角蛋白启动子荧光素酶表达载体的构建及其表达活性分析

角蛋白14(K14)和角蛋白5(K5)主要在毛囊基质和复层鳞状上皮基底层的角质细胞里表达。这两个启动子已被广泛应用于毛囊特异表达外源基因的转基因小鼠模型的研究中,为了能将其应用于转基因绵羊生产,探讨基因对绵羊毛囊发育的影响,从人基因组中克隆得到K14和K5启动子,利用不同的报告基因在细胞水平分析各启动子的表达活性。结果表明,这两个启动子在不同细胞系中都能驱动外源基因的表达,而且K14启动子在小鼠皮肤细胞系JB6-C41中的表达活性高于其他细胞。     

心力衰竭患者血清肿瘤坏死因子、白细胞介素6和白细胞介素6受体水平的测定及临床意义

目的：探讨心力衰竭(CHF)患者血清肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素6(IL—6)和白细胞介素6受体(IL—6R)水平的变化及临床意义。方法：采用双抗体夹心法ELISA检到42例CHF患者血清TNF、IL—6和IL—6R水平，以30例正常人作比较，分析不同病情的CHF患者间血清TNF、IL—6和IL—6R水平的变化及CHF患者血清IL—6水平与IL—6R之间的关系。结果：CHF患者血清TNF、IL—6和IL—6R水平均显著高于正常对照组(均P＜0．001)，不同心衰程度的CHF患者间血清TNF、IL—6和IL—6R水平均差异有显著性(F分别为290．36、134．15和109．86、均P＜O．01)，并随心衰的加重而增高(P＜O．O02--O．O01)。CHF患者血清TNF水平与IL—6成正相关(相关系数r＝O．786，t＝8．041，P＜0．001)，IL—6水平与IL—6R亦成正相关(r＝O．744，t＝7．045，P＜O．O01)。结论：TNF、IL—6和IL—6R可能参与CHF的发病及病理变化过程。     

鸭IFN-β启动子及其NF-κB结合位点荧光素酶报告质粒的构建与活性检测

通过PCR方法,扩增得到鸭I型干扰素β(IFN-β)基因启动子功能区域的DNA片段和其4个重复NF-κB结合位点的DNA片段,亚克隆到含萤火虫荧光素酶报告基因pGL4.2-basic载体上,构建了包含鸭IFN-β启动子及其NF-κB结合位点的荧光素酶报告质粒pduIFN-β-luc和4×NF-κB-luc;分别将构建的两个报告质粒与海肾荧光素酶内参质粒pRL-TK用JetPEITM转染试剂共转染至鸭胚成纤维细胞系DEF,在转染24 h后,用poly(I∶C)刺激转染细胞,结果表明,与未刺激组相比,刺激组的荧光素酶活性均显著增加。为进一步研究鸭天然免疫信号通路提供了重要的研究工具。     

牛Nramp1基因启动子的克隆及其活性分析

 【目的】牛Nramp1基因是主要的抗病候选基因,但其转录调控的分子机制尚不清楚。本研究欲确定牛Nramp1基因的启动子区域,找到启动子核心序列和主要的调控区,探索Nramp1基因表达机制。【方法】采用基因克隆、DNA测序、半定量RT-PCR和荧光素酶报告基因系统等技术手段,构建牛Nramp1基因5′侧翼区长片段及固定3′端的不同节段的pEGFP-N1和/或pGL3重组质粒,分别转染293T和RAW264.7细胞,并进行脂多糖(LPS)诱导,对不同片段的启动子活性进行定性和定量测定。【结果】牛Nramp1基因5′侧翼区长片段具有较强的启动子活性,+58—-89区域具有基本的启动子功能,+58—-1 748启动子活性最强。进一步研究表明,-89—-205 bp区域、 -278—-1 495 bp区域存在着正调控元件,在-205—-278 bp区域内存在着负调控元件;另外,LPS能显著增强启动子活性,其诱导牛Nramp1基因的表达具有细胞特异性和剂量依赖性。【结论】成功构建了含推测的牛Nramp1基因启动子片段的重组报告基因载体, 确定了启动子核心区域和主要的调控区域。     

