神经生长因子mRNA在鹅等级前卵泡中的表达

采用相对荧光定量PCR(RT-PCR)相对标准曲线方法,对籽鹅和卡洛斯鹅不同产蛋时期初级卵泡、小白卵泡、中白卵泡和大白卵泡中神经生长因子(NGF)mRNA的表达量进行研究,同时检测血液中促卵泡素(FSH)的含量,并与NGFmRNA表达量进行相关性分析。结果表明:产蛋高峰期,籽鹅初级卵泡中NGF mRNA表达量极显著高于其他卵泡(P0.01),卡洛斯鹅初级卵泡中NGF mRNA表达量显著高于中白卵泡(P0.05),其余卵泡间差异不显著。产蛋末期,籽鹅初级卵泡中NGF mRNA表达量极显著高于中白卵泡和小白卵泡(P0.01),大白卵泡NGF mRNA表达量极显著高于中白卵泡(P0.01),卡洛斯鹅初级卵泡NGF mRNA表达量极显著高于中白卵泡和小白卵泡(P0.01),大白卵泡极显著高于其他卵泡(P0.01)。2种鹅产蛋高峰期血液中FSH表达水平高于产蛋末期(P0.05);籽鹅和卡洛斯鹅的小白卵泡NGF mRNA表达量与血液中FSH的表达水平呈显著正相关(P0.05),在大白卵泡中两者呈负相关,其他卵泡呈正相关。     

神经生长因子及其受体在蛋鸡卵巢上的表达

以83日龄性未成熟和230日龄性成熟蛋鸡各5只为试验动物,通过免疫组织化学方法和荧光定量PCR技术研究神经生长因子(NGF)及其受体酪氨酸激酶A(TrkA)和神经营养素受体p75(p75)在蛋鸡卵巢和等级前卵泡上的表达定位及其mRNA表达水平。结果表明:在83日龄性未成熟蛋鸡卵巢上均未发现NGF及其受体TrkA和p75阳性表达细胞,但在230日龄等级前卵泡的膜细胞和颗粒细胞中均发现有其阳性细胞表达。NGF及其受体的mRNA表达水平在230日龄蛋鸡小黄卵泡(SYF)上的表达量显著高于各自在小白卵泡(SWF)和大白卵泡(LWF)上的表达量。此外,230日龄蛋鸡血清中的雌激素和孕激素水平都显著高于83日龄蛋鸡。综上所述,NGF可能在蛋鸡等级卵泡的生长、发育和排卵过程中起一定调节作用。     

利用转录组分析鹅等级前卵泡中脑源性神经生长因子及其受体基因的差异表达

为研究脑源性神经生长因子(brain‐derived neurotrophic factor,BDNF)及其高亲合力受体—酪氨酸蛋白激酶受体基因B(tropomyosin receptor kinase B,Trk B)在鹅等级前卵泡中的表达情况,采用高通量测序技术对鹅等级前卵泡进行转录组测序分析,并采用荧光定量PCR进行结果验证。通过FPKM值计算分析,BDNF及其受体基因在鹅等级前卵泡中均有表达。且随着卵泡的发育,BDNF及其受体基因的表达呈现先增加后降低的趋势,在小白卵泡中的表达量达到最高值,在中白卵泡中的表达量最低。荧光定量PCR结果与转录组测序结果基本相同。证实了在鹅等级前卵泡中BDNF及其受体Trk B对卵泡的发育有促进作用。探明BDNF及其受体Trk B在鹅等级前卵泡中对卵泡的发育调控提供参考数据。     

利用转录组分析鹅等级前卵泡中脑源性神经生长因子及其受体基因的差异表达

为研究脑源性神经生长因子(brain‐derived neurotrophic factor,BDNF)及其高亲合力受体—酪氨酸蛋白激酶受体基因B(tropomyosin receptor kinase B,Trk B)在鹅等级前卵泡中的表达情况,采用高通量测序技术对鹅等级前卵泡进行转录组测序分析,并采用荧光定量PCR进行结果验证。通过FPKM值计算分析,BDNF及其受体基因在鹅等级前卵泡中均有表达。且随着卵泡的发育,BDNF及其受体基因的表达呈现先增加后降低的趋势,在小白卵泡中的表达量达到最高值,在中白卵泡中的表达量最低。荧光定量PCR结果与转录组测序结果基本相同。证实了在鹅等级前卵泡中BDNF及其受体Trk B对卵泡的发育有促进作用。探明BDNF及其受体Trk B在鹅等级前卵泡中对卵泡的发育调控提供参考数据。     

