水稻多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因(Ospgip1)原核表达及编码产物生物信息学分析

 据GenBank及相关文献提供的序列,从水稻基因组DNA中扩增出930 bp的Ospgip1基因完整开放阅读框。原核表达Ospgip1基因,表达产物能显著抑制水稻纹枯病菌菌丝生长及其多聚半乳糖醛酸酶活性。生物信息学分析表明,OsPGIP1为分子量32.8 kDa、pI 7.26的疏水蛋白,主要位于细胞壁（55.6%）,信号肽切点位于第17和18位氨基酸之间。在N端和C端各有4个半胱氨酸残基,形成3个二硫键（第56和63位、第278和298位、第300和308位氨基酸）。以α-螺旋、β-折叠和不规则盘绕等为主要结构原件,具有典型的富含亮氨酸重复（LRR）结构。相比其他植物的PGIP,OsPGIP1缺少第7个LRR。在空间上9个LRR形成类似凹陷或裂隙结构,可能是其与病原菌多聚半乳糖醛酸酶互作的活性位点区。     

水稻多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因(Ospgipl)原核表达及编码产物生物信息学分析

据GenBank及相关文献提供的序列,从水稻基因组DNA中扩增出930 bp的Ospgip1基因完整开放阅读框。原核表达Ospgip1基因,表达产物能显著抑制水稻纹枯病菌菌丝生长及其多聚半乳糖醛酸酶活性。生物信息学分析表明,OsPGIP1为分子量32.8 kDa、pI 7.26的疏水蛋白,主要位于细胞壁(55.6%),信号肽切点位于第17和18位氨基酸之间。在N端和C端各有4个半胱氨酸残基,形成3个二硫键(第56和63位、第278和298位、第300和308位氨基酸)。以α-螺旋、β-折叠和不规则盘绕等为主要结构原件,具有典型的富含亮氨酸重复(LRR)结构。相比其他植物的PGIP,OsPGIP1缺少第7个LRR。在空间上9个LRR形成类似凹陷或裂隙结构,可能是其与病原菌多聚半乳糖醛酸酶互作的活性位点区。     

不同香蕉品种多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白活性的比较

植物多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)是一种富含亮氨酸重复区域的蛋白质,能够非竞争性地抑制真菌的多聚半乳糖醛酸酶(PG)的活性.以目前生产上几个主要抗枯萎病的香蕉品种为材料,参照Gross的PGIP活性测定方法,通过测定了Musa AAA、Musa ABB、Musa ABB、Musa AA和Musa AAAB等不同细胞基因型的香蕉品种的PGIP活性,发现东莞大蕉(Musa ABB)的活性最高.通过对东莞大蕉根、假茎、叶不同部位的PGIP活性比较,发现假茎的活性最高.用香蕉枯萎病菌4号生理小种接种诱导东莞大蕉能明显提高PGIP活性,观察还发现东莞大蕉苗期PGIP的活性明显高于后期.     

甘蓝型油菜BnADC基因的克隆及原核表达

利用同源克隆和RACE(Rapid amplification of cDNA ends)技术从甘蓝型油菜中克隆到精氨酸脱羧酶(Arginine decarboxylase,ADC)基因cDNA全长序列,命名为BnADC。BnADC全长为2 649bp,包含344bp的5′非翻译区(5′ Untranslated region,5′-UTR)、226bp的3′非翻译区(3′ Untranslated region,3′-UTR)和2 079bp的完整开放阅读框(open reading frame,ORF),编码75.1kD的蛋白质。5′-UTR中含有12bp的uORF (Upstream open reading frame),编码MIRE 4个氨基酸。氨基酸同源性比对表明,BnADC蛋白与其他植物ADC蛋白具有很高的相似性,与芥菜的同源性高达93%;系统进化树分析表明,BnADC与芥菜、拟南芥的ADC亲缘关系较近。在获得全长cDNA的基础上,构建融合表达载体pET30a(+)-BnADC,转化大肠杆菌（Escherichia coli）表达菌株BL21(DE3),SDS-PAGE检测到一个约81.1kD的融合蛋白被E. coil表达,且融合蛋白主要存在于菌体沉淀中。     

