异育银鲫中科3号MSTN基因的克隆与序列分析

采用同源克隆和末端快速扩增(rapid amplication of c DNA ends,RACE)方法分离克隆了异育银鲫(Allogyogenetics crucian carp)中科3号肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因全长DNA,得到3 394 bp全长的DNA,包含3段外显子和2段内含子,其中2 098 bp的全长c DNA在NCBI数据库中进行序列比对后,确定为异育银鲫中科3号MSTN基因。对推测的MSTN基因氨基酸序列进行同源性比对和系统分析显示:MSTN基因在异育银鲫与斑马鱼及其他鱼类间的氨基酸序列相似度为73.5%~98.0%,与鲤鱼MSTN基因相似度最高(98.0%),不同物种间MSTN的氨基酸序列较为保守。用半定量RT-PCR检测MSTN基因在异育银鲫心、肠、肌、脑、鳃和肝的相对表达量结果表明,MSTN基因在脑中含量最高,其次是肌、鳃、心、肠,在肝脏中含量最低。     

蜡梅金属硫蛋白基因的克隆与原核表达

金属硫蛋白(metallothionein,MT)是一类富含Cys,能够结合重金属的低分子量蛋白质,广泛分布于生物界。在构建好的蜡梅花cDNA文库并进行EST分析的基础上,通过随机克隆测序得到了1个蜡梅金属硫蛋白的cDNA,命名为CpMetallothionein(CpMT)。CpMTcDNA全长为1083bp,基因内部含有一长度为240bp的开放阅读框,可编码79个氨基酸残基。将CpMT插入原核表达载体pET-32a,并转化Origami2感受态细胞。诱导表达产物经SDS-PAGE结果显示,目的蛋白约为30kD。表达的融合蛋白以包涵体和可溶性蛋白2种形式存在,用His-Bind蛋白纯化回收试剂盒对其进行纯化回收,得到了高纯度蛋白,为今后研究奠定基础。     

人F3-Restin基因的克隆与表达

目的:克隆人F3-Restin基因,表达有生物学活性的新型融合蛋白F3-Restin。方法:采用亚克隆技术构建融合表达载体PET32a(+)-F3-Restin,原核诱导表达,经Ni2+-NTA琼脂糖树脂亲和层析纯化,透析去盐。结果:在20℃、10h的条件下IPTG原核诱导表达、纯化,得到分子量约为40kD的高纯度的可溶性蛋白F3-Restin。结论:成功地克隆了人F3-Restin基因,构建融合表达载体PET32a(+)-F3-Restin,并表达出新型融合蛋白F3-Restin,为进一步研究F3-Restin蛋白抗肿瘤血管生长的活性及作用机理奠定了良好的基础。     

猪Caspase-3基因的克隆及序列分析

天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(C aspase)是与细胞凋亡有关的一类蛋白酶,其中C aspase-3是细胞凋亡的最终执行者。为了进一步研究C aspase-3的生物学功能,从PK-15细胞中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增出猪C aspase-3基因,序列分析表明克隆的C aspase-3基因与G enB ank上登录的猪C aspase-3基因核苷酸与推导的氨基酸序列同源性分别为98.9%和98.6%,与人和鼠的C aspase-3基因核苷酸、氨基酸序列同源性分别为88.6%、83.5%和87.8%、86.7%,而且猪、人、鼠的C aspase-3上的催化和剪切位点都极为保守。     