牛白细胞介素-18基因原核表达载体的构建

根据已发表的IL-18蛋白cDNA序列保守区设计一对特异性引物,应用RT-PCR技术从ConA活化的牛外周血单核细胞中扩增到编码牛IL-18蛋白基因,其大小为582 bp。将该基因克隆到pMD18-T载体中,经序列测定表明该基因与gengbank上发表的牛白细胞介素-18基因序列同源性为98%。将该基因从重组pMD-gIL-18质粒中亚克隆到表达载体pET-32 a（＋）质粒中,构建原核表达重组质粒,经酶切和PCR鉴定后表明构建的重组质粒为阳性。     

心力衰竭患者血清白细胞介素6水平的变化及意义

目的 :检测心力衰竭 (心衰 )患者血清白细胞介素 ( IL- 6)水平 ,并比较不同心衰程度间的血清 IL- 6变化。方法 :采用双抗体夹心法 ( ELISA)检测 45例心衰患者血清 IL- 6的水平 ,与 30例正常人 ( NC)血清 IL- 6的水平比较 ,并对心衰程度不同的患者血清 IL- 6的水平进行比较。结果 :心衰患者血清 IL - 6水平明显高于对照组 ( P<0 .0 1 ) ,且随心衰程度的增加而增高 ( P<0 .0 0 1 )。结论 :心衰患者血清IL- 6可能参与心衰的发生及病理变化过程 ,血清 IL - 6水平可作为判断心衰患者病情的有效指标之一。     

急性脑梗塞与血清白细胞介素—6关系的初步探讨

用双抗体夹心ＥＬＩＳＡ法对４６例急性脑梗塞患者血清ＩＬ－６含量作了检测，结果显示：脑梗塞急性期和恢复期两组均明显高于健康人对照组（Ｐ＜０．００５，Ｐ＜０．０１）；恢复期组略低于急性期组，但无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。急性期血清ＩＬ－６含量与脑梗塞估测体积呈正相关关系（ｒ＝０．６４，Ｐ＜０．０５），而与脑梗塞发生部位无关。脑梗塞体积越大，血清ＩＬ－６值越大，提示血清ＩＬ－６含量的测定可能作为早期判断急性脑梗塞脑损害程度的指标。     

绵羊IL-6启动子的克隆及pIL6-TLR4载体构建

为生产抗病转基因绵羊,并确保转基因羊的安全性。克隆绵羊IL-6启动子序列,以IL-6为启动子构建TLR4过表达载体,转染绵羊成纤维细胞验证功能。用1μg·L-1的LPS刺激转染后的绵羊成纤维细胞,利用q PCR技术和ELISA方法检测受LPS刺激后的成纤维细胞TLR4 m RNA表达量和TLR4蛋白表达量。结果表明,转染后的TLR4 m RNA表达量在2、4、24、48 h显著高于对照组(P0.05),其中2、4、24 h极显著高于对照组(P0.01),TLR4蛋白表达量始终高于对照组。说明p IL6-TLR4过表达载体构建成功。     

慢性肝病患者血清白细胞介素-6的测定及其临床意义

病毒性肝炎的发病机理与肝炎病毒侵袭肝细胞后导致的免疫应答及免疫调节紊乱有关,白细胞介素６（ＩＬ６）是由多种免疫细胞分泌的细胞因子,在调节免疫网络中起着关键作用。为了解慢性肝病患者血清ＩＬ６的水平变化,笔者对１０７例慢性病毒性肝炎患者的血清ＩＬ６作了检测,并分析其临床意义。１　病例与方法１．１　病例选择　１０７例患者均来自我院１９９５年１月～１９９６年１０月住院病人,其中男７２例,女３５例,年龄１８～８０岁,平均３６．４岁。１０７例均依据１９９５年（北京）第五次全国传染病寄生虫病学术会议修…     

棉纤维特异启动子E6基因表达载体的构建

以棉花cDNA为模板克隆了棉花纤维特异启动子E6,从质粒RDB1上切下植物的35S启动子,置换上棉纤维特异启动子E6.经PCR及酶切鉴定,得到了含E6基因的植物表达载体.     

