不同稀释剂对猪冷冻精液的影响

手握法采集12月龄大约克种公猪精液,在37℃下离心,弃去精清,收集浓缩段富含精子部分,用7种不同的稀释液进行稀释,应用液氮熏蒸法制作颗粒冻精。结果表明,在7种稀释液中,7号稀释液优于其他6种稀释液(p<0.05);与其他的冷冻保护剂相比,甘油的冷冻保护性能较好(p<0.01),其适宜浓度为2~4ml/l;干解冻(40~45℃)效果优于湿解冻,解冻后精子活率达0.46~0.49(p<0.05);稀释液中添加安钠咖可有效地延长精子的冻后存活时间(p<0.01)。     

实时精子分离系统对猪精子冷冻品质的影响

【目的】探索实时精子分离系统对猪精子冷冻品质的影响。【方法】采用实时精子分离系统对精液进行分离优选,液氮冷冻法制作细管冻精,以未分离精液为对照,检测实时精子分离系统对猪精子冷冻品质的影响。【结果】分离优选精子解冻后,精子活率、顶体完整率、质膜完整率、正常染色质率均明显高于对照组(P<0.01);分离组精子的正常形态率也显著高于对照组,且未受冷冻-解冻过程的影响(P>0.01);分离过程对精子密度也未产生显著影响(P>0.01)。【结论】实时精子分离系统可以显著改善猪冷冻精液的品质。     

卵黄离心及精液透析预处理对猪精子冷冻效果的影响

从卵黄离心处理和精液透析两方面对现有猪精子冷冻方法进行优化。分别采用两种离心方案除去卵黄中大颗粒物质,研究卵黄离心处理对猪精子冷冻效果的影响;在精液冷冻预处理的第一阶段降温平衡中,将包含精浆的猪精液在大体积稀释液中进行透析,研究透析方法对猪精子冷冻效果的影响。结果发现,对卵黄进行离心以及对包含精浆的精液采用透析处理均能明显改善猪精子冷冻效果(P0.05)。     

猪冷冻精子的体外受精与单精子胞浆内注射

用猪冷冻精子进行体外受精和单精子胞浆内注射(ICSI),并研究添加L-半胱氨酸及不同成熟培养法对猪ICSI胚胎发育的影响。结果表明:用猪冷冻精子生产的ICSI胚胎卵裂率及囊胚发育率分别为68.3%和11.4%,均低于用冷冻精子进行体外受精(IVF)所获得的卵裂率和囊胚发育率(分别为76.9%和19.2%,P<0.05)。在培养液中添加1.71mmol·L~(-1) L-半胱氨酸培养3 h,无论是卵裂率、桑椹胚发育率,还是囊胚发育率,均未得到明显改善(P>0.05);采用含0.4%BSA的NCSU-23培养液进行猪卵母细胞成熟培养,ICSI胚胎卵裂率虽明显高,但各组所获胚胎发育率均无显著差异(P>0.05),表明所用卵母细胞的成熟方法并未对ICSI胚胎发育产生明显的影响;用颗粒细胞或卵丘细胞共培养ICSI胚胎后,卵裂率有明显提高(P<0.05),但各组囊胚发育率无统计学差异。     

细胞凋亡相关Caspases在猪精子冷冻过程中的表达谱研究

【目的】探究不同冷冻保护剂冷冻猪精子后,精子中Caspases表达模式。【方法】采用普通PCR和荧光定量PCR技术检测Caspase-1~15在添加不同冷冻保护剂冷冻猪精子后的表达谱。【结果】①甘油和乙二醇可以抑制Caspase-2、-8、-13的表达,而DMSO只能抑制Caspase-2和Caspase-8的表达。②海藻糖和乳糖能有效地抑制Caspase-2、-8、-13、-15的表达,而蔗糖能有效地抑制Caspase-1、-6、-13和Caspase-15的表达。③超氧化物歧化酶和过氧化氢酶可以有效防止Caspase-2、-8和Caspase-13的表达,而谷胱甘肽仅可以有效地抑制Caspase-13的表达。④不添加抗冻剂冷冻对凋亡执行子Caspase-3和Caspase-7的表达没有影响。【结论】冷冻保存主要影响凋亡启动子在猪精子中的表达,添加甘油、蔗糖、乳糖能有效抑制猪精子冷冻解冻造成的凋亡。     

