马生长激素基因的克隆与5′侧翼区序列分析

利用PCR技术首次扩增、克隆了6个具有不同生长速度马的生长激素基因。6个品种分别为:1个体格高大健壮的引入品种英纯血马,1个中等体高的中国驰名培育品种三河马,3个中等体高的蒙古马(乌审马、乌珠穆沁马、锡尼河马),1个体格矮小的广西矮马。马GH基因大小1923bp,包括了转录起始位点5′侧翼区序列250bp、1个可能的TATA框,组织特异性转录因子结合位点,全部5个外显子和4个内含子及部分3′侧翼区序列。分析6个品种马GH基因5′侧翼区序列并与乌审马序列相比,均在第210位出现由胞嘧啶C颠换为腺嘌呤A,在249位由胞嘧啶C颠换为鸟嘌呤G。6个品种之间的比较显示,马GH基因5′侧翼区具有极高的保守性,体格和体高具有显著差异的马品种间几乎未有差异。说明不同品种马生长速度和成年体重的差异,并非是其GH基因5′侧翼区变异造成的,马GH基因表达的差异可能受到内含子或3′侧翼区序列的影响。     

马生长激素(GH)基因的PCR-SSCP研究

选取4个蒙古马地方品种、1个国内培育品种和1个国外引人品种共281匹马，采用PCR—SSCP技术，检测了GH基因5’侧翼区、第1内含子、第2外显子和第5外显子4个位点的遗传多态性。结果显示：仅第5外显子出现多态性，表现出AA、BB和AB3种基因型，其余位点未检测到多态。群体遗传学分析结果表明：除纯血马外，其余品种都是等位基因A为优势基因；Hardy-Weinberg平衡检验显示，乌审马、乌珠穆沁马、巴尔虎马处于平衡状态，锡尼河马、三河马、纯血马处于非平衡状态；各品种马的多态信息含量均为中度多态（0．25〈PIC〈0．5）。本研究为今后马的分子育种奠定一定基础。     

中国地方黄牛GH基因遗传多态性研究

以鲁西牛、南阳牛为试验动物，利用PCR-SSCP和PCR-RFLP技术研究了以上2个地方黄牛品种生长激素（GH）基因第3内含子、第4内含子、第5外显子、3’端和5’端位点的遗传多态性。检测结果表明：GH基因第3内含子1547bp处发生碱基C→T的替换；GH基因第4内含子位点多态的产生是由于1947bp处发生碱基T→G的替换；GH基因第5外显子2141bp处碱基C→G的突变，使得亮氨酸变成缬氨酸，造成氨基酸发生变化。GH基因3’端的PCR-RFLP结果表明：由于2639bp处碱基GCC→GGC的突变造成HaeⅢ酶增加1个酶切位点；GH基因5’端位点多态的产生是由303bp处碱基C→T的突变造成。     

南江黄羊LHβ基因序列测定及分析

参照GenBank中发表的奶牛、绵羊和猪LHβ基因序列设计引物，以35只南江黄羊为研究对象，利用PCR技术扩增并测定了山羊LHβ基因部分序列（GenBank登录号：AY853264），并利用GenBank中不同物种LHβ基因的部分编码区序列进行了系统发育分析。结果表明：在测定出的929bp序列中，包含LHβ基因5’侧翼区（136bp）、2个内含子全序列（分别为297bp和235bp）、第1和第2外显子全序列（分别为26bp和168bp）以及第3外显子部分序列（67bp）。除第1外显子前11bp为5’非翻译区外，其余外显子序列共编码83个氨基酸，前20个氨基酸为信号肽序列。山羊LHβ基因序列富含GC。在测定的35个个体中共检测到8个单碱基突变位点，位于外显子中的2个突变位点均为同义突变，其余6个突变位点位于5’侧翼区和内含子。系统发育分析结果与物种实际的演化顺序不完全相符，可能是由物种间LHβ基因GC含量的较大差异引起。本研究首次报道了山羊LHβ基因序列，为进一步探明山羊繁殖性能的遗传机理奠定了基础。     

蒙古马生长激素基因的克隆及部分序列的PCR-SSCP分析

通过PCR-SSCP方法对7个品种285匹马的生长激素基因做了多态性分析,在所检测的5′端侧翼区、第一内含子、第二外显子和第五外显子4个位点中,仅第五外显子检测到多态,该多态位点由A和B两种等位基因控制.GH基因第1 719处1个T→C的突变和1 743处G→A的突变,导致等位基因B变为等位基因A.除纯血马外,A基因在各品种中均为优势等位基因,B基因为纯血马的优势基因.在此多态位点,乌珠穆沁马、乌审马和巴尔虎马处于Hardy-Weinberg平衡状态,纯血马、三河马和锡尼河马则未达到Hardy-Weinberg平衡状态.     