茄子抗逆相关基因SmDREB3的克隆和表达分析

DREB(dehydration responsive element binding protein)基因在植物非生物胁迫的应激反应中具有非常重要的作用,本研究运用同源克隆的方法从‘YZ-14’紫茄品种中分离克隆得到了一个DREB基因,因其与番茄和马铃薯中DREB3基因的相似度很高,所以命名为SmDREB3。SmDREB3基因的cDNA全长为887bp,开放阅读框(ORF)长度为777bp,可以编码一个含有259个氨基酸的蛋白,与同科作物马铃薯中DREB基因序列的相似性高达90%,与番茄中DREB基因序列的相似性也能达到88%。成熟蛋白等电点为6.39,分子量为28.665kDa。RT-qPCR实验结果表明,SmDREB基因在紫茄的各个组织中都会表达,但表达水平具有组织特异性,其在果皮中的表达量最高,其次为叶和果肉,而在根、花和茎中的表达量相对较低。本研究为深入研究茄子的抗逆机制以及培育抗逆茄子新品种方面提供了理论基础。     

鸭病毒性肝炎病毒VP3基因的克隆与表达

提取鸭肝炎病毒RNA作为模板,进行RT-PCR扩增,得到723 bp的VP3基因,将纯化的VP3基因片段与pMD18-T载体进行连接,构建DHVVP3基因克隆重组质粒。然后定向插入到pET-32a(+)表达载体,筛选获得原核表达载体pET-32a-VP3。用IPTG诱导表达,经SDS-PAGE电泳和Western blot分析表明,VP3蛋白得到正确表达,其分子量为47.1 ku,表达的蛋白能与鸭肝炎阳性血清发生特异性反应。     

毛白杨PtYABBY基因家族3个成员的克隆与表达分析

  目的  YABBY是高等植物中特有的转录因子家族,在侧生器官发育和开花过程中发挥重要作用。本研究对毛白杨PtYABBY基因进行克隆和生物信息学分析,并对雌雄花芽8个关键发育时期和根茎叶等组织中PtYABBY基因表达模式进行探究,以期为阐明PtYABBY基因在毛白杨侧生器官发育过程中的功能奠定前期基础。  方法  以毛白杨为试材,采用同源基因克隆法从毛白杨中分离FILAMENTOUS FLOWER (FIL)/YABBY3 (YAB3)同源基因PtYABBY3、PtYABBY4和PtYABBY11的编码区序列,并开展生物信息学分析。通过qRT-PCR研究这3个基因在雌雄花芽8个发育时期及根、茎、幼叶、成熟叶片中的表达规律。  结果  PtYABBY3、PtYABBY4和PtYABBY11编码区长度分别为633、642、639 bp,分别编码210、213、212个氨基酸。所推测的氨基酸序列包含C₂C₂锌指结构域和YABBY结构域。系统进化分析进一步表明这3个基因属于FIL/YAB3亚家族成员。qRT-PCR结果显示这3个基因在根、茎、叶及8个时期雌雄花芽组织中均有表达,但PtYABBY基因间的表达水平存在明显差异。PtYABBY3表达水平在雌雄花芽发育初期下调,发育后期上调;花原基形成到休眠期内PtYABBY3在雌雄花芽中呈现相反的表达变化趋势。PtYABBY4和PtYABBY11基因在雌雄株成花诱导期表达水平最高,成花诱导到伸长期内呈现下降趋势,在雄花芽休眠期和小孢子发生期基因表达水平无明显变化。营养组织表达量测定结果显示这3个基因在幼叶和成熟叶片中表达水平相对较高,根系中表达量最低。  结论  YABBY基因家族成员PtYABBY3、PtYABBY4和PtYABBY11同属FIL/YAB3亚类,在毛白杨雌雄花芽发育的8个时期中表达水平存在较大差异,且在叶片和花芽中表达量较高,表明其可能与叶片和花芽发育相关。本研究为今后深入研究YABBY家族成员在杨树器官生长发育过程中的作用奠定基础。      