大豆疫霉菌多聚半乳糖醛酸酶pspg1基因的克隆及表达分析

大豆疫病严重影响我同及世界各国的农业生产,为探讨多聚半乳糖醛酸酶在大豆疫霉菌致病过程中的作用,采用PCR的方法从大豆疫霉菌中克隆了多聚半乳糖醛酸酶pspg1基因,并利用RT-PCR法对其在大豆中的表达进行了分析.结果表明:大豆疫霉菌pspg1基因开放阅读框长1236 bp,编码一个长412氨基酸的蛋白质.对其进化关系进行分析,发现该基因与其它卵菌的pg基因亲缘关系最近,形成一个独立的分支.RT-PCR分析表明:pspg1基因在接种大豆疫霉菌的大豆下胚轴中大量表达,而在健康大豆下胚轴中未检测到.克隆了大豆疫霉菌pspg1基因,并发现该基因在大豆疫霉菌侵染大豆过程中发挥重要作用.     

2个番木瓜多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因的克隆与分析

采用RT-PCR扩增获得了2个番木瓜果实多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)基因cDNA和DNA全长序列,将其命名为CpPGIP1和CpPGIP2.CpPGIP1基因全长为984 bp,编码325个氨基酸;CpPGIP2基因全长为1 025 bp,编码326个氨基酸.2基因均没有内含子序列,核苷酸序列有66.54％的相...     

节节麦pbf基因的克隆、序列分析及原核表达

醇溶蛋白盒结合因子(prolamin-box binding factor,PBF)通过调控籽粒蛋白的表达效率进而影响面粉的加工品质。为给深入研究小麦籽粒PBF对籽粒蛋白质表达调控的分子基础提供参考依据,进而为小麦面粉加工品质的改良提供候选基因资源,利用特异引物组合pbfF1/pbf R1分别从两份节节麦(AS90、AS2386)中克隆出pbf基因后进行序列分析,并进一步构建pbf基因的原核表达体系。结果表明,从两份节节麦中克隆得到了2个不同类型的pbf基因(GenBank登录号分别为KJ544771和KJ544772),其中来源于AS2386的KJ544772与来源于普通六倍体小麦的1个pbf基因序列完全相同。推导的氨基酸序列分析表明,KJ544771和KJ544772所编码的蛋白质均为弱碱性的亲水蛋白,具有典型的DOF蛋白结构域。与其他远缘物种来源的PBF比对结果表明,该类蛋白在NLS核心、DOF结构域及Ser铰链区相对保守,而在C-端调控区变异较大,说明PBF蛋白具有种属特异性。同时,系统演化树显示,来源于节节麦AS2386的pbf基因与迄今已知的全部普通小麦的pbf基因具有高度的相似性,因此推测该种类型的节节麦很可能参与了最初的普通六倍体小麦的形成。此外,本研究成功构建了pbf基因的原核表达体系,可为后续功能验证的开展奠定基础。     

剑麻斑马纹病菌5个多聚半乳糖醛酸酶基因的克隆与序列分析

以寄生疫霉菌多聚半乳糖醛酸酶pppg1～pppg5等5个基因cDNA序列为参考,设计基因编码区特异性引物。利用5对引物分别对剑麻斑马纹病菌进行分子检测以及基因同源克隆。通过此方法首次从剑麻斑马纹病菌中获得了5个多聚半乳糖醛酸酶基因,并分别命名为Szpg1～Szpg5。检测结果表明,Szpg1～Szpg5基因普遍存在于被检测剑麻斑马纹病菌中。序列分析结果表明,Szpg1～Szpg5基因与pppg1～pppg5对应基因之间存在核苷酸序列差异,由此导致个别氨基酸的差异,甚至提前终止。由此推测,Szpg1～Szpg5基因与pppg1～pppg5在功能上可能存在着一定的差异。     

马蓝IGPS基因的克隆、表达分析及原核表达

吲哚-3-甘油磷酸合酶(indole-3-glycerol phosphate synthase,IGPS)是广泛参与生物体内色氨酸、生长素等吲哚化合物合成途径中重要的关键酶之一.为了研究BcIGPS在马蓝吲哚类生物碱合成中的作用,基于马蓝转录组数据,通过RT-PCR技术从马蓝中克隆得到IGPS基因序列,命名为BcIG...     