团头鲂jphs家族基因的克隆及表达分析

以团头鲂为研究对象,扩增获得Junctophilin(Jph)家族4个成员,jph1a、jph1b、jph2和jph3的cDNA编码序列,分别为2 031、2 016、2 358和2361 bp,分别编码676、671、785和786 aa。团头鲂jphs均由5个外显子和4个内含子组成,与大多数物种的JPHs基因结构相似;结构域预测显示出8个MORN和1个TM结构域,且蛋白多序列比对分析显示Jphs在进化上非常保守。基于qRT-PCR(quantitative real-time PCR)分析显示,这4个基因呈现出组织特异性表达,其中jph1a、jph1b和jph2主要在肌肉和心脏中表达,而jph3主要表达于心脏、血液和大脑。在早期发育过程中,jph1a、jph1b、jph2和jph3的mRNA表达模式类似,分别在原肠胚期、心跳期和25 dph(days post hatching)达到高峰。综上研究结果表明,鱼类jphs基因在心脏和肌肉等组织中发挥重要作用,并且其功能可能不同于哺乳动物。     

基于线粒体D-loop区分析团头鲂四个养殖群体的遗传多样性

为了解安徽省团头鲂(Megalobrama amblycephala)种质资源现状,本研究基于来自4个群体的120个样本的线粒体D-loop区,分析了其遗传多样性及群体结构。遗传多样性分析结果表明:共检测到16个变异位点和14种单倍型,单倍型多样指数为0.20-0.47,核苷酸多样性指数为0.00024-0.00224。群体结构分析显示:群体间发生了不同程度的分化,分化系数为-0.0138至0.219,AMOVA分析表明变异来源全部来自个体间,单倍型网络图显示群体间可通过单倍型Hap_2连接。综上所述,4个群体可能经历了奠基者事件,遗传多样性丢失严重,群体间缺乏分化。本研究揭示了4个团头鲂群体的遗传背景,可以为安徽省团头鲂种质资源保护与利用提供参考依据。     

团头鲂Dmrt4基因的克隆与表达分析

为研究团头鲂Dmrt4基因的可能作用,采用RACE-PCR技术克隆了团头鲂卵巢Dmrt4基因的cDNA全长序列,采用实时荧光定量PCR技术对其胚胎及出膜后30 d内各期、成鱼不同组织、雌雄性腺各分期的表达进行研究。结果表明,团头鲂Dmrt4基因至少存在2种不同的剪接形式,分别命名为Dmrt4a 和Dmrt4b。其中,Dmrt4a cDNA全长1 265 bp,编码352个氨基酸,含DM和DMA 2个结构域;Dmrt4b cDNA全长1 081 bp,编码281个氨基酸,仅含DMA结构域。氨基酸序列同源性分析显示,团头鲂Dmrt4与牙鲆、奥利亚罗非鱼的同源性最高。实时荧光定量PCR结果表明,Dmrt4基因在团头鲂胚胎期至出膜后30 d内均有表达,且在受精后32 h的表达量最高;成鱼卵巢的表达量显著高于其他组织（P<0.01）;Ⅱ期卵巢的表达量显著高于其他时期,也显著高于精巢各分期（P<0.01）。上述结果表明,Dmrt4基因可能对团头鲂卵母细胞初期的生长起到重要作用,在雌鱼性腺发育过程中亦发挥一定的作用。     

风干武昌鱼中微生物变化及理化性质的分析

[目的]分析风干武昌鱼生产过程中微生物数量和理化指标的变化。[方法]按总茵数、乳酸菌、葡萄球菌和酵母茵几个大类研究其微生物变化情况;理化方面,分析了pH、水分含量、水溶性固形物、水溶性蛋白氮及挥发性盐基氮几项重要指标。[结果]乳酸菌为风干武昌鱼发酵过程中的优势菌群;各种微生物复杂变化的同时导致产品pH和水分含量下降,水溶性固形物和水溶性蛋白氮的含量增加;产品的挥发性盐基氮含量符合国家标准。[结论]该研究为风干武昌鱼的标准化生产体系的建立以及稳定生产奠定了基础。     