利用转录组测序技术分析ADC和NOS基因mRNA在鹅等级前卵泡中的表达

为研究精氨酸代谢的关键酶精氨酸脱羧酶(Arginine Decarboxylase,ADC)和一氧化氮合酶(Nitric-oxide Synthase,NOS)mRNA在鹅等级前卵泡中的表达情况。采用高通量测序技术对鹅等级前卵泡进行转录组测序分析,并通过荧光定量PCR对结果进行验证。通过FPKM值计算分析,这2个基因在鹅等级前卵泡中均有表达,且随着卵泡的发育,NOS mRNA的表达呈现先降低后增加再降低的趋势,在初级卵泡中的表达量达到最高值,在中白卵泡中的表达量最低。ADC mRNA的表达则呈现先增加后降低再增加的趋势,在初级卵泡中的表达量最低,在小白卵泡中的表达量最高。荧光定量PCR结果与转录组测序结果基本相同。     

利用转录组分析鹅等级前卵泡中脑源性神经营养因子及其受体基因的差异表达

为研究脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)及其高亲合力受体酪氨酸蛋白激酶受体基因B(Tropomyosin receptor kinase B,Trk B)在鹅等级前卵泡中的表达情况,采用高通量测序技术对鹅等级前卵泡进行转录组测序分析,并采用荧光定量PCR进行结果验证。通过FPKM值计算分析,BDNF及其受体基因在鹅等级前卵泡中均有表达,且随着卵泡的发育,BDNF及其受体基因的表达呈先增加后降低的趋势,在小白卵泡中的表达量达到最高值,在中白卵泡中的表达量最低。荧光定量PCR结果与转录组测序结果基本相同。证实了在鹅等级前卵泡中BDNF及其受体Trk B对卵泡的发育有促进作用。     

产蛋前期和产蛋期鹅HPG轴OAZ1和OAZ2基因表达的研究

【目的】探讨产蛋前期和产蛋期鹅HPG轴中OAZ1和OAZ2基因表达的差异。【方法】选取健康的产蛋前期和产蛋期四川白鹅母鹅各3只,采集下丘脑、垂体和卵巢组织样品,提取总RNA并反转录合成cDNA,应用实时荧光定量PCR检测产蛋前期和产蛋期四川白鹅下丘脑、垂体、卵巢组织中OAZ1和OAZ2基因的相对表达量。【结果】在产蛋前期和产蛋期四川白鹅下丘脑、垂体和卵巢组织中,OAZ1和OAZ2基因均有表达,并且产蛋期OAZ1和OAZ2表达量均极显著高于产蛋前期(P<0.01),产蛋期四川白鹅下丘脑、垂体和卵巢中OAZ1的表达量分别是产蛋前期的1.79倍(P<0.01)、2.96倍(P<0.01)和3.48倍(P<0.01);产蛋期四川白鹅下丘脑、垂体和卵巢中OAZ2的表达量分别是产蛋前期的2.66倍(P<0.01)、1.38倍(P<0.01)和2.03倍(P<0.01)。【结论】OAZ1和OAZ2可在HPG轴的各级水平发挥其调控鹅繁殖过程的功能,OAZ1主要参与卵巢功能的调控,而OAZ2主要参与下丘脑功能的调控。     

