牛分枝杆菌MPB70基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

本研究以牛分枝杆菌Vallee111染色体DNA为模板,以MPB70成熟蛋白基因特异性引物进行PCR扩增,获得约500bp的DNA片段.通过T-A克隆技术,将PCR产物克隆至pGEM-T Vector中,成功地构建出克隆载体pGEM-T-70.以BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切pGEM-T-70和pET28a( ),并将纯化的MPB70基因亚克隆至pET28a( )中,构建出原核表达载体pET28a-70.将pET28a-70转化至感受态E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约25Ku外源蛋白带.Western blot分析发现,该蛋白具有牛分枝杆菌抗原性,从而为进一步研究MPB70的亚单位疫苗及DNA疫苗奠定基础.     

牛分枝杆菌MPB70基因的克隆表达

以牛分枝杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增其特异性蛋白(MPB70)基因,获得约600 bp的DNA片段,并将其克隆入pGEX-6P-1质粒,构建出原核表达载体pGEX-6P-1-MPB70。将质粒转化至感受态BL21中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析可见相应蛋白带。Western blot分析证实,该蛋白具有牛分枝杆菌抗原性,从而为进一步研究牛结核诊断方法奠定基础。     

牛分枝杆菌溶血磷脂酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

为研究牛分枝杆菌(M.bovis)溶血磷脂酶基因在致病机理中的作用,本研究构建了表达M.bovis的溶血酶(LIP)基因的重组质粒pET30a-LIP,经IPTG诱导在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达,SDS-PAGE分析表明,重组蛋白表达量占菌体总蛋白的20%;该蛋白经电洗脱纯化后,纯度达95%以上;免疫印迹实验表明,原核表达的蛋白可与兔抗牛分枝杆菌多克隆抗体结合,具特异的免疫反应性。     

鹿结核分枝杆菌MPB70蛋白的表达与免疫原性鉴定

本研究以分离的鹿结核分枝杆菌DNA为模板扩增免疫原性蛋白MPB70基因,获得约590 bp片段,并将其克隆,构建原核表达载体pET-30a-MPB70,将重组质粒转入大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导后纯化和SDS-PAGE分析,在20 ku处可见特异性蛋白条带。利用鹿结核阳性血清进行Western blotting鉴定,原核表达的融合蛋白可与鹿结核阳性血清抗体结合,并出现特异的免疫反应。该蛋白可作为特异性抗原进行鹿结核病的检测,从而为鹿结核病诊断方法的研究奠定基础。     

牛分枝杆菌Ag85B基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

以牛分枝杆菌Vallee111染色体DNA为模板．根据已发表的Ag85B成熟蛋白基因的核苷酸序列设计合成特异性引物进行PCR扩增．获得约860bp的DNA片段。通过T-A克隆技术．将PCR产物克隆至pGEM-T载体中．成功地构建出克隆载体pGEM-T-85B。以BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切pGEM-T-85B和pET28a（＋）．并将纯化的Ag85B基因亚克隆至pET28a（＋）中，构建出原核表达载体pET28a-85B。将pET28a-85B转化至感受态E.coli BL21（DE3）中．经IPTG诱导和SDS-PAGE分析．可见约30000的外源蛋白带。Western blot分析发现，该蛋白具有牛分枝杆菌抗原性．从而为进一步研究Ag85B的亚单位疫苗及DNA疫苗奠定了基础。     

牛结核分枝杆菌MPB70蛋白分泌性载体的构建与蛋白表达

为了研究牛结核病新型诊断抗原,试验根据GenBank中Mycobacterium bovis基因序列设计1对引物,将牛结核分枝杆菌MPB70基因构建到pET22b(+)原核表达载体上,将重组载体转到E.coliBL21(DE3)中,经IPTG诱导获得高效表达,并进行SDS-PAGE和Westen-blot分析。结果表明:MPB70蛋白以可溶形式在细胞周质中表达,有部分蛋白以包涵体形式在细胞质中表达,其分子质量约为30ku,蛋白表达量占菌体总蛋白的20%;重组MPB70蛋白可与牛分枝杆菌阳性血清发生特异性反应。说明重组MPB70蛋白能够作为诊断抗原。     

