甘蓝型油菜基因组文库的构建及与硼高效基因相连锁克隆的筛选

以甘蓝型油菜宁RS-1为材料,构建了含有82944个克隆的甘蓝型油菜的BAC基因组文库.从文库中随机挑取克隆进行DNA长度检测,BAC克隆平均插入片段大小为80 kb,覆盖甘蓝型油菜基因组的5.1倍.随机挑取108克隆进行继代培养100代,分离质粒酶切检测表明不存在插入片段丢失现象,表明该文库的克隆在大肠杆菌中稳定存在;以与硼高效基因相连     

红莲型水稻不育系和保持系线粒体基因组BAC文库的构建

以红莲型(HL)细胞质雄性不育系和保持系为材料, 构建了水稻线粒体基因组的BAC文库. 每个文库保存约2300个菌落, 外源插入片段介于9～25 kb之间. 以线粒体基因为探针对文库进行菌落原位杂交验证, 均筛选到了阳性克隆. 构建的两个文库为进一步研究水稻线粒体基因组的结构特点, 为克隆与红莲型水稻细胞质雄性不育相关的线粒体基     

长雄野生稻(Oryza longistaminata)全基因组Fosmid文库构建

长雄野生稻(O.longistaminata)起源于非洲,具有和亚洲栽培稻相同的AA基因组,是栽培稻改良的重要遗传资源。本研究构建了长雄野生稻全基因组fosmid文库,共获得33.6万克隆,文库的平均插入片段大小约为40kb,其中94.7%的克隆插入片段大小在30~50kb之间。挑取其中约11万克隆并保存,可覆盖10倍栽培稻基因组,对任意基因或序列的筛选概率达到了99.99%。将剩余的22万个克隆进行了末端配对测序,显示其有助于长雄野生稻全基因组测序的拼接。所构建的fosmid文库为筛选和克隆长雄野生稻的有利基因提供了研究材料。     

海岛棉品种根部黄萎病菌诱导表达全长cDNA文库的构建

以海岛棉品种 712 4黄萎病菌接种前后的根部组织为材料 ,构建的黄萎病菌诱导表达的全长c DNA文库。该文库的克隆数目为 1.15×10 7pfu,插入片段的大小在 0 .5～ 6kb之间 ,文库的阳性克隆子的比例为 84.7%。该文库可以用于抗黄萎病基因的克隆及其相关研究。在文中作者同时对棉花的文库构建所应该注意的事项进行了讨论。     

山羊基因组文库的构建研究

构建了山羊基因组文库,为筛选山羊乳蛋白基因,构建山羊乳蛋白基因定点整合的转基因敲入载体奠定基础。全血提取基因组DNA,Sau3AΙ部分酶切,分级分离回收15~23 kb片段,将片段插入Lambda BlueSTAR BamHΙ vector,连接并包装后,NotI酶切鉴定。结果表明,文库滴度为3.4×106;共得到1.7×106个有效克隆,插入片断长度在15~23kb范围,成功构建了西农萨能奶山羊基因组文库。     

棉花细菌人工染色体文库构建的方法优化

以我国抗病、优质、丰产的棉花优良品种中棉所12号为材料,对棉花细菌人工染色体(BAC)文库构建过程中的一些关键技术,如plug的制备、DNA的部分消化、酶切片段的选择、插入片段与载体的摩尔比值、连接产物的浓缩等进行了研究,建立了构建棉花BAC文库的适宜方法体系。依照该方法初步构建了含有38000个克隆的棉花BAC文库。经检测,插入片段平均大小约为120kb,蓝斑率小于0.5%,空载率小于1%。插入片段与载体的最适摩尔比为1∶15,一次转化可以获得约2000个克隆,cfu·μl 1高达4。该方法为进一步构建中棉所12号多倍基因组的BAC文库、从而进行棉花基因组有关研究奠定了基础。     

大豆叶片全长cDNA文库的构建与鉴定

以大豆绥农14第一个三出复叶幼叶为材料提取mRNA,利用SMART技术合成了全长cDNA,经限制性内切酶SfiA和SfiB消化后的cDNA克隆到质粒载体pDNR-LIB中,建成大豆叶片全长cDNA文库。文库容量1·2×106,重组率接近100%。对随机挑取的克隆进行菌液PCR鉴定,插入片断大小范围为0·25~2·0kb,主要集中在0·5~1·5kb,插入片断平均大小为0·9kb,这说明文库质量可保证大规模全长cDNA的获得。     