PRSS23在蛋鸡卵泡颗粒细胞的表达及其与卵泡液孕激素含量的关系研究

为研究丝氨酸蛋白酶23(PRSS23)在蛋鸡卵泡中的表达部位及其mRNA在颗粒细胞中的表达与孕激素(P_4)分泌的关系,选取直径为3～5 mm的大白卵泡(LWF)和直径为6～8 mm的小黄卵泡(SYF),应用免疫组织化学技术对PRSS23进行组织定位;分别选取小白卵泡(SWF)、LWF、SYF、大黄卵泡(LYF),用1 mL注射器抽取卵泡液,测定不同大小等级前卵泡卵泡液中P_4的含量;刮取位于卵泡内膜上的颗粒细胞,利用实时荧光定量PCR技术检测PRSS23基因mRNA在蛋鸡不同大小等级前卵泡颗粒细胞中的表达情况。结果显示,PRSS23在蛋鸡卵泡颗粒细胞层、膜细胞层和卵丘细胞均有表达,在SYF颗粒细胞层表达量最高;PRSS23基因mRNA在SYF中的含量显著高于其他卵泡(P0.05);P_4在SYF卵泡液中的含量显著高于其他卵泡卵泡液(P0.05)。以上结果表明,PRSS23在SYF中可能会通过促进颗粒细胞分泌P_4来影响卵泡的选择。     

鸡HDLBP基因SNP鉴定及其与蛋用性能关联分析

从HDLBP转录本(NM₂05096.2)中鉴定6个同义突变的SNPs,在欣华鸡的关联分析发现C3381T和T387C与开产日龄(AFE)和蛋重(EW)显著关联(P<0.05),表明该基因可能是蛋用性状相关的候选基因。从小白卵泡(SWF)到小黄卵泡(SYF)中,HDLBP表达水平在膜层和颗粒层中逐渐升高。在排卵前期,F3到F2的颗粒层中HDLBP mRNA水平显著下降(P<0.05)。此外,EGF、VEGF、FSH在不同颗粒细胞生长阶段对HDLBP调控具有剂量依赖性,Follistatin对HDLBP mRNA表达没有明显影响。     

胰岛素样生长因子-I对鸡等级前卵泡发育的促进作用

 【目的】探讨胰岛素样生长因子-I（IGF-I）对产蛋鸡等级前卵泡发育的影响。【方法】用免疫组化和RT-PCR法检测IGF-I受体在鸡等级前卵泡中的表达,研究IGF-I对鸡早期卵泡发育的影响。【结果】IGF-I受体在等级前卵泡颗粒层和膜层均有表达,且随着卵泡的发育其表达水平逐渐增高,在小黄卵泡(SYF)阶段达到最大;同时,卵泡体外培养结果表明IGF-I（100 ng•mL-1）、FSH（10 n•mL-1）及IGF-I+FSH处理可显著增加SYF中膜层和颗粒层的厚度及细胞密度,且IGF受体在颗粒层和膜层中的表达水平也显著增加,其中以IGF-I+FSH联合处理组的效果最为显著。【结论】IGF-I能显著提高产蛋鸡SYF颗粒层和膜层的细胞数目以及厚度,同时增加IGF-I受体的表达,并可与FSH联合作用以提高IGF受体的表达,促进鸡卵泡细胞的增殖,进而调节鸡等级前卵泡的发育,此结果有助于揭示家禽卵泡发育的局域性内分泌调节作用。     