5种禽类卵黄低密度脂蛋白对猪精子冷冻效果的影响

为了确定具有最佳抗冷冻效果的禽类卵黄低密度脂蛋白(LDL)及其添加质量分数,在猪精液冷冻稀释液中分别添加质量分数为6%、7%、8%、9%和10%的鸡、鸭、鹌鹑、鸽子和鸵鸟的卵黄LDL,分析不同禽类的LDL对猪精子的冷冻保存效果。结果表明,稀释液中添加质量分数为9%的鸡、鸭、鹌鹑、鸽子卵黄LDL以及质量分数8%的鸵鸟卵黄LDL时,冷冻-解冻后精子活率最高,分别达到42.33%、35.63%、31.47%、47.33%和36.40%。以5种禽类LDL最佳质量分数配制冷冻稀释液冷冻精子,发现质量分数为9%的鸽蛋LDL冻存猪精子时解冻后精子活率达到47.33%,顶体完整性达到62.57%,质膜完整性达到48.13%,均显著优于其他处理组(P<0.05)。说明鸽子卵黄LDL对猪精子具有良好的冷冻保护性能,可提高猪精子抵抗低温打击的能力。     

猪精子内阳离子在保存、冷休克和快速冷冻中的变化

在37℃保存过程中,猪精子内K~ 、Ca~( )、Mg~( )和Zn~( )的水平有所下降,而Na~ 则有所升高。冷休克和快速冷冻都能使精子内的K~ 水平降低而Na~ 、Ca~( )和Zn~( )水平升高,Mg~( )的变化不大。分析结果表明:(1)精子内离子的变化同精子膜受损伤的程度有关;(2)猪精子内似乎具有在某些低温状态下与Zn~( )和Ca~( )结合的成分。     

巴马香猪精液冷冻过程中精子内抗氧化酶活性与精子质膜完整性关系研究

猪精液冷冻过程中,精子质膜往往因受到活性氧(ROS)的氧化而发生损伤,精子品质也随之下降.精子 ROS水平受抗氧化酶活性的影响,然而冷冻过程中精子细胞内抗氧化酶活性变化与细胞膜完整性的关系还缺乏报 道.该试验将巴马香猪精液冷冻保存降温过程中的精子分为4种状态,即鲜精、15 ℃精液、5 ℃精液和冷冻解冻 后精液,检测了各种状态下精子的运动参数、质膜完整性(PMI)和顶体完整性(AI),分析了超氧化物歧化酶(SOD) 活性、谷胱甘肽过氧化物酶(Gpx)活性和ROS(丙二醛MDA)水平.结果表明:15 ℃精子各项指标和鲜精无显著 差异(p>0.05);5℃精子运动能力、质膜完整性和抗氧化酶活性低于鲜精(p<0.05),而精子细胞内MDA 水平与 鲜精无显著差异(p>0.05);冷冻解冻后精子的运动能力、质膜完整性和抗氧化酶活性均低于其他各组(p< 0.05),精子MDA水平显著高于其他各组(p<0.05).同时,SOD和Gpx活性与精子PMI和AI之间的相关性均达 到了显著水平(p<0.05).可见,当精子降温至15℃以下直至冷冻时,SOD和GPX活性逐渐降低,精子细胞清除 ROS的能力随之下降,精子质膜脂质过氧化反应增强,质膜受损,内容物外渗是精液品质降低的重要原因.     

渗透性冷冻保护剂对山羊精子的冷冻保护效果

【目的】探索渗透性冷冻保护剂甘油、乙二醇、二甲基亚砜(DMSO)、二甲基乙酰胺(DMA)对山羊精子的冷冻保护效果。【方法】采用假阴道法采集繁殖性能正常、健康、年龄2~4岁的6只西农萨能奶山羊种公羊精液,以Tris-卵黄为基础稀释液,分别添加体积分数为6%的甘油、3%和6%的乙二醇、3%和6%的DMSO、3%和6%的DMA,测定冷冻-解冻后精子活率、顶体完整性、质膜完整率、线粒体完整性、谷胱甘肽还原酶活性和丙二醛(MDA)浓度,对比不同冷冻保护剂对山羊精子的冷冻保护效果。【结果】甘油(6%)和乙二醇(3%,6%)组解冻后精子活率均极显著(P0.01)高于DMSO(3%,6%)和DMA(3%,6%)处理组;甘油(6%)、DMA(6%)和乙二醇(3%)组的线粒体完整性极显著(P0.01)高于其他组;甘油(6%)和乙二醇(3%,6%)组的质膜完整率极显著(P0.01)高于其他组;从顶体完整性、谷胱甘肽还原酶活性和MDA浓度等指标看,甘油(6%)和乙二醇(3%,6%)组极显著(P0.01)优于其他组。【结论】稀释液中添加乙二醇(3%,6%)和甘油(6%)都能明显提高山羊冷冻精子品质,其中3%乙二醇可以替代甘油作为山羊精液冷冻保护剂从而发挥更好的抗冷冻保护作用。     

