹皮、钩藤等主要成分组成。本研究旨在研究分析牛角地黄汤及方剂中主要成分对金黄色葡萄球菌α-溶血素诱导兔红细胞溶血作用的影响。[方法]将牛角地黄汤水煎剂及其各单味中药的水煎剂分别与金黄色葡萄球菌溶血毒素作用不同时间后检测溶血活性。[结果]研究发现,无论与溶血素同时给药或是在溶血素染毒之前给药,亦或是与溶血素预先单独作用一段时间后再给药,牛角地黄汤煎剂均能抑制α-溶血素致兔红细胞破裂的溶血作用。同时还发现,方剂中的赤芍和丹皮水煎液对溶血素破坏兔红细胞致溶血的活性抑制作用最为明显,是牛角地黄汤中起主要抗溶血作用的中药组分。而牛角和地黄的水煎液在各试验条件下均未表现出抑制溶血素溶血的作用。[结论]本研究表明,牛角地黄汤具有显著的对抗溶血素诱导红细胞溶血的作用,方中起主要作用的成分是赤芍和丹皮,钩藤的这种作用则比较弱,而牛角和地黄则不是牛角地黄汤中抗溶血作用的主要成分。     

50种中草药提取物对猪链球菌的体外抑菌试验

对猪链球菌临床分离耐药株分别进行纸片扩散法和微量稀释法检测,通过对抗菌效果的比较,筛选出对耐药菌抗菌活性好的中草药,测定50种中草药的水提物和75%乙醇提取物对5株猪链球菌临床分离耐药株的体外抗菌活性。试验结果表明,50种中草药中,只有中药1和中药2的提取物对猪链球菌临床分离耐药株有较好的抑制作用,其他中草药对猪链球菌临床分离耐药株均无抑制作用。结果表明,中药1和中药2的75%乙醇提取物比水提取物抗菌活性强。     

猪链球菌2型c-di-AMP水解蛋白基因gdpP的表达与活性分析

为研究猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2,SS2)环二腺苷酸(c-di-AMP)水解蛋白GdpP的生化特性,根据已公布的SS2中国强致病株98HAH33全基因组中的gdpP序列信息设计引物,以SS2强致病株HA9801基因组为模板,通过PCR方法克隆获得了SS2的c-di-AMP水解蛋白基因gdpP完整序列,其阅读框由1 965个核苷酸组成,编码654个氨基酸。应用大肠杆菌重组表达系统,表达、纯化了GdpP,进而分析了其体外生物活性,结果显示纯化的重组蛋白可以在体外水解c-di-AMP形成pApA。其水解酶活性在碱性环境条件下(pH 8.0)相对较强,而在酸性环境下(pH 6.0,6.5)未检测到活性;同时,水解酶活性还依赖于二价金属离子Mg2+、Mn2+以及Co2+的存在,且在Mn2+存在的条件下相对活性最强,而在Ca2+、Fe2+和Cu2+存在的条件下则均未表现出活性。上述结果为进一步深入研究c-di-AMP在猪链球菌2型中发挥的生物学功能奠定了基础。     

猪链球菌二氢硫辛酰胺脱氢酶的原核表达及其粘附相关功能初探

目的:克隆、表达猪链球菌2型菌株ZY05719的膜蛋白二氢硫辛酰胺脱氢酶基因(hm6),分析其重组蛋白的生物学活性。方法:基于GenBank中S.suis P1/7SSU1634蛋白的基因序列设计引物,克隆ZY05719株的二氢硫辛酰胺脱氢酶基因并进行序列分析;构建pET28a-hm6原核表达质粒,在大肠杆菌BL21中诱导表达,重组HM6蛋白即二氢硫辛酰胺脱氢酶用His亲和层析镍柱纯化后,通过SDS蛋白电泳鉴定分析并利用新西兰大白兔制备抗血清,研究其酶活性及其在介导猪链球菌粘附HEp-2细胞中的作用。结果:克隆了1 761bp的二氢硫辛酰胺脱氢酶基因,纯化的70kD重组融合蛋白具有良好的酶活性和免疫原性,且在介导猪链球菌粘附HEp-2细胞中具有作用。结论:成功克隆、表达了ZY05719株的二氢硫辛酰胺脱氢酶基因,初步揭示了其生物学活性,为深入研究二氢硫辛酰胺脱氢酶在猪链球菌致病机制中的作用奠定了基础。     