LPS对鹅等级卵泡基质层TLR家族基因表达的影响

【目的】研究鹅卵泡基质层TLR家族基因表达谱及其对LPS不同处理时间后的反应性。【方法】在大群散养条件下,实时观察鹅产蛋过程,分别在产蛋后8和2 h以及产前4、16和28 h注射LPS,并在产蛋后8h屠宰,即LPS作用0、6、12、24和36 h,每个时间点各5只鹅。屠宰时,取卵巢,观察卵泡外观形态,并分离F1-F5级卵泡基质层。试验鹅自由饮水、自由采食、自然光照。LPS处理0、24和36 h的单个F1-F5级卵泡基质层或卵泡用于基因表达分析,而其他LPS处理的每只鹅等级卵泡基质层RNA等质量混合后用于基因表达分析。采用普通PCR方法检测10种鸟类TLR家族基因的在鹅等级卵泡基质层的表达谱,其中以脾脏组织为阳性对照,以不加c DNA模板为阴性对照。根据RT-PCR的表达谱结果,采用Real-time PCR检测不同等级卵泡基质层TLRs表达水平以及不同LPS处理时间对基质层TLRs表达水平的影响。对不同等级卵泡和不同LPS处理时间对基质层TLRs表达的数据,采用单因子方差分析,Duncan法多重比较;对变性卵泡与对照组基质层TLRs表达水平的数据,采用T检验分析。【结果】(1)已公开的10种鸟类TLR家族基因,如TLRs 1A、1B、2A、2B、3、4、5、7、15和21基因均在等级卵泡基质层组织中表达。(2)随等级卵泡生长,TLRs 2A和15表达水平逐渐升高;F1级卵泡基质层TLR2A表达水平显著高于F3、F4和F5级卵泡,TLR15表达水平显著高于F5级卵泡;其他TLR家族基因,如TLRs 1A、1B、2B、3、4、5、7和21在不同等级卵泡基质层中的表达水平差异不显著。(3)在LPS处理0、6和12 h时,等级卵泡外观形态无明显变化,但在LPS处理24 h时,3只鹅的等级卵泡呈深黄色胶冻状变性;在LPS处理36 h时,全部试验鹅等级卵泡呈深黄色胶冻状变性。(4)与对照组(LPS处理0 h)相比,TLRs 2A、4和5表达水平在LPS处理12和24 h时显著升高,TLR2B表达水平在LPS处理24 h时显著升高,TLRs 7和15表达水平在LPS处理6-24 h期间均显著升高,而TLRs 1A、1B、3和21表达水平在LPS处理6-24 h期间差异不显著。(5)与等级卵泡基质层相比,在LPS处理24和36 h的变性卵泡中,TLRs 1A、2A、2B、4、5、7和15表达水平显著升高,TLR3表达水平显著降低,而在LPS处理36 h的变性卵泡中,TLRs 1B和21表达水平显著升高。【结论】已发现的10种鸟类TLR家族基因均在种鹅等级卵泡基质层表达,且随LPS作用时间延长,等级卵泡形态结构发生变化,但TLRs表达水平逐渐升高。     

大熊猫卵巢OB-Rb、NPY的蛋白表达与分布研究

为了探究瘦素长型受体(OB-Rb)与神经肽Y(neuropeptide Y,NPY)在大熊猫生殖调控中的作用,运用HE法、免疫组化SABC法观察了5例大熊猫卵巢组织学结构及OB-Rb、NPY在卵巢的表达与分布。结果显示:大熊猫卵巢各级卵泡数量较少,尤以中晚期生长卵泡更甚,原始卵泡和闭锁卵泡相对多见。OB-Rb和NPY在卵巢上均有表达,其中OB-Rb主要分布在颗粒细胞、卵泡膜细胞及黄体的粒黄体细胞;NPY阳性纤维和产物不均匀分布于卵巢各个部位,呈串珠状或点状。NPY阳性神经纤维主要位于血管周围、卵泡、黄体以及颗粒细胞中。大熊猫卵巢卵泡数量少的特征可能与其生殖能力低下有关;OB-Rb和NPY参与了卵巢卵泡发育的调控。     

山麻鸭卵泡发育的形态学及激素分泌调控基因的表达研究

为探讨各阶段山麻鸭卵泡发育水平以及激素分泌调控基因的表达情况,对不同发育等级山麻鸭卵泡壁的形态进行了观察,并检测了ＣＹＰ１９Ａ１和３β-ＨＳＤ基因的表达量．研究发现,发育过程中颗粒层和膜层细胞数量不断增加,密度和厚度也随着细胞的增殖而增长．对产蛋期山麻鸭卵泡膜层和颗粒层ＣＹＰ１９Ａ１和３β-ＨＳＤ的表达量进行检测结果表明,卵泡颗粒层的ＣＹＰ１９Ａ１基因主要在等级前阶段表达,３β-ＨＳＤ基因主要在等级阶段表达,卵泡膜层的ＣＹＰ１９Ａ１和３β-ＨＳＤ基因则主要都在等级阶段表达．     