不同冷冻-解冻精子浓度对猪卵母细胞体外受精的影响

[目的]探讨体外受精时不同精子浓度对精子穿入成熟卵母细胞及后续发育的影响。[方法]以冷冻-解冻精子为材料,以1×106、1×107个/ml 2种精子浓度进行体外受精,研究不同冷冻-解冻精子浓度对猪卵母细胞体外受精的影响。[结果]当精子浓度为1×106、1×107个/ml时,精子穿入率分别为83.18%、88.23%,单精入卵率分别为40.55%、9.02%,多精入卵率分别为59.45%、90.98%,平均每个卵母细胞中的精子数分别为2.03、3.26个,雄原核形成率分别为84.10%、86.40%,单精入卵率、多精入卵率有显著差异(P<0.05),其他指标无显著差异(P>0.05)。[结论]该研究为应用冷冻-解冻精子建立猪卵母细胞的体外生产系统提供了依据。     

添加剂在猪精液冷冻保存中的应用

猪精液的冷冻保存显著影响猪精子的运动学参数,损伤精子质膜、顶体和DNA完整性,降低解冻后精子活率和受精能力.近年来,在以甘油和蛋黄作为冷冻保护剂的基础上,为了有效降低冷冻-解冻对精子的损伤,提高解冻精液的受精能力,研究人员将OEP、抗氧化剂(甲基黄嘌呤、丁羟基甲苯、谷胱甘肽、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、褪黑素和维生素E等)、2-羟丙基β环糊精以及透明质酸等物质作为添加剂应用于猪精液的冷冻保存,结果表明这些物质在保护精子质膜和顶体完整性,提高解冻后精子活力、活率和受精能力等方面均有显著作用.     

猪精液0.5 ml细管快速冷冻和解冻方法的优化

 【目的】优化冷冻-解冻方法,提高0.5 ml细管快速冷冻保存猪精液的质量。【方法】冷冻方法：分别将细管水平置于液氮面上方3、5、7、9和11 cm处,每一水平位置细管分别熏蒸3、5、10、15和20 min后投入液氮保存,37℃×30 s水浴解冻,确定最优冷冻方法;在选择最优冷冻方法的基础上,分别采用37℃×30s(对照组)、42℃×25 s、47℃×20 s、52℃×15 s、57℃×10 s和62℃×5 s共6种方法水浴解冻,确定最佳解冻方法。【结果】采用3 cm×10 min冷冻方法,解冻0、8 h精液中精子活率、质膜完整率和顶体完整率均最高。采用相对“高温短时”解冻,精子活率、质膜完整率、顶体完整率和线粒体膜电位均较高,同时丙二醛浓度降低;57℃×10 s和62℃×5 s解冻的精子各项指标无显著差异（P＞0.05）,但前4项指标显著高于对照组（P＜0.05）,丙二醛浓度显著降低（P＜0.05）。【结论】优化猪精液0.5 ml细管快速冷冻的冷冻和解冻方法可以显著提高解冻质量,采用3 cm×10 min冷冻、57℃×10 s或62℃×5 s解冻方法效果最佳。     

褪黑素与盐酸多巴胺在猪精液冷冻保存中的应用效果

为给改良猪精液冷冻稀释液配方提供参考数据,分析了不同浓度褪黑素和盐酸多巴胺对猪精子冷冻后畸形率和顶体完整率的影响。结果表明,10mmol/L褪黑素及3种浓度的盐酸多巴胺(0.1mmol/L,1mmol/L,10mmol/L)均能有效改善冻后猪精子的畸形率和顶体完整率,两种试剂均可在猪精液冷冻中进一步推广应用。     

利用流式细胞仪评价不同防冻液对猪冻融精子成活率及凋亡状况的影响

人工采取5头优质大白猪精液,利用BTS稀释液和添加氨基—钠—十二烷基硫酸脂(OEP)、十二烷基硫酸钠(SDS)及卵黄所组成的防冻液稀释后,冷冻程控仪制成细管冻精,采用荧光显微镜及流式细胞仪对冷冻复苏后精子质膜完整率和凋亡状况进行测定,目的在于比较不同检测方法评估猪冻融精子活率的差异性,探讨OEP、SDS对猪冻融精子质膜完整率和凋亡状况的影响。结果表明,Annexin-V/PI染色流式细胞术能准确测出猪冻融精子质膜完整率及处于凋亡状态的数量,同Annexin-V/PI染色流式细胞术相比,利用SYBR-14/PI染色荧光显微镜法往往高估冻融精子的死亡率。各处理组间冻融精子质膜完整率及凋亡数量存在一定差别,添加OEP防冻剂的实验组早期凋亡精子的比例显著低于对照组(P<0.05),而正常活性精子的比例(46.5%)显著高于对照组(37.2%)(P<0.05),结果提示:OEP对维持冻融精子质膜完整性、抑制冻融精子凋亡起到较好作用。     