家蚕Bmugt3基因cDNA序列的克隆、表达与序列分析

【目的】克隆分析家蚕Bmugt 3基因cDNA序列,并对其在家蚕不同组织中的表达进行检测。【方法】以家蚕ak1和873为供试材料,采用生物信息学方法和RT-PCR技术,对家蚕Bmugt3基因cDNA序列进行克隆和组织表达谱研究,并通过XbaⅠ和HindⅢ双酶切重组质粒,将Bmugt 3亚克隆至具有2个反向T7启动子,用于体外诱导合成双链RNA(dsRNA)的L4440载体。【结果】克隆得到了家蚕Bmugt 3基因1675bp的cDNA序列,编码462个氨基酸,编码蛋白的分子质量为52.3ku,等电点6.5;多序列比对显示,Bmugt 3基因缺失了C末端的跨膜结构域;聚类分析结果显示,其与家蚕phenol-UGT基因聚合在同一分支上。Bmugt 3基因主要在家蚕丝腺中表达。【结论】Bmugt 3基因是组织特异性表达基因,可能在家蚕类黄酮素的代谢中起作用。     

鸡TRAF3基因的克隆表达及多克隆抗体的制备

为探究鸡源肿瘤坏死因子受体相关因子3 (TRAF3)的生物学功能,对鸡源TRAF3基因进行克隆表达并制备其多克隆抗体。将鸡TRAF3基因分别克隆入原核表达载体pGEX-6P-1和真核表达载体pcDNA3.1中构建出重组原核表达载体pGEX-6P-1-TRAF3和重组真核表达载体pcDNA3.1-TRAF3。构建的原核表达载体转化入大肠埃希菌BL21后经IPTG诱导,SDS-PAGE分析表明获得GST-TRAF3的融合表达蛋白,且融合蛋白主要表达于包涵体中。将纯化的GST-TRAF3蛋白免疫小鼠制备抗GST-TRAF3多克隆抗体。间接免疫荧光及Western blot试验表明,所制备的抗TRAF3多克隆抗体不仅能与转染pcDNA3.1-TRAF3的DF-1及LMH细胞中表达的外源性TRAF3反应,而且能有效识别LMH细胞内源性的鸡源TRAF3蛋白。该研究中鸡TRAF3基因的克隆、表达及其多克隆抗体制备为后续研究鸡TRAF3的功能奠定了基础。     

大豆铁结合蛋白基因cDNA的克隆、序列分析和表达载体的构建

根据已报道的植物铁结合蛋白基因的保守序列设计引物，用RT－PCR方法，成功地从大豆总RNA中扩增出一大小为0.771kb的cDNA片断。将该片段克隆到pUCm-T载体上，测序和序列的同源怀分析表明该片断与Proudhon等（1996）报道的大豆铁结合蛋白基因的氨基酸序列同源性达95％。利用pUCm-T和pBI121载体上共同的XbaI和SacI双酶切位点，构建了克隆片段的植物表达载体pSFKna。该载体含CaMV35S启动子、NOS终止子和NPT－Ⅱ基因，在遗传转化中可用基因枪导入受体，并通过卡那霉素抗性筛选转化子。     

两种养殖密度下鲫鱼生长和免疫酶活性的比较

2011年4～11月比较了两种养殖密度(低密度和高密度)下鲫鱼的生长率和组织中超氧化物歧化酶(SOD)、碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)活性的差异.结果显示,低密度塘鲫鱼生长和免疫酶活性在4月7日低于高密度塘,而后明显高于高密度塘;两种养殖密度下,7～9月为鲫鱼的最佳生长时期.结果表明,放养密度过低会对鲫鱼早期生长和免疫力造成负面影响,放养密度过高则不利于鲫鱼后期生长和免疫力的提高.     