皖西白鹅产蛋期卵巢的显微与超微结构

[目的]探讨皖西白鹅产蛋期卵巢的组织学结构。[方法]应用光镜和透射电镜技术,观察皖西白鹅产蛋期卵巢形态学结构。[结果]皖西白鹅卵巢表面被覆生殖上皮,下方是白膜,其实质由皮质和髓质组成。皮质内含有不同发育阶段的卵泡和萎缩卵泡,大卵泡突出了卵巢表面,卵泡无卵泡腔,也无卵泡液,排卵后不形成黄体。电镜下,卵泡颗粒细胞胞质中有线粒体、内质网、脂滴、高尔基复合体等丰富的细胞器,并且这些细胞器随着卵泡的发育而逐渐增多。卵巢基质中有卵泡外膜细胞、间质细胞和空泡细胞3种细胞,前2种细胞胞质中有丰富的内质网,而空泡细胞胞质中脂滴较多。[结论]阐明了皖西白鹅产蛋期卵巢的显微结构与超微结构。     

增殖细胞核抗原在水牛腔前卵泡中的表达与卵巢组织定位

【目的】探讨在水牛中增殖细胞核抗原（PCNA）参与卵泡发生的时期及其在卵巢组织不同时期卵泡中的表达定位;【方法】采用石蜡切片结合免疫组化的方法对PCNA在卵巢组织中进行定位,利用实时荧光定量PCR（QRT-PCR）技术检测PCNA在腔前卵泡中的表达情况。【结果】免疫组化结果显示：原始卵泡中的卵母细胞能检测到PCNA的表达,但颗粒细胞并未观察到PCNA的免疫染色;初级卵泡到次级卵泡,卵母细胞和颗粒细胞中均可检测到PCNA的表达,且在颗粒细胞中的表达有增强的趋势;有腔卵泡中,颗粒细胞、卵泡膜细胞及包围卵母细胞的卵丘细胞中都能观察到很强的免疫染色。定量表达检测结果显示：PCNA在原始卵泡、初级卵泡及次级卵泡中的表达呈上升趋势,并且有显著差异（43.50333±0.138338 vs 1.633804±0.093796 vs 1±0.012219 , P<0.01）;【结论】从初级卵泡开始在颗粒细胞中能检测到PCNA的表达,并且其表达随着卵泡的发育有明显的增强趋势,腔前卵泡中PCNA表达的QRT-PCR测定结果与免疫组化结果相一致,研究结果为阐明PCNA参与卵泡发生的分子调控机制奠定了基础。     

CTNNB1对猪卵巢颗粒细胞的调控

【目的】卵巢颗粒细胞的增殖和分化是原始卵泡生长启动的关键因素,卵巢颗粒细胞过度凋亡是卵泡闭锁的主要原因,因此卵巢颗粒细胞的功能对卵泡生长发育、排卵、激素分泌等至关重要。研究通过探究连环蛋白β1（catenin beta 1, CTNNB1）对猪卵泡发育过程中颗粒细胞的增殖、凋亡及类固醇激素分泌等功能的影响,为猪卵泡发育的分子调控机制研究提供参考。 【方法】利用RNA抽提、实时定量PCR（Quantitative real time PCR, qRT-PCR）等方法,构建CTNNB1在母猪卵巢、肌肉、大脑等9个组织的表达谱;检测母猪性成熟过程中卵巢组织和小（≤3 mm）、中（3—6 mm）、大（≥6 mm）卵泡颗粒细胞中CTNNB1的表达情况。构建CTNNB1的真核表达载体及合成siRNA,转染至猪卵巢颗粒细胞,采用EdU、Annexin V- FITC/PI双染、ELISA等方法,检测CTNNB1对颗粒细胞增殖、凋亡、类固醇激素分泌的影响,以及对类固醇激素合成通路重要基因转录表达的影响。【结果】与肌肉、大脑等组织相比,CTNNB1在卵巢中mRNA表达水平最高。性成熟母猪卵巢中CTNNB1转录水平显著高于性成熟前和性成熟后的母猪;卵巢卵泡中CTNNB1转录和蛋白水平随卵泡发育明显上调;且卵巢颗粒细胞中CTNNB1转录和蛋白水平也随卵泡的发育逐渐上调。更重要的是,CTNNB1显著促进颗粒细胞增殖,抑制颗粒细胞凋亡;CTNNB1能够上调CYP1A1和HSD17B7的转录水平,下调CYP11A1、ESR1、ESR2、FSHR、LHR和NR5A1等类固醇激素合成相关基因的转录水平,进而促进颗粒细胞雌激素的分泌,抑制颗粒细胞雄激素和孕激素的分泌。【结论】本研究证实CTNNB1可能通过促进颗粒细胞增殖及雌激素的合成和分泌,抑制颗粒细胞凋亡及雄激素、孕激素的合成和分泌,进而促进卵泡的生长发育。     

