多年生黑麦草转基因育种研究进展

回顾了多年生黑麦草组培再生体系的建立和遗传转化的研究历程和结论,分析了利用转基因技术进行草坪草育种存在的问题, 并对进一步的研究做出展望.     

多年生黑麦草转基因育种及其安全性的研究进展

多年生黑麦草是适应性很强的牧草和草坪草种,转基因技术的应用已成为其育种研究的重要途径.为此,概述了多年生黑麦草组织培养和遗传转化方面的研究进展,首次探讨了转基因多年生黑麦草的生物安全性.     

农杆菌介导多年生黑麦草遗传转化体系的建立

AVP1基因能够提高植物的抗盐性,通过农杆菌介导AVP1基因转化多年生黑麦草,并建立了较为成熟的遗传转化体系。研究表明,将预培养4d的黑麦草胚性愈伤组织经OD600为0.6左右的农杆菌菌液在负压下侵染6min,共培养3d,用250mg/L的羧苄青霉素(Carb)脱菌,附加150μmol/L的乙酰丁香酮(AS),然后转接到含75mg/L潮霉素(Hpt)的筛选培养基上进行筛选培养的转化体系效果最佳。     

多年生黑麦草遗传转化体系的建立及其转化植株的获得

以矮生、凯蒂莎、爱神特3种多年生黑麦草品种为材料,进行了离体再生培养和遗传转化的研究,建立了这些品种的胚性愈伤组织高频诱导与再生系统及其基因枪转化技术体系,并将抗除草剂的bar基因导入多年生黑麦草愈伤组织,而获得抗除草剂转基因再生植株。     

紫羊茅和多年生黑麦草不同生长阶段粗蛋白和氨基酸含量动态分析

试验以紫羊茅和多年生黑麦草为研究对象,分析测定了其在分蘖期、拔节期、扬花期和成熟期4个不同生长阶段的粗蛋白和17种氨基酸含量。结果表明：紫羊茅和多年生黑麦草CP及TAA随生长阶段均呈下降趋势,几乎呈直线下降的趋势;17种氨基酸中,16种氨基酸均随生长阶段呈下降趋势,仅谷氨酸是随生长阶段呈现“高-低-高”的变化趋势。紫羊茅和多年生黑麦草赖氨酸含量在分蘖期最高（分别为0．87％、0．99％）,成熟期最低（分别为0．34％、0．39％）。上述结果表明,紫羊茅和多年生黑麦草中粗蛋白和氨基酸含量受生长阶段影响较大;2种牧草应在扬花期收割最佳。     

多年生黑麦草P5CS基因的定点突变及其在拟南芥中的转化

 在前期克隆获得Lp5CS基因的全长ｃＤＮＡ 序列基础上,采用ＰＣＲ 扩增技术对多年生黑麦草脯氨酸合成酶基因p5CS的定点突变体系进行了探讨,并运用农杆菌转化技术对突变后的基因进行了功能验证。根据突变位点序列设计一对引物,使用Ｐｆｕ高保真ＤＮＡ 聚合酶和超级感受态细胞ＤＭＴ,通过ＰＣＲ 扩增,获得含有所要突变位点的犔狆犘５犆犛Ｆ１２８Ａ,定向克隆入真核表达载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３００中,转化拟南芥验证基因功能。结果表明,预期位点上发生了突变,Lp5CS编码的第１２８位密码子已由苯丙氨酸残基（Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ,简称Ｐｈｅ或Ｆ）变为丙氨酸残基（Ａｌａｎｉｎｅ,Ａｌａ）,证明用ＰＣＲ 技术已成功地使Lp5CS基因发生定点突变。转基因拟南芥Ｔ１ 代植株进行ＰＣＲ和ＲＴ－ＰＣＲ检测,获得４个转基因阳性株系。拟南芥Ｔ２代植株经１００ ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ处理７ｄ后,转基因株系脯氨酸含量分别为４２６２和５６２３μｇ／ｇＦＷ,显著高于野生型株系的２５８１μｇ／ｇＦＷ。说明转基因株系能积累更多地脯氨酸。     

多年生黑麦草P5CS基因的定点突变及其在拟南芥中的转化

在前期克隆获得LpP5CS基因的全长cDNA序列基础上,采用PCR扩增技术对多年生黑麦草脯氨酸合成酶基因P5CS的定点突变体系进行了探讨,并运用农杆菌转化技术对突变后的基因进行了功能验证。根据突变位点序列设计一对引物,使用Pfu高保真DNA聚合酶和超级感受态细胞DMT,通过PCR扩增,获得含有所要突变位点的LpP5CSF128A,定向克隆入真核表达载体pCAMBIA1300中,转化拟南芥验证基因功能。结果表明,预期位点上发生了突变,LpP5CS编码的第128位密码子已由苯丙氨酸残基(Phenylalanine,简称Phe或F)变为丙氨酸残基(Alanine,Ala),证明用PCR技术已成功地使LpP5CS基因发生定点突变。转基因拟南芥T₁代植株进行PCR和RT-PCR检测,获得4个转基因阳性株系。拟南芥T₂代植株经100 mmol/L NaCl处理7 d后,转基因株系脯氨酸含量分别为4 262和5 623 μg/g FW,显著高于野生型株系的2 581 μg/g FW。说明转基因株系能积累更多地脯氨酸。     