猪链球菌国内分离株毒力因子的分布特征

为了研究国内致病性猪链球菌(Streptococcus suis,SS)的毒力因子分布特征,本试验选取猪链球菌7种主要毒力因子—谷氨酸脱氢酶(gdh)、荚膜多糖(cps2J)、溶菌酶释放蛋白(mrp)、胞外因子(epf)、溶血素(sly)、纤连蛋白/血纤蛋白原结合蛋白(fpbs)和毒力相关序列orf2,设计并合成7对引物,用PCR方法进行检测。结果显示:25株猪链球菌2型(SS2)国内分离株,96%(24/25)表现为cps /gdh /epf /mrp /sly /fbps /orf2 ,仅1株表现为cps /gdh /epf-/mrp /sly /fbps /orf2 ;1株猪链球菌1型(SS1),表现为cps-/gdh /epf-/mrp-/sly /fbps-/orf2 ;1株猪链球菌7型(SS7)国内分离株,表现为cps-/gdh /epf-/mrp-/sly /fbps-/orf2 ;2株猪链球菌9型(SS9)国内分离株,均表现为cps-/gdh /epf-/mrp-/sly-/fbps-/orf2 ,可见国内SS2的毒力基因分布特征与欧美等国家明显不同,提示我国目前SS2的主要流行菌株是同时具有7种毒力因子的高致病菌株。     

上海部分地区猪链球菌2型的流行病学调查及其耐药性

猪链球菌2型是一种重要的人兽共患病病原,由其引起的猪链球菌病给养猪业带来巨大的危害。本研究通过PCR方法扩增谷氨酸脱氢酶(GDH)基因和荚膜多糖(CPS)基因检测猪链球菌2型,对上海部分地区猪链球菌2型的流行病学进行调查,并对分离到的菌株进行生化鉴定及耐药性研究。结果显示,上海部分地区猪链球菌的检出率为41.2%(103/250),猪链球菌2型的检出率为12.4%(31/250),猪链球菌2型占猪链球菌的30.1%。猪链球菌2型菌株对四环素、链霉素和氯霉素的耐药性最为严重,多数菌株呈多重耐药性,其中以4重耐药性为主。这为上海地区猪链球菌病的监管提供了依据,并对临床治疗使用抗生素具有参考价值。     

Erythromycin Resistance of Streptococcus suis Isolates In Vivo

In order to study erythromycin resistance of Streptococcus suis under high or low concentration of selective drug pressure, Streptococcus suis strain LN was isolated from a diseased pig in 2005 and showed to be susceptible to erythromycin as determined by disc diffusion and tube dilution tests. In this study, clean level rabbits were divided into three groups of six rabbits each, including a prevention dosage group, a treatment dosage group, and a control group. After injection with S. suis strain LN, erythromycin （20 μg mL^-1） was taken orally in the prevention dosage group, erythromycin （5 mg kg^-1） was injected intramuscularly in the treatment dosage group, and no treatment was given in the control group. S. suis with intermediate resistance to erythromycin was isolated on the 5th day after infection from the prevention dosage group （5th PDG） and on the 7th day after infection from the treatment dosage group （7th TDG）. Both isolates were determined to be the constitutive macrolide-lincosamide-streptogramin B （cMLSB） resistance phenotype. The resistance gene ermB was detected in all of the isolates. The results suggested that both the 5th PDG and 7th TDG isolates had a mutation （A2372T） in the 23S rRNA gene. In addition, the 5th PDG isolates had a mutation in ribosomal protein L4 （detected as G268A） and a mutation in ribosomal protein L22 （A345C）; and the 7th TDG isolates had a C insertion at site 564. Each of these mutations is considered as a possible mechanism of erythromycin resistance in S. suis strain LN. This study demonstrated that erythromycin resistance was readily induced in S. suis at a low erythromycin dose creating selective pressure in vivo. Resistance appeared to be mediated by ribosome methylation, encoded by the ermB gene.