普安银鲫成熟卵及受精后FAS和ACC的表达

为探明普安银鲫雌鱼不同发育时期与脂代谢相关的脂肪酸合成酶(FAS)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)浓度及相对表达量的变化,以了解胚胎早期在脂质合成代谢方面的特点和规律性,采用酶联免疫分析法和实时荧光定量PCR法,测定成熟卵、受精卵、囊胚期(卵裂期胚胎)的FAS和ACC代谢水平及基因表达情况。结果表明:普安银鲫雌鱼成熟卵、受精卵和囊胚期均存在FAS和ACC,FAS含量在囊胚期显著升高(P0.05),达到(2.48±0.31)nmol/L;ACC含量上升但差异不显著(P0.05)。普安银鲫成熟卵、受精卵和囊胚期中均存在FAS和ACC基因表达,相对表达量逐渐增高,但差异均不显著(P0.05)。     

银杏类黄酮糖基转移酶基因片段克隆与分析

根据GenBank中其他植物的类黄酮糖基转移酶基因(UFGT)的保守区设计简并引物,采用RT-PCR技术从银杏中扩增出UFGT基因的部分保守序列,并利用3′-RACE PCR方法,得到了包括3′-末端在内的银杏UFGT基因片段,命名为GbUFGT-3。结果表明:该片段长度为1 064bp,其中3′-UTR长度为314bp、编码区长度为750bp,可编码249个氨基酸,该氨基酸序列具有完整的UFGT特征序列PSPG-box;BLASTp分析及系统进化树分析表明GbUFGT-3确为银杏UFGT基因的序列片段;半定量RT-PCR结果表明,GbUFGT-3是非诱导表达基因,在银杏叶片的整个发育期均有较高水平的表达,不同发育期表达量无差异。GbUFGT-3已被GenBank收录,登录序列号为JN640564.1。     

用显微注射法将绿色荧光蛋白基因导入金鱼受精卵中表达

采用显微注射法将绿色荧光蛋白（GFP）基因重组表达质粒导入金鱼受精卵中，以期获得能发绿色荧光的金鱼。结果显示，在注射的3批金鱼受精卵中（第一批4310粒，第二批3952粒，第三批4056粒），分别孵出鱼苗543、282和266尾，出苗率为17.02%、12.53%和13.52%，其中表达绿色荧光的金鱼分别为23、24和18尾，表达率为4.24%、8.51%和6.77%。荧光表达检测发现，从肌肉效应期就开始检测得到绿色荧光。     

用显微注射法将绿色荧光蛋白基因导入金鱼受精卵中表达

采用显微注射法将绿色荧光蛋白（GFP）基因重组表达质粒导入金鱼受精卵中，以期获得能发绿色荧光的金鱼。结果显示，在注射的3批金鱼受精卵中（第一批4310粒，第二批3952粒，第三批4056粒），分别孵出鱼苗543、282和266尾，出苗率为17.02%、12.53%和13.52%，其中表达绿色荧光的金鱼分别为23、24和18尾，表达率为4.24%、8.51%和6.77%。荧光表达检测发现，从肌肉效应期就开始检测得到绿色荧光。     

鲫血清转铁蛋白推导序列分析及空间结构预测

用DNA Club分析软件推导出鲫血清转铁蛋白序列,并对该序列进行分析。推导的蛋白质长度为807个氨基酸,MW约为90 kD。其中半胱氨酸43个,可以组成21对二硫键。疏水性和二级结构几率分析表明：有2个非常相似的结构域分别存在于1～390和390-807区域。旋管结构和螺旋结构的分布区域,均分别集中在上述2个区段中,同样位于2个结构域中,结构也非常类似。证实了Tf由2个同源性较高的结构域(N结构域和C结构域)组成。Tf的三级结构呈“V”字形,每个结构域又各自分为3个小的结构小区(即N1、N2、N3和C1、C2、C3)。2个糖基位于N1和C1区,呈“Y”字型结构;铁链位于N2和C2区;受体结合位点R1和R2位于N3和C3区。     