转DREB1A基因多年生黑麦草T1代萌发期耐盐性研究

摘要：对转DREB1A基因多年生黑麦草（Lolium perenne）的T1代种子和多年生黑麦草非转化植株的子一代种子进行了不同质量分数的NaCl （0、0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%）处理，研究了转基因植株对盐胁迫的生理响应。结果表明，随着盐质量分数递增，相对发芽势、相对发芽率、胚芽长、叶绿素含量、叶片含水量及相对含水量呈现下降的趋势，转基因组与对照组之间的差异达到显著水平,高盐胁迫下，前者各指标均高于后者；胚根长变化无明显规律；细胞膜透性的变化与盐质量分数的增加成正相关，转基因组的细胞膜透性低于对照组，二者存在显著差异。说明转基因植株的耐盐性明显强于对照组，转DREB1A基因多年生黑麦草T1代种子可以作为盐害土壤改良和利用的植物资源。     

多年生黑麦草高频再生体系的建立及农杆菌介导PEPC基因的转化

以多年生黑麦草(Lolium perenne L.)成熟种子作为外植体,建立其高频再生体系,通过农杆菌介导法将磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因转入,为多年生黑麦草的抗逆转基因工作奠定基础。结果表明:种子充分灭菌后在附加6.0 mg·L^-1 2,4-D的培养基中诱导愈伤组织,诱导率可达61.33%。愈伤组织在2,4-D浓度减半的培养基上继代培养长势良好,分化培养基为MS培养基附加1.0 mg·L^-16-BA,分化率最高达到61.33%,在1/2 MS+0.5 mg·L^-1 NAA培养基中进行生根培养,生根率达100%。以该再生体系为基础,将获得的愈伤组织作为外植体进行遗传转化,经筛选培养后得到再生植株,通过PCR及实时荧光定量(Real-Time)PCR验证表明PEPC基因已成功转入,转化率为8.67%。试验结果将为多年生黑麦草抗性品种的研究奠定基础。     

甘露醇及AgNO3对根癌农杆菌介导的多年生黑麦草遗传转化的影响

多年生黑麦草是优良的牧草和草坪草.农杆菌介导多年生黑麦草遗传转化非常困难.为了建立稳定的多年生黑麦草遗传转化体系,本研究以品种"多福"种子成熟胚为外植体诱导愈伤组织,携质粒pCAMBIA2301的根癌农杆菌EHA105介导,进行遗传转化.在预培养及共培养基中添加0.1 mol/L甘露醇或5 mg/L硝酸银,并分析了二者...     

多年生黑麦草种质SSR分子标记遗传多样性分析

多年生黑麦草(Lolium perenne)是广泛栽培利用的优质牧草、草坪草.为研究多年生黑麦草种质资源的遗传多样性,选用简单重复序列(SSR)分子标记技术对10份多年生黑麦草自主选育品系和75份来自于23个不同国家的种质资源进行了分析.结果表明,26对引物扩增出的多态性条带有91条,占总条带数的69.5％.每个SSR...     

内生真菌对感染锈病黑麦草生长和生理的影响

在田间条件下对带内生真菌和不带内生真菌球道黑麦草品种被锈菌不同程度感染后的生长、光合特性和生理指标进行测定。结果表明,带内生真菌的植株无论感病轻重,其病叶损失率和植株矮化程度均显著低于不带内生真菌的植株(P<0.05)。并且在轻度和重度病株中,内生真菌可提高黑麦草叶片相对含水量、可溶性糖含量、叶绿素含量,净光合速率、蒸腾速率、气孔导度,叶内游离脯氨酸含量、超氧化物歧化酶与过氧化物酶的活性;同时有效地降低了丙二醛的含量,说明内生真菌的存在可提高寄主黑麦草在田间条件下的抗锈病能力。     

添加糖蜜对青稞秸秆和多年生黑麦草混合青贮发酵品质及营养价值的影响

试验在青稞秸秆与多年生黑麦草以6∶4混合的基础上,添加3%,4%和5%的糖蜜,旨在进一步改善混合青贮发酵品质和营养价值,为西藏地区青稞秸秆青贮利用提供理论依据。结果显示,青贮前14天,糖蜜添加组乳酸含量快速增加,pH值迅速下降。对照组pH值未能降至4.2以下,而糖蜜添加组均在4.0左右,乳酸、水溶性碳水化合物含量和乳酸/乙酸显著高于(P<0.05)对照组,氨态氮/总氮均低于对照组,且添加3%糖蜜已达到优质青贮饲料标准。青贮第60天糖蜜添加组有较高的粗蛋白含量,较低的中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量,各组体外降解率均高于青贮材料。综合考虑,在青稞秸秆和黑麦草以6∶4混合的基础上添加3%的糖蜜可获得优质青贮饲料。     

有机物料和钝化剂对低Cd环境容量土壤黑麦草与桂牧1号轮作的Cd安全分析

针对南方稻田土壤酸化、重金属Cd环境容量小,采用田间小区试验研究改制黑麦草-桂牧1号轮作模式下不同施肥和酸化调理对牧草质量安全的影响。结果表明,有机肥及其与石灰配施显著增加黑麦草与桂牧1号产量,总鲜重分别达3.19×10⁵,2.74×10⁵ kg/hm²,比单施化肥(对照)分别增产43.10%(P<0.05),22.73%(P<0.05),而石灰、赤泥、稻草等对黑麦草和桂牧1号产量无显著影响;石灰、赤泥、有机肥及有机肥与石灰配施皆能提高土壤pH值,降低土壤有效态Cd含量及其生物有效性;但有机肥、稻草的施用增加了土壤Cd残留。因此,应控制有机肥和稻草的Cd含量与用量,以确保土壤的安全可持续利用;同时,低Cd环境容量土壤施用含Cd有机物料不建议施用石灰等钝化剂,以促进南方牧草种植系统重金属循环减控。