中国水仙BAC文库构建的研究

为更深入地挖掘中国水仙的基因组信息,筛选与中国水仙品质相关的功能基因,以中国水仙品种‘金盏银台’的黄化叶片为材料,采用改良Zhang法获得高分子量核DNA,经酶切、连接和转化,首次构建了中国水仙基因组BAC文库。结果表明,采用改良zhang法获取的核DNA分子量大于1 Mb,适合BAC文库的构建;优化了连接、转化体系,发现载体和插入片段的摩尔比为5:1时,连接、转化效率最高;经检测,该文库包括69120个克隆,插入片段的平均大小约87 kb,空载率小于1%,大约50%的克隆大小在80~90 kb之间;Southern blot结果表明该文库未受到细胞器DNA的污染。     

甘蓝基因组细菌人工染色体文库的构建

细菌人工染色体（ BAC）文库是克隆甘蓝抗病优质重要基因的基础,以抗枯萎病、富含硫代葡萄糖苷的结球甘蓝自交系R4P1为材料,美国Epicentre公司的CopyControl TM pCC1BACTM为载体,构建了甘蓝细菌人工染色体文库。该文库有73344个克隆,插入片段平均大小约97 kb,空载率＜3％,覆盖甘蓝基因组约10．9倍,筛选到甘蓝任一基因的概率为99．99％,这些结果表明,构建的文库质量较好,可用于后续分析。构建的甘蓝BAC文库不仅可用于枯萎病基因的克隆,而且为克隆其他重要的功能基因及基因组学等的研究奠定了基础。     

陆地棉雄性不育恢复系18R的BAC文库构建

 18R雄性不育恢复系农艺性状优良,恢复性状稳定,对不育系能够100%恢复,是研究棉花三系互作的重要材料。本研究以pCC1BAC(BamHI)为载体,构建了18R的细菌人工染色体（BAC）文库。建立的文库包含139,200个BAC克隆。分析结果表明, BAC文库DNA插入片段为50～200 kb,91%的克隆插入片段为80～150 kb,平均102 kb,空载率<2%,覆盖6.3倍基因组。     

Construction and characterization of a BAC library of soybean

We have constructed a soybean (Glycine max (L.) Merrill) bacterial artificial chromosome (BAC) library from green leaf protoplasts of the cultivar, Misuzudaizu. The library contains 53,760 clones with an average insert size of 116 kb. About 2.9% chloroplast DNA origin was revealed by PCR and colony hybridization. Apart from 2.8% clones having no insert, this library represents 5.2 genome equivalents. With this genome coverage, the probability of having any DNA sequence represented in the library is higher than 99.5%. Three-dimensional pools of the BAC library in combination with the use of a high efficiency genome scanning (HEGS) electrophoresis facilitate rapid and efficient PCR-based screening. An average of five positive clones were identified after screening the BAC library with SSR and STS markers. BAC-end walking was performed for three SSR associated BACs. This library will provide a good resource for positional cloning of agronomically and biologically important QTL genes that Misuzudaizu possesses.     

水稻穗大小决定基因PS1的遗传分析及克隆

穗大小是影响水稻产量的重要农艺性状之一。本研究在水稻粳稻品种"中花11号"T-DNA插入突变体库中鉴定了一个植株略矮、穗长变短25%、一次枝梗和二次枝梗数目分别减少33%和80%、且粒型变异的突变体。T-DNA标签共分离检测表明:该突变体的表型与T-DNA插入无关。通过与籼稻品种"珍汕97"配置杂交组合构建遗传作图群体,F2杂合后代符合经典孟德尔遗传分离比3:1,证明突变性状受一对隐性基因PS1(Panicle Size 1)所控制。采用图位克隆的方法,将基因PS1初步定位在第11号染色体短臂上的IN44和IN50标记之间,两标记物理图距为105 kb。对候选基因进行进一步的表达量分析、比较扩增及测序发现基因LOC_Os11g12740(即SP1)可能是本研究的PS1基因。本研究为进一步分离克隆PS1基因及对水稻穗大小发育的深入研究提供依据。     

高抗黑胫病烤烟BAC文库的构建及分析

烟草是重要的模式植物。本研究利用pIndigoBAC536-S载体及Hind III限制性内切酶酶解烟草基因组DNA的方法,构建了烟草新品系14-60的细菌人工染色体(BAC)文库。该文库共包含414,720个克隆,保存在1080块384板中。随机挑选的120个烟草BAC克隆检测结果表明,外源插入片段大小为97.0～145.5 kb,平均约为123 kb,空载率极低(0),覆盖烟草基因组11倍。用烟草hem A基因、eIF4E-1基因、NtFT基因的特异引物进一步验证,该文库质量高、可用性强,为烟草黑胫病抗性基因的克隆以及其他重要农艺性状和品质性状等功能基因克隆研究提供了基础资源。     