7种稻田常用杀虫剂对鲫幼鱼的急性毒性及安全性评价

为探明杀虫剂在稻田使用后对鱼类的毒性效应,以鲫幼鱼为测试生物,测定了5类7种稻田常用杀虫剂对鲫幼鱼的急性毒性。结果表明,吡虫啉对鲫幼鱼的毒性最低,24 h、48 h、72 h、96 h的LC50分别为56.946mg/L、53.655 mg/L、51.151 mg/L、49.604 mg/L,安全浓度为4.960 mg/L;毒性最高的为溴氰菊酯,24 h、48 h、72 h、96 h的LC50分别为0.032 mg/L、0.025 mg/L、0.019 mg/L、0.015 mg/L,安全浓度为0.002 mg/L。根据《化学农药环境安全评价试验准则》,吡虫啉、噻虫嗪和吡蚜酮对鲫幼鱼为低毒,噻嗪酮和三唑磷对试验鱼类为中毒,毒死蜱对其为高毒,溴氰菊酯对其毒性最大,为剧毒。该结果可为杀虫剂在养鱼稻田的合理使用提供科学依据。     

五氯酚钠在鲫体内的毒性及代谢动力学的研究

在实验室条件下,研究了不同浓度的五氯酚钠溶液（0、1、2、3、4、5、10mg／L）对鲫Carassiusaurtlgt~的毒性作用,并采用药浴的方式研究了五氯酚钠在鲫体内不同时间段的药代谢动力学。结果表明：五氯酚钠对鲫的毒性作用很强,当药物浓度为10mg／L时,药浴1h后试验动物100％死亡;当药物浓度为2mg／L时,试验动物健康存活,药浴96h无死亡现象;将鲫在2mg／L的五氯酚钠溶液中浸浴24h后,药物迅速被鲫吸收,血浆中0．5h五氯酚钠浓度就能达到11．5ng／mL,1h达到峰值12．0ng／mL,但药物的代谢较慢,给药70d后才检测不到药物;药物在肌肉中的代谢与血浆中类似,1h达到峰值（11．84ng／mL）,比血浆中的峰浓度略低,药动学参数t1／2α、t1/2β,MRT0-1、Tmax、Cmax、AUC0-4和MAT分别为12．6h、186．8h、260．4h、1h、11．84ng／mL、1106．5ng／（mL·h）、222．5h。     

水稻谷氨酸脱羧酶基因(OsGAD3)分子进化与表达分析

利用分子克隆技术从8个水稻品种中克隆到谷氨酸脱羧酶基因OsGAD3,并进行了相关的生物信息学及表达谱分析.结果表明,不同水稻品种OsGAD3的核苷酸序列差异性很小,都在1%以内,在氨基酸序列上都具有保守的结构域,在C末端均具有类似于OsGAD1结合CaM的关键氨基酸位点,但不同于OsGAD2.系统进化树分析表明,不同水...     

氯化钠盐度和碳酸氢钠碱度对达里湖鲫毒性影响的初步研究

对达里湖鲫Carassius auratus Linnaeus 3月龄幼鱼(体长为4.16 cm±0.47 cm)分别在不同浓度梯度下进行盐度和碱度急性胁迫试验,分析盐度、碱度以及盐碱混合对达里湖鲫的毒性影响,并在此基础上采用水生态毒理联合效应相加指数法进行了氯化钠(NaCl)和碳酸氢钠(NaH-CO3)浓度的联合毒性试验,探讨了在不同类型盐碱水质条件下开展增养殖活动的可行性.结果表明:在pH为7.0±0.5,碱度为0.44mmol/L时,盐度对试验鱼的24、48、72、96 h的半致死浓度(LC50)分别为11.57、11.14、10.89、10.61,安全值(SC)为3.10;在pH为8.5±-0.5,盐度为1.9 ～4.3时,碱度对试验鱼的24、48、72、96 h的LC50分别为71.93、67.80、65.80、63.42 mmol/L,SC为18.07 mmol/L;在96 h内NaCl和NaHCO3的关系全部为拮抗作用,且其拮抗效应逐渐减弱并趋向于相加作用.本试验结果可为今后在内陆盐碱水域开展达里湖鲫增养殖提供科学依据.