牛结核分枝杆菌早期标识性分泌性蛋白MPB70、MPB83基因的串联表达及其抗原性鉴定

为获得一种具有抗原性的牛结核分枝杆菌(MB)感染早期标识物MPB70、MPB83分泌性蛋白的串联抗原蛋白,本研究利用DNAStar生物信息软件对MB感染早期标识性分泌性蛋白MPB70、MPB83抗原结构区域进行预测后设计合成相应引物,并在两个片段之间引入16位柔性多肽,通过重叠延伸PCR技术获得MBP70与MBP83基因的抗原优势区核苷酸串联片段,将其连接至原核表达载体pGEX-6p-1中经诱导、表达,结果显示构建的重组表达载体获得高效表达,目的抗原蛋白的分子质量约58ku,纯化后重组蛋白的纯度>90%,经免疫BALB/c小鼠4次后,抗体效价达到1∶51200。本实验获得了具有明显抗原活性的MB感染早期分泌性蛋白串联抗原MPB70+MPB83,为后续进一步研发MB早期感染标识物快速检测试剂盒奠定了基础。     

牛分枝杆菌广西分离株MPB70基因的克隆及序列分析

利用牛分枝杆菌MPB70基因特异性引物,以2株牛分枝杆菌广西分离株的染色体DNA为模板,扩增MPB70基因,产物经纯化后与载体PMD18-T连接,然后转化至大肠杆菌DH5α。提取转染后大肠杆菌的质粒进行双酶切和PCR鉴定,鉴定为阳性的质粒进行序列测定。测序后通过序列分析软件DNAstar MegAlign对MPB70基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行分析,并与GenBank上已发表的8株牛分枝杆菌的MPB70基因参考序列进行比较。结果显示广西分离株mt359、mt370与已发表的7株参考株序列比较,其核苷酸序列和氨基酸同源性在77.4%~95.9%之间。这一结果表明广西奶水牛分枝杆菌分离株与参考的其他牛分枝杆菌毒株的MPB70基因没有太大的差异,说明牛分枝杆菌分泌蛋白MPB70基因十分保守,从而为检测跟踪毒株的变异,研制牛分枝杆菌亚单位疫苗提供基础。     

基因免疫制备牛分枝杆菌MPB64抗原单克隆抗体

为了建立针对牛分枝杆菌分泌抗原MPB64的检测手段,制备该抗原的单克隆抗体,构建真核表达载体pcDNA-mpb64,以原核表达并纯化的融合蛋白H-MPB64包被ELISA板,建立单克隆抗体检测方法。利用基因免疫方法免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术筛选出针对牛分枝杆菌分泌蛋白MPB64的单克隆抗体一株,并制备了腹水,经鉴定腹水效价达到1∶10240,采用硫酸铵沉淀法纯化腹水,纯化抗体效价为1∶8000,为今后研制分枝杆菌鉴定技术奠定基础。     

表达牛分枝杆菌MPB83基因重组腺病毒的构建

以牛分枝杆茵Vallee III株基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得MPB83基因,克隆后.亚克隆至腺病毒穿梭栽体pShuttle-CMV中,构建的重组穿梭质粒pShuttle-CMV-MPB83经Pme I酶切,转化含腺病毒骨架质粒pAdeasy-I的BJ5183-AD-1感受态细胞,经同源重组获得复制缺陷型重组腺病毒载体pAd-CMV-MPB83.Pac I酶切线性化该质粒,转染AD-293细胞进行病毒包装,转染细胞10 d后出现细胞病变(CPE).PCR、RT-PCR、western blot检测到重组病毒含MPB83基因并成功表达.     

牛分枝杆菌MPB64基因在大肠杆菌中的表达

牛结核病主要是由牛分枝杆菌引起的一种人兽共患传染病.人结核病的10%以上是由牛分枝杆菌引起的.牛结核病的防制主要是采用牛结核PPD进行变态反应检疫,对检出的阳性牛隔离或捕杀,以达到消灭该病的目的.但是,应用该防制措施并未达到控制该病的目的,反而近年来呈上升趋势[1].目前,预防人结核病普遍采用卡介苗(BCG),但是,BCG在不同的人群和地域中保护力差异很大[2],尤其对成人的保护效果不佳.对牛和其他动物而言,注射BCG后,变态反应检测均呈阳性,导致人工免疫和自然感染不能区别,影响牛的检疫和国际贸易.     