梁子湖团头鲂的年龄和生长特征

为了解梁子湖团头鲂Megalobrama amblycephala的种群现状,于2011年7月-2012年6月采集310尾样本,以鳞片作为鉴定材料,对团头鲂的年龄和生长特征进行研究.结果表明：团头鲂年轮环纹呈疏密切割型,偶见幼轮,3龄以上个体可见生殖痕;种群体长分布范围为74.1～362.8mm,优势体长为180 ～320 mm,占群体总数的81.29％;群体由1～6龄共6个龄组组成,优势年龄组为3～4龄,占总渔获物的55.48％;体长（L）与鳞径（R）呈线性关系,关系方程为L=34.656R＋25.21;体长与体质量（W）呈幂函数关系,关系方程为W=1×10-5L3.1228,幂指数接近3,属匀速生长型;拟合Von Bertalanffy方程为Lt=452.36（1-e-0.2407（t＋0.2813））,Wt=2034.61（1-e-0.2407（t＋0.2813））3.1228,生长拐点时间ti=4.46龄,此时体长Li=307.78 mm,体质量Wi=607.70 g.研究表明,梁子湖的团头鲂资源量日趋减少,种群出现了明显的小型化趋势,应当采取保护措施,以利于资源的恢复和增殖.     

3个群体团头鲂mtDNA D-loop区段的限制性片断长度多态性分析

对采自于天津市蓟县、宁河县以及山西省太原市的3个人工繁殖群体共136尾团头鲂Megalobrama amblycephala的mtDNA D-loop区段进行PCR扩增,用14种核酸内切限制酶酶切后,进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析。结果表明:在14种内切酶中,9种有酶切位点;蓟县和太原两个群体(90尾鱼)中,个体间没有变异,只有一种单倍型,两群体内的单倍型多样性指数和核苷酸多样性指数均为0;宁河县群体46尾鱼中存在2种单倍型,有2个个体与蓟县和太原群体的XspⅠ和MboⅠ酶切图谱不同,其单倍型多样性指数和核苷酸多样性指数分别为0.0850、0.001312;宁河县群体与蓟县(或太原)群体间的核苷酸歧化距离以及Rogers遗传距离分别为0.000015和0.0435;χ2检验结果显示,3个群体间的遗传差异不显著(P>0.05)。可以认为团头鲂mtDNA D-loop区段的遗传多样性很低。     

团头鲂形态发育相关基因HoxB1b的克隆及功能研究

脊椎动物Hox族基因是一类重要的生长和发育调控基因,它编码具有螺旋—转角—螺旋结构的转录因子,能与下游靶基因特定区域结合并激活表达,从而调节脊椎动物胚胎发育过程中前后轴的形态建成。利用cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆了团头鲂(Megalobrama amblycephala)HoxB1b基因的全长cDNA序列,并研究了该基因的表达模式。结果表明:(1)团头鲂HoxB1b基因cDNA全长为1 479 bp,其中包括一个编码306个氨基酸残基的921 bp阅读框,聚类分析结果表明,该基因与斑马鱼、红鳍东方鲀、青鳉的相似度分别为89%、45%、40%,在脊椎动物中具有一定的保守性;(2)RT-PCR分析结果显示,HoxB1b在团头鲂胚胎发育过程的各时期均有稳定表达,但在成熟卵中未检测到该基因的表达,表明该基因属非母源表达类型。进一步的整胚原位杂交结果显示,HoxB1b在团头鲂不同时期胚胎存在明显的空间表达差异,受精后20 h(20 hours post fertilization,20hpf)胚胎主要在后脑表达,受精后40 h(40hpf)胚胎除了在后脑表达外,在胸鳍也检测到表达;(3)HoxB1b基因在团头...     