水稻短根相关基因OsKSR2的定位

根系是将植物固定于土壤及吸收利用水分和养分的重要器官。本研究从甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate,EMS)诱变的籼稻Kasalath突变体库中,筛选到一个水稻根系发育缺陷的突变体,命名为Osksr2 (Oryza sativa kasalath short root 2),该突变体植株整体矮小,主根、不定根和侧根的伸长都受到抑制。遗传分析表明该突变性状由1对隐性核基因控制,将该基因命名为OsKSR2。将Osksr2纯合体与粳稻日本晴杂交构建F₂群体,利用已经公布的水稻SSR标记和自行设计的STS标记进行基因定位,将OsKSR2定位在水稻第8染色体STS标记S27887与S27988之间约101 kb的范围内。通过水稻基因组注释系统共预测到17个开放阅读框(ORF),没有已知的与根系发育相关的基因。对OsKSR2的定位将为进一步克隆该基因和阐明水稻根系伸长的分子机理奠定基础。     

一个新的水稻短根毛突变体的遗传分析和基因定位

根毛是植物吸收水分和养分的重要器官。本研究从T-DNA突变体库中获得一个以中花11为遗传背景的水稻短根毛突变体, 命名为ossrh3 (Oryza sativa short root hair 3)。该突变体的根毛伸长严重受阻, 并且伴随株高、主根长、侧根长和侧根数目等性状的改变。遗传分析表明该突变性状受1对隐性单基因控制, 利用ossrh3纯合体和籼稻品种Kasalath杂交构建F₂定位群体, 利用已公布的水稻SSR (simple sequence repeat)和自行设计的STS (sequence- tagged site)标记, 最终将OsSRH3定位在水稻第1染色体上的标记S38978和S39016之间, 物理距离约为37.7 kb, 包含8个候选基因, 为进一步克隆OsSRH3基因和研究禾本科作物根毛发育的分子调控机理提供了依据。     

一个水稻黄绿叶突变基因的定位和遗传研究

从粳稻品种日本晴经⁶⁰Co诱变的M₁材料中发现一个黄绿叶突变体, 其叶片从萌发到三叶前期表现白化, 三叶后期开始转为黄绿叶, 直到衰老。遗传分析表明, 该突变表型受一对隐性核基因控制, 将该黄绿叶突变体暂定名为ygl8951。与野生型相比, ygl8951的叶绿素含量与类胡萝卜素含量显著降低。电子显微镜观察表明ygl8951内叶绿体数量明显减少, 叶绿体内没有基粒类囊体, 只有类似间质类囊体结构。基因表达定量分析表明, 突变体中光系统I和光系统II基因表达水平明显下调, 核糖体结构基因和质体编码的RNA聚合酶亚基基因表达明显上调。利用ygl8951与籼稻品种黄华占杂交获得的F₂分离群体, 将该基因定位于水稻第6染色体上的In/Del标记607489与607611之间, 物理距离191 kb的范围内, 通过分析确认该基因为一个新的调控叶色的基因。     

高纤维强力棉花种质系苏远7235 BAC文库的构建

苏远7235是我国利用异常棉等多个野生种创造的高纤维强力棉花种质系,是开展棉花纤维品质研究的重要材料。本研究以pIndigoBAC-5(HindIII-cloning ready)为载体,构建了苏远7235的细菌人工染色体(Bacterial Artificial Chromosome,BAC)文库,该文库包含30336个BAC克隆。分析结果表明,重组克隆苏远7235 DNA插入片段为50-140 kb,平均120 kb,空载率2.1%,89.6%的克隆插入片段大于100 kb。     

雷蒙德氏棉叶绿体基因组Fosmid文库构建

 采用高盐、低pH值法提取雷蒙德氏棉叶绿体DNA;通过物理剪切法获得随机断裂的DNA片段;剪切片段末端、补平修饰后与pCC1FOS载体连接;用噬菌体包装蛋白包装重组DNA,侵染大肠杆菌EPI300,构建了雷蒙德氏棉叶绿体基因组文库。对于叶绿体DNA剪切,以1 mL注射器中等速度吸打18次为最佳参数。叶绿体基因组Fosmid文库滴度为1×10⁴ cfu·mL^-1,插入片段大小平均为38 kb,最终筛选出39个克隆用于后续研究,覆盖叶绿体基因组9.2倍。以叶绿体特异标记筛选出能够覆盖雷蒙德氏棉叶绿体全基因组的6个克隆：F66,F46,F28,F8,F55和F3,为基因组结构和功能基因分析提供了良好的基础。