关岭牛解偶联蛋白3基因5’侧翼区克隆和生物信息学分析

本试验对贵州关岭牛解偶联蛋白3（uncoupling protein,UCP3）基因5'侧翼区进行克隆,并利用生物信息学软件对其1080 bp的克隆序列进行分析,以研究UCP3基因5'侧翼区特异性转录调控元件的调控机制。软件分析发现关岭牛UCP3基因5'侧翼区含有6个可能的转录起始点和33个潜在转录因子结合位点,与东北虎、家猫、印度水牛、藏羚羊、山羊、绵羊UCP3基因5'侧翼区（-196～+100 bp）序列相似性分别为82%、82%、98%、95%、96%和98%;该区域保守性较强,推测转录起始点上游-200～+1 bp可能是其核心启动子区域,该区域在调控基因转录和翻译方面具有共同的作用。试验成功克隆了UCP3基因5'侧翼区序列1080 bp,初步预测了该基因的核心启动子区。     

藏猪生长激素基因核苷酸多态性分析

本文应用PC R方法,体外扩增了藏猪5个个体的生长激素(GH)基因64～2022位之间1959 bp的片段(包含完整的5个外显子和4个内含子),并进行了序列测定。结合网上下载的猪GH基因同源区段序列进行比较分析,结果表明:藏猪GH基因有较丰富的核苷酸多态性;检出的24个核苷酸突变位点中有6个发生在外显子区,外显子2内有4个突变位点,导致2个氨基酸变异,外显子3和外显子4内各有一个突变位点,特别是外显子4内这个突变位点引起了1个氨基酸变异;单核苷酸转换(21个位点)大于颠换(5个位点)。     

含第1内含子的猪生长激素cDNA基因的构建

以 PCR方法扩增了猪生长激素 ( p GH)基因的第 1内含子 ,经测序表明 ,扩增的 p GH基因第 1内含子的序列与 Vize发表的序列存在 6个碱基的差异 ,同源性达 97.5%,说明 p GH基因第 1内含子具有多态性。此外 ,还发现此内含子存在有转录因子 ATF的结合位点。利用第 2外显子的 Hinf 位点 ,采用将 3个 DNA片段一步连接的方法 ,将扩增的第 1内含子插入到 p GHc DNA的正确位置上 ,从而构建出含第 1内含子的p GHc DNA。     

野猪生长激素基因的克隆与序列分析

参考家猪GH基因序列[M17704.1],设计1对特异引物,用PCR方法从野猪基因组中扩增出1条长约1.8kb的DNA片段。PCR产物经PMD18-TVector载体转化感受态DH5α株大肠杆菌,获得重组克隆子。结果表明:野猪生长激素基因DNA序列长1792bp,含完整的5个外显子和4个内含子,与家猪、牛、山羊、河马、狗、小鼠和恒河猴的GH基因cDNA序列同源性分别为99.19%、89.6%、89.7%、94.6%、92.9%、86.9%、77.3%。其cDNA所编码氨基酸与牛、山羊、河马、狗、小鼠和恒河猴同源性分别为98.74%、83.9%、83.9%、92.5%、90.7%、81.6%、65.5%。所测野猪生长激素基因序列与13个家猪品种的GH基因序列比较,检出54个核苷酸变异位点(外显子12个,内含子36个,侧翼区6个),其中24个为各家猪品种内所不具有的新变异位点,即野猪种群特有变异位点。在外显子的12个变异位点中,有8个可导致氨基酸残基的改变。这些结果,表明了野猪GH基因在进化过程中的保守性和多态性。     