三角鲂与团头鲂正反杂交F1的遗传性状

采用聚类分析、主在分分析和判别分析3种数理统计方法，对团头舫、三角鲂及其正反杂交F1的比例性状和框架参数进行分析，探讨了亲本形态性状在子代中的遗传传递情况。结果表明：（1）正反交F1形态都表现出较多的母性遗传特征，但三角鲂母本对杂交F1遗传特征的影响强于团头鲂母本。（2）躯干部特征、头尾轴特征及背棘等为区分团头鲂、三角鲂及其正反杂交F1的重要因子。     

三角鲂与团头鲂正反杂交F1的遗传性状

采用聚类分析、主在分分析和判别分析3种数理统计方法，对团头舫、三角鲂及其正反杂交F1的比例性状和框架参数进行分析，探讨了亲本形态性状在子代中的遗传传递情况。结果表明：（1）正反交F1形态都表现出较多的母性遗传特征，但三角鲂母本对杂交F1遗传特征的影响强于团头鲂母本。（2）躯干部特征、头尾轴特征及背棘等为区分团头鲂、三角鲂及其正反杂交F1的重要因子。     

连续三代减数分裂雌核发育团头鲂的遗传多样性分析和RAPD鉴别方法的建立

为评估连续三代减数分裂雌核发育团头鲂群体的遗传多样性和遗传纯合度,寻找区分不同团头鲂育种群体(团头鲂浦江1号选育系、连续三代减数分裂雌核发育团头鲂群体)的稳定的分子遗传标记,本研究以团头鲂(Megalobrama amblycephala)浦江1号选育系F₉群体为对照组,利用39条多态性RAPD随机引物比较分析了团头鲂人工减数分裂雌核发育一代群体(G₁)、二代群体(G₂)和三代群体(G₃)的遗传多样性和遗传结构,获得了用于鉴别不同团头鲂育种群体(F₉、G₁、G₂、G₃)的稳定的RAPD分子遗传标记,探讨了连续多代诱导减数分裂雌核发育对团头鲂基因纯化的效果。结果显示,39条RAPD随机引物在F₉、G₁、G₂和G₃群体中扩增条带总数分别为213条、202条、200条和190条,F₉、G₁、G₂和G₃群体的多态位点比例分别为36.15%、35.64%、27.00%和26.84%,F₉、G₁、G₂和G₃群体的Shannon信息指数分别为0.207 9、0.185 7、0.146 1和0.138 3。3个雌核发育群体的遗传多样性水平(多态位点比例、Shannon信息指数)均明显低于对照组F₉群体,随着雌核发育世代数的增加,遗传多样性水平呈现逐代降低的趋势,即G₁>G₂>G₃。4个群体的群体内个体间的平均遗传相似系数为0.828 5~0.906 0,3个雌核发育群体的群体内个体间平均遗传相似系数均明显高于对照组F₉群体;群体内个体间的平均遗传相似系数呈现随雌核发育世代数的增加而升高的趋势,即G₃>G₂>G₁。群体间成对F_ST值为0.269 2~0.419 5,经置换检验得到的F_ST值的P值为0.000 0~0.009 0,均达到极显著水平(P<0.01),表明4个群体间存在极显著的遗传分化。有5条随机引物在群体间产生了特异DNA片段,其中,4条随机引物(S3、S40、S58和S75)可用于区分G₃群体和其他3个群体(F₉、G₁和G₂),引物S3的鉴别可靠性最高;仅1条随机引物(S71)能用于区分G₂群体和其他3个群体(F₉、G₁和G₃)。本研究结果表明,连续多代的人工减数分裂雌核发育诱导已对团头鲂育种群体产生以下两方面的影响:一方面,遗传多样性明显降低,并呈现逐代降低的趋势;另一方面,遗传纯度明显升高,并呈现逐代升高的趋势。连续多代减数分裂雌核发育能显著加快团头鲂基因的纯合速度,雌核发育三代群体(G₃)已经是一个遗传一致性较高的高纯品系。