肉用种鸡产蛋后期繁殖性能与氧化应激的相关性研究

如何控制产蛋高峰过后产蛋率下降过快是饲养肉用种鸡最关键的问题,氧化应激是引起母禽卵巢功能下降的主要因素之一,但氧化应激与肉用种鸡产蛋后期繁殖性能的关系尚不清楚,本试验随机选取连续产蛋15周和22周的种母鸡各6只,测定血清、肝脏和卵巢组织过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮合酶（NOS）、一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等6个抗氧化指标,以及卵巢功能的差异,结果显示产蛋15周和产蛋22周的种母鸡卵巢指数、等级前卵泡(大白卵泡和小黄卵泡）数量差异不显著;随着产蛋周龄的增加,种鸡机体氧化损伤程度加剧,种鸡血清和肝脏组织中的SOD,CAT,NO及GSH-Px显著或极显著降低（P<0.05或P<0.01);产蛋15周种鸡肝脏中GSH-Px和CAT均显著高于产蛋22周（P<0.05),而NOS和MDA则显著低于产蛋22周（P<0.05);卵巢组织的6个抗氧化指标均差异不显著. 产蛋22周种鸡血清中的促性腺激素释放激素（GnRH）浓度与雌二醇（E2）浓度均显著低于产蛋15周样品组（P<0.05或P<0.01),血清中GnRH浓度与血清SOD,CAT和NO水平之间存在显著正相关;血清中E2浓度与血清CAT和NO水平之间存在显著正相关;结果表明,肉用种鸡产蛋高峰过后卵巢机能衰退可能与血清和肝脏氧化损伤不断累积和加重相关.     

PI3K信号通路关键基因在猪卵泡发育中的表达规律

【目的】研究不同时期猪卵巢卵泡发生的形态特征及磷脂酰肌醇3–激酶(Phosphoinositide 3-kinase,PI3K)信号通路关键基因在卵泡发生发育中的作用。【方法】通过HE染色观察12日龄、30日龄、70日龄、20月龄卵泡期及黄体期、48月龄的长大二元母猪卵巢卵泡发育的形态变化,应用实时荧光定量PCR检测PI3K通路关键基因在这些时期的表达规律,并通过Western blot法检测PI3K通路重要的下游效应因子p-rpS6在不同时期猪卵巢的表达情况。【结果】12日龄母猪卵巢皮质边缘有大量的原始卵泡,皮质与髓质交界处可见少量初级卵泡及个别的次级卵泡;30日龄母猪卵巢次级卵泡数量增加;70日龄出现3级卵泡;20月龄卵泡期、黄体期分别有大量成熟卵泡、大体积的黄体;48月龄较难观察到原始卵泡。PI3K通路抑制因子PTEN、TSC1、TSC2与激活因子PDK1、AKT1、mTOR的mRNA均在12日龄表达量最高,70日龄、48月龄表达量次之,30日龄和20月龄表达量最低;下游效应基因rpS6的mRNA 30日龄表达量最高,20和48月龄表达量最低,p-rpS6蛋白在12日龄、20月龄、48月龄母猪卵巢高表达,在30日龄、70日龄中几乎不表达。【结论】PI3K通路关键基因在不同时期母猪卵巢中的表达水平不同,说明该通路参与了猪卵泡的早期发生及卵泡成熟的调控过程。