鸡内皮素3(EDN3)基因启动子区序列生物信息学分析

为解析鸡内皮素3(EDN3)基因启动子区序列的结构特征及其转录调控机制，本研究基于NCBI数据库中鸡EDN3基因5′侧翼区与外显子1共计2 052 bp核苷酸序列，利用不同在线软件对其核心启动子区域、顺式作用元件、转录因子结合位点及CpG岛等结构进行生物信息学预测分析，并通过DNASTAR Lasergene 17.3和MEGA 5.0软件进行不同物种EDN3基因启动子区序列相似性比对及系统进化树构建。结果表明：鸡EDN3基因起始密码子上游592～2 000 bp为可能的候选核心启动子区；5′侧翼区633 bp和1 547 bp存在2个潜在的转录起始位点T和A;该基因启动子区存在2个CAAT-box、3个GC-box、6个TATA-box、9个E-box和3个CpG岛结构域。综合多种在线软件预测，鸡EDN3基因启动子区存在Sp1、C/EBPα和NF-1等转录因子结合位点。鸡EDN3基因启动子区序列与环颈雉、鹌鹑、岩雷鸟、棕硬尾鸭、凤头潜鸭、山羊、绵羊、牛、猪和人的相似性为38.8%～90.3%;系统进化树表明，鸡与鹌鹑亲缘关系最近，与猪亲缘关系最远。研究结果为进一步探明鸡色素沉积关联E...     

广西百色马生长激素基因的克隆与序列分析

为了丰富优良地方品种百色马的分子遗传学基础数据,试验设计1对特异性引物,利用PCR技术成功克隆百色马的生长激素基因全序列.结果表明:百色马GH基因碱基序列全长1 922 bp(GenBank登录号为FJ604598),包含完整的5个外显子和4个内含子;与蒙古马比较,百色马GH基因DNA序列出现12个碱基的变异,有3个变异位点处于编码区,均为有义突变,突变方式都为G→A的转换,其中第981位碱基G→A致使第89位氨基酸由Arg突变为Lys,第1739位碱基G→A使第185位氨基酸由Gly→Arg,第1 764位碱基G→A使第193位氨基酸由Gly→Asp.基于GH基因构建的不同,动物亲缘进化树的拓扑结构与物种树一致,哺乳动物的GH基因在进化中比较保守.     

海南文昌鸡生长激素基因克隆测序及生物信息学分析

为了克隆文昌鸡的生长激素(growth hormone,GH)基因,获得该基因序列并分析基因结构和相关遗传变异,采用PCR方法扩增GH基因组序列,通过克隆测序寻找基因中的突变位点,利用PCR产物直接测序检测GH基因的多态性。结果显示:在鸡GH基因组中共发现7处碱基突变位点,分别位于GH基因的5'端、第1内含子、第4外显子和第4内含子中;多态性分析发现,在GH基因-391 bp处的A/G突变位点、-360bp处的A/G突变位点、-121 bp处的C/T突变位点上,文昌鸡的优势基因型分别是AA、GG和CC;鸡GH基因启动子区域发现多种潜在的转录因子结合位点,如GATA序列结合因子1(GATA-binding factor 1,GATA-1)、环磷酸腺苷应答元件结合蛋白(c AMP response element-binding protein,CREB)、核因子1(nuclear factor 1,NF-1)、上游刺激因子(upstream stimulatory factor,USF)、增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer binding protein alpha,C/EBPalp)等。本试验为进一步研究文昌鸡GH基因的功能提供了参考。     

野桑蚕、家蚕LSP基因5''''侧翼区的克隆与序列分析

根据已报道的家蚕朝日×东海的幼虫血清蛋白LSP基因序列设计1对引物,以野桑蚕、家蚕苏·菊×明·虎的基因组DNA为模板,分别克隆了野桑蚕、家蚕苏·菊×明·虎的LSP,基因5’侧翼区,约1.9kb,并进行了序列测定与分析。结果表明:克隆的野桑蚕、家蚕苏·菊×明·虎的LSP基因5’侧翼区涵盖了第一内含子、第一外显子、启动子区及其5’上游区;野桑蚕LSP基因5’侧翼区与朝日×东海LSP,基因5’侧翼区的同源性达96.4％,其中第一内含子、第一外显子的同源性分别为91.6％,100％;家蚕苏·菊×明·虎的LSP基因5’侧翼区与朝日×东海LSP基因5’侧翼区的同源性达98.9％,其中第一内含子、第一外显子的同源性都为100％,核心启动子区具有典型的TATA盒,还有数种昆虫脂肪体内组织特异性表达基因的共有序列和推定的激素响应元件等功能元件;野桑蚕的LSP基因启动子的5’上游区(-304～598bp)与J139家蚕丝素轻链基因第一内含子区域(7639～7933bp)的同源性达90.6％,-913～-1383bp为失活的部分水手转座子元件。     

羊驼生长激素基因的克隆与序列分析

应用RT-PCR和PCR技术克隆得到了羊驼生长激素(Growth hormone,GH)基因,包括完整的编码区812 bp 的cDNA序列和1 800 bp 的DNA序列.两者比对后证明羊驼GH基因DNA序列由5个外显子和4个内含子组成,编码216个氨基酸的GH前体蛋白,其中包括26个氨基酸的信号肽和190个氨基酸的成熟肽.序列比较结果表明,羊驼GH基因序列与骆驼、猪、马、犬和猫等哺乳动物类似,但羊驼GH基因的启动子不是哺乳动物的典型TATA盒,而同骆驼一样为CATA盒.在DNA和cDNA水平以及推导的氨基酸水平,均与骆驼的同源性最高.通过GH氨基酸的功能位点分析推测,羊驼生长激素与人、猪等大多数动物的生长激素无明显功能上的差异.     