牛分枝杆菌MPB70蛋白单克隆抗体的制备及检测

为了制备牛分枝杆菌的单克隆抗体,本试验利用制备的原核表达的牛分枝杆菌重要抗原蛋白MPB70作为免疫原皮下多点注射免疫BALB/c小鼠。利用细胞融合技术,经过5次亚克隆与筛选,取已免疫好的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在PEG3500的作用下进行细胞融合。筛选得到了2株分泌抗牛分枝杆菌MPB70蛋白的杂交瘤细胞,分别命名为Anti-B-MPB70：8和Anti-B-MPB70：12。采用间接ELISA方法对获得的单克隆抗体进行亲和常数检测、效价分析及亚类鉴定,通过SDS-PAGE凝胶试验对单克隆抗体进行纯度分析,并检测其浓度,通过Western blotting方法对单克隆抗体的反应特性进行鉴定。结果显示,纯化后的MPB70蛋白分子质量大小为20 ku,浓度为0.5 mg/mL。两株单克隆抗体的亲和常数分别为9.95×10⁹和9.53×10⁸;抗体效价分别为1∶102 400和1∶12 800;抗体亚类分别为IgG_2b和IgG₁,轻链类型均为κ型;纯度>90%;浓度分别为3.0和2.2 mg/mL;且具有良好的反应特性。以上研究结果表明,本试验成功制备了抗MPB70蛋白单克隆抗体,可为牛结核病病原和抗体检测技术研究奠定基础。     

牛型分枝杆菌MPB70蛋白胶乳凝集方法的建立及应用

为了研究牛结核病新型诊断试剂，提高诊断的特异性和敏感性，我们用大肠杆菌工程菌表达了牛型分枝杆菌特异性抗原MPB70并提纯蛋白建立了牛结核病乳胶凝集试验（LAT）诊断方法。MPB70是一种牛型分枝杆菌特异性分泌而卡介苗BCG缺失的蛋白质，热稳定性好，用此蛋白建立的乳胶凝集方法具有良好的敏感性、特异性以及较长的保存期，检测70份临床奶牛血清，与皮内变态反应和间接血凝方法相比较分别具有71．4％和88．6％的符合率。该方法还可鉴别诊断自然感染和疫苗免疫接种。我们建立的牛型分枝杆菌MPB70蛋白乳胶凝集试验诊断方法将分子生物学手段和经典试验方法有机结合，为临床快速检测牛结核病血清特异性抗体水平提供了行之有效的方法。     

牛分支杆菌MPB70和CFP10-ESAT6基因的表达与检测

以牛分支杆菌染色体DNA为模板,分别以MPB70、CFP10-ESAT6融合蛋白基因特异性引物进行PCR扩增,获得约600 bp的DNA片段,并将其克隆入PQE30质粒,构建出原核表达载体PQE30-MPB70,PQE30-CFP10-ESAT6.将质粒转化至感受态DH5α中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见相应外源蛋白带.纯化蛋白后作为包被抗原建立ELISA方法,为进一步研究牛结核病诊断方法奠定基础.     

IgG isotype antibody responses to epitopes of the Mycobacterium bovis protein MPB70 in immunised and in tuberculin skin test-reactor cattle

Serological assays may have merit in identifying animals in advanced stages of bovine tuberculosis, but most tests have had sub-optimal sensitivities and specificities. The Mycobacterium bovis protein MPB70 has been identified as a B-cell target with diagnostic potential in measurement of pre- and post-skin-test antibody responses. One observation, which has potential practical application, has been that skin testing with tuberculin boosts IgG(1) anti-MPB70 antibody responses in cattle with tuberculous lesions. However, serological cross-reactivities with bacteria, such as Nocardia asteroides, have been described for this protein. With the aim of identifying candidate reagents for improved diagnostic tests, this study investigated IgG isotype antibody responses to MPB70 at the epitope level and, because of the previous findings, focused on IgG(1) responses following skin testing. Screening of a panel of overlapping synthetic peptides using sera from cattle immunised with MPB70 and cattle infected with M. bovis showed that two regions of the protein (residues 21-70 and 101-120) contain dominant B-cell epitopes. No individual epitope appeared to be selectively recognised by one isotype of IgG antibody. Investigation of IgG(1) responses showed that recognition of the epitope within residues 51-70 was boosted strongly by tuberculin injections in skin-test positive cattle and that this memory response was generally a feature of cattle which were found to have macroscopic, tuberculous lesions.