芜菁花叶病毒外壳蛋白基因的克隆与序列分析

根据芜菁花叶病毒（Ｔｕｒｎｉｐ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ ＴｕＭＶ）外壳蛋白（ＣＰ）基因序列人工合成引物,用ＲＴ法合成ｃＤＮＡ后,通过ＰＣＲ法扩增并克隆ＴｕＭＶ海南分离物外壳蛋白基因。结果表明,外壳蛋白基因全长８６４个碱基,编码２８８个氨基酸。与Ｔｒｅｍｂｌｙ,Ｍ．Ｆ等报道的该苷酸同源率为９５．８％,氨基酸同源率为８４．８％。与徐平报道的核苷酸同源率为９６．３％,氨基酸同源率为９５．１％。与孔令洁     

青稞CHS基因的克隆及原核表达分析

为进一步研究查尔酮合酶（Chalcone synthase,CHS）在黄酮化合物代谢过程中的作用,以青稞94-19-1为材料,通过同源克隆技术分离CHS基因,并对分离得到的CHS基因进行生物信息学分析及原核表达。结果表明,从青稞94-19-1中克隆得到的CHS基因编码区长为1 197 bp,编码398个氨基酸。生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白质分子量为43.479 kDa,预测等电点(pI)为5.92,是酸性蛋白;该酶蛋白体外红细胞中的半衰期为30 h,不稳定系数(II)大于40,属于不稳定蛋白;平均亲水指数为-0.090,是亲水性的蛋白。SDS-PAGE检测结果表明,将该基因克隆到表达载体pET-32a上,并在大肠杆菌BL21中表达,可得到64 kDa左右的融合蛋白,在IPTG诱导浓度为1.0 mmol·L^-1时,最佳诱导时间为3 h。     

琯溪蜜柚汁胞APX1 cDNA的克隆及原核表达

为了解琯溪蜜柚(Citrus grandis‘Guanximiyou’)汁胞在发育过程中,APX与汁胞活性氧自由基清除和汁胞粒化的关系,以琯溪蜜柚果肉为材料,运用cDNA克隆的方法,克隆得到琯溪蜜柚果肉APX1cDNA全长,并进行了原核表达。结果表明:获得了全长为1118bp的琯溪蜜柚汁胞APX1cDNA全序列,包含753bp的开放阅读框,编码250个通读的氨基酸序列。具有过氧化物酶活性位点信号和亚铁血红素结合基信号。目前APX1cDNA序列已在GenBank上注册,登录号为gb|FJ595794.1。通过构建重组质粒p32-APX1,转化至TransRosetta(DE3)中,在大肠杆菌宿主中获得了表达,从而为下一步制备该酶抗体及研究琯溪蜜柚汁胞粒化过程中APX1的功能奠定了基础。     

橡胶树炭疽菌CsHog1基因的克隆和原核表达分析

HOG MAPK途径在植物病原真菌生长发育、致病过程和对杀菌剂敏感性等方面发挥重要功能,但在不同的病原真菌中具有一定差异。为研究Hog1蛋白在橡胶树炭疽菌(Colletotrichum siamense)中的功能和调控机制,本研究利用同源克隆法克隆获得橡胶树炭疽菌(C. siamense)的CsHog1基因,构建GST-CsHog1融合表达载体,利用SDS-PAGE和WesternBlot检测蛋白表达情况。结果表明:橡胶树炭疽菌(C.siamense)的CsHog1基因大小1383 nt,编码459个氨基酸,包含5个内含子,具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域;聚类分析显示橡胶树炭疽菌的CsHog1基因编码的氨基酸序列与黄瓜炭疽菌的ClOsc1(Hog1同源基因)同源性最高。所构建的蛋白融合表达载体在供试条件下(IPTG0.3、0.5、0.8、1.0 mmol/L;温度16、25、28℃)均可较好诱导表达,GST-CsHog1融合蛋白大小约为70 ku。用GST亲和层析柱纯化获得蛋白,经Western Blot检测显示该蛋白可与GST单克隆抗体特异性结合。     

甘蓝型油菜BnPex16p基因cDNA的克隆与表达

利用模式植物拟南芥AtPex16p/sse1基因序列与油菜数据库BBSRC BrassicaDB比对,得到甘蓝型油菜(Brassica napus)同源EST序列,拼接出油菜Pex16p基因全长cDNA电子克隆,然后设计全长引物,以甘蓝型油菜种子cDNA为模板,克隆Pex16p基因,得到全长为1 101bp的cDNA,编码366个氨基酸的蛋白,命名为BnPex16p。BnPex16p基因序列与拟南芥AtPex16p/sse1同源,其蛋白与拟南芥同源蛋白具有完全相同的PTS2型过氧化物酶体定位肽,进化关系相近。半定量PCR(RT-PCR)发现BnPex16p基因在油菜幼嫩的根、茎、叶和种子中均有高丰度表达,在种子发育过程的中期和后期表达水平增加,暗示该基因在油脂的积累中有重要作用。     