广西百色马生长激素基因的克隆与序列分析

为了丰富优良地方品种百色马的分子遗传学基础数据,试验设计1对特异性引物,利用PCR技术成功克隆百色马的生长激素基因全序列。结果表明:百色马GH基因碱基序列全长1922bp(GenBank登录号为FJ604598),包含完整的5个外显子和4个内含子;与蒙古马比较,百色马GH基因DNA序列出现12个碱基的变异,有3个变异位点处于编码区,均为有义突变,突变方式都为G→A的转换,其中第981位碱基G→A致使第89位氨基酸由Arg突变为Lys,第1739位碱基G→A使第185位氨基酸由Gly→Arg,第1764位碱基G→A使第193位氨基酸由Gly→Asp。基于GH基因构建的不同,动物亲缘进化树的拓扑结构与物种树一致,哺乳动物的GH基因在进化中比较保守。     

6个品种马DRD4基因克隆与序列比较分析

从6个品种马的血液中提取基因组DNA,根据GenBank中已发表的人、鼠、雪貂的DRD4 cDNA基因保守区序列,设计3对特异性引物,另1对由文献所得,对6个品种马的DRD4基因分4段进行PCR扩增,经电泳检测,分别呈4条特异条带,将其分别克隆入pMD19-T载体中,进行序列测定并拼接序列,得到包括所有内含子的DRD4基因序列。分析结果表明,马DRD4基因含有4个外显子和3个内含子,所得序列与人、鼠和狗同源区比对,发现其同源性都达到了75%以上。对6个品种马DRD4基因序列比较发现,不同品种马之间,第1内含子和第3外显子存在一定的变异,包括转换、颠换、插入/缺失和VNTR。     

鹅p21基因克隆、启动子分析及转录调控研究

【目的】 分析鹅p21基因的结构和启动子活性，探讨p21基因的转录调控机制。【方法】 以泰州鹅为试验对象，通过同源克隆、RACE和生物信息学分析等方法获得鹅p21基因全长序列和5′-侧翼区序列特征；构建6个不同缺失片段的启动子区双荧光素酶报告载体并分析其荧光素酶活性，进而确定p21基因核心启动子区；对核心启动子区转录因子结合位点生肌决定因子(MyoD)(+25~+36 bp)进行定点突变，并构建突变报告基因载体，在C2C12细胞系内初步鉴定鹅p21基因核心转录调控因子。【结果】 鹅p21基因cDNA全长1 943 bp，CDS区大小为453 bp，编码151个氨基酸，蛋白序列包含高度保守的CDI家族结合位点。系统进化树分析表明，鹅p21基因与鸭亲缘关系最近，与鸡和火鸡有较强的进化关系。鹅p21基因5′-侧翼区包含启动子元件，—35~+37 bp是核心启动子区，发挥正向调控作用，结合定点突变技术初步鉴定MyoD是鹅p21基因核心转录调控元件。【结论】 本研究获得了鹅p21基因完整的cDNA序列和启动子区域，MyoD是p21基因核心转录调控因子，为探究p21基因在鹅胚胎期肌肉发育过程中的调控机制提供理论依据。     

中国荷斯坦牛C4A基因5'侧翼区功能分析

利用在线预测软件对牛C4A基因的5'侧翼区序列进行生物信息学分析,成功构建了一系列表达载体,利用双荧光素酶报告基因检测系统分析牛C4A基因的5'侧翼区启动活性。分别通过定点突变技术构建突变质粒,研究调控C4基本表达和诱导表达的转录因子结合位点。利用EMSA技术验证转录因子在研究细胞系中存在与否。结果显示,C4A基因启动子序列转录起始位点上游169 bp为报告基因荧光值最高的片段,即为启动子核心区;其中SP1(-169~-158)、E-box(-122~-117)和AP-1(-80~-71)是调控C4基本表达的主要转录因子结合位点,且3个转录因子在Hep G2细胞系中真实存在。