小麦热激蛋白WHSP90基因的原核表达及多克隆抗体制备

为了进一步研究HSP90基因的功能,将WHSP90基因构建到原核表达载体pET-28a(+)中,得到His-WHSP90融合表达载体,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,发现1 mmol/L IPTG诱导4 h蛋白表达量最大;经过蛋白标记亲和层析柱(HisTrapTMHP)纯化得到的纯化蛋白浓度达到0.4 mg/mL.免疫家兔制备抗体,用间接ELISA法检测免疫后家兔抗血清效价大于125 000,满足后续试验要求的效价值,为在蛋白水平上研究WHSP90基因功能提供了基础.     

青稞CHI基因的克隆及原核表达分析

为了进一步了解CHI基因在青稞黄酮合成中所起的作用,以青稞品系94-19-1为材料,通过同源克隆技术分离CHI基因,并对分离得到的CHI基因进行生物信息学分析及原核表达。结果表明,从青稞94-19-1中克隆得到的CHI基因编码区长为696bp,编码231个氨基酸。序列分析表明,青稞CHI基因有4个碱基和大麦不同,导致1个氨基酸发生改变。SDS-PAGE检测结果表明,将该基因克隆到表达载体pET-32a上,并转化大肠杆菌BL21后,经诱导可成功表达出融合蛋白。     

三七PnAAE41基因的克隆、表达分析及原核表达

草酰辅酶A合成酶参与了三七主要止血活性成分三七素的生物合成,研究三七草酰辅酶A合成酶基因(PnAAE41)的分子特征及表达特征,从而完善三七素生物合成途径以及成分积累调控机制等方面的研究.以三七为材料,在前期转录组研究基础上,设计特异性引物,通过RT-PCR扩增获得1个三七AAE基因的cDNA全长.采用生物信息学方法分...     

甘蓝型油菜Δ9硬脂酰ACP脱氢酶（SAD)基因的克隆与表达分析

为改良甘蓝型油菜菜籽油脂肪酸的组分,根据拟南芥Δ9硬脂酰ACP脱氢酶（SAD)核酸序列特征,检索白菜全基因组SAD基因和cDNA的可能序列,通过同源序列法克隆获得6个甘蓝型油菜SAD基因。比对结果显示,这6个基因编码的氨基酸序列同源性达53.2%~96.3%。系统进化分析显示,甘蓝型油菜SAD基因与蓖麻、大豆、芝麻、葵花等6个油料作物SAD基因的序列相似性很高,甘蓝型油菜与这些高等植物的SAD基因在进化上具有较高的保守性。本文还对4个甘蓝型油菜SAD基因BnSAD1:1、BnSAD2:1、BnSAD2:2和BnSAD2:3进行了表达模式分析,发现它们在种子发育过程中表达,并且都在40d的种子中表达量达到最高值,推测这4个基因均参与了硬脂酰ACP (C18:0-ACP)脱氢生成油酰基ACP(Δ9C18:1-ACP)的过程,尤其是BnSAD2:3可能为种子特异表达基因。     

菜豆几丁质酶基因的克隆、序列分析及其表达

根据GenBank中收录的菜豆几丁质酶基因mRNA序列设计一对引物,以菜豆品种五常油豆总DNA为模板,通过PCR扩增获得一个约1.1kb的DNA片段Bchi,将其克隆入pUC18载体.测序和序列分析结果表明,该序列全长1088bp,含有一个981bp的完整开放读码框,无内含子,编码327个氨基酸,编码产物在结构上具有Class Ia几丁质酶的结构特征:N-端具有一个26个氨基酸的信号肽,其后是富含8个半胱氨酸、长41个氨基酸的几丁质结合区和由249个氨基酸组成的高度保守的催化区,C-端为由11个氨基酸组成的液泡定位多肽.序列与结构上的同源性分析表明Bchi基因是菜豆Class Ia几丁质酶基因.此序列已在GenBank中注册,登录号为AY357300.以pQE-30为原核表达载体,构建成pQE-Bchi重组表达载体,转化表达受体菌E.coliM15,经IPTG诱导后表达出一个约35kD的蛋白,与推测的Bchi基因编码产物的大小一致,表明Bchi基因在大肠杆菌中能够表达,是一个具有表达功能的基因.