稀释液·清洁剂·冷冻程序对猪精液冷冻效果的影响

探讨了稀释液、清洁剂及冷冻程序对猪精液冷冻保存效果的影响。结果显示:①稀释液Ⅳ保存鲜精,精子活率明显低于其他组(P<0.05);但其作为冻精的解冻稀释液时,效果最佳(P<0.05),说明猪精液冷冻保存时可采用第Ⅰ～Ⅲ组稀释液,而解冻时采用第Ⅳ组较佳。②稀释液中于不同阶段添加SDS(Sodiumlaurylsulfate,十二烷基硫酸钠)或OEP(OrvusESPaste,清洁剂)均能显著提高冷冻精子活率(P<0.05),SDS与OEP对冻精活率的影响无显著差异(P>0.05)。③精液冷冻程序采用-70℃、液氮熏蒸与直接液氮熏蒸在对解冻后冻精精子活率上无显著差异(P>0.05)。添加咖啡因能有效提高冻精的解冻后活率。     

猪精液冷冻保存的剂型及品种效应

为了评价细管类型在不同品种公猪精液冷冻中的效果,为猪精液冷冻的实际生产中冷冻细管的选择提供理论依据,试验将长白、大约克与杜洛克3种美系公猪(每品种7头次)精液进行不同细管类型(5.00、0.50、0.25 mL)的分装冷冻,比较各种细管类型下不同品种公猪之间和同一品种公猪不同细管类型精液冻后质量(冻后精子活力、畸形率及顶体完整率).结果表明,①相同剂型下,除了0.25 mL细管分装时杜洛克公猪冻后精子顶体完整率显著(P＜0.05)高于长白公猪外,3种公猪之间在3个指标上差异均不显著(P＞0.05);②3种公猪冻后精子活力最高的剂型均为0.50 mL细管,冻后精子畸形率及顶体完整率最好的剂型均为5.00 mL细管.总之,3种细管类型中,仅0.25 mL剂型存在品种效应,而3个品种公猪却存在着基本类似的剂型效应.     

大豆卵磷脂稀释液中添加原花青素对山羊冻精效果的影响#br#

为研究大豆卵磷脂稀释液中添加原花青素（proanthocyanidin,PC）对山羊精子的冷冻保护作用,以20％卵黄为对照（EY组）,分别在大豆卵磷脂为基础稀释液的冻精稀释液中添加最终浓度为0、10、20、40、60 μg·mL-1的PC（分别命名为SL0、SL1、SL2、SL3、SL4组）,冷冻-解冻后分别对精子活率、活力、质膜完整率、顶体完整率、线粒体活性、抗氧化和凋亡指标进行检测。结果表明,当大豆卵磷脂稀释液中PC添加浓度为40 μg·mL-1（SL3组）时,解冻后精子活力、活率、质膜完整率、顶体完整率和线粒体活性最高,分别达58.49%、53.45%、50.46%、55.37%和55.16%,显著高于其他PC添加组和EY组（P<0.05）。SL3组解冻后精子的超氧化物歧化酶（SOD）（224.87 U·mL^-1）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）含量（129.6 U·L^-1）最高,总caspase凋亡率（54.33%）和TUNEL凋亡率（41.36%）最低,与EY和SL0组差异显著（P<0.05）。当PC的添加浓度提高至60 μg·mL^-1（SL4组）时,解冻后精子质量显著下降,表现为对精子毒性作用。综上,在山羊精液冷冻中,大豆卵磷脂稀释液中添加PC浓度为40 μg·mL^-1可降低精子氧化损伤和细胞凋亡,提高冻精品质。该研究改善了无动物源稀释液在山羊精液冷冻中的应用效果,提高了山羊冻精的生物安全性和应用前景     

咖啡酸苯乙酯通过AMPK/FOXO3a信号通路缓解猪精液常温保存氧化应激的作用机制

【目的】探究咖啡酸苯乙酯（caffeic acid phenethyl ester,CAPE）通过AMPK/FOXO3a信号通路缓解氧化应激对猪精液的影响及其分子机制。【方法】选取8头成年（1—2岁）、健康状况良好长白种公猪进行鲜精采集,将质检合格的样品混池待用。试验设计如下：首先,在常温基础稀释液中分别添加0、0.02、0.04、0.06、0.08和0.10 g·L^-1浓度的CAPE,将精液样品与各个浓度组依次混合后放置室温平衡,随即转入17 ℃电子恒温冰箱进行常温保存。全自动精子分析仪（CASA）测定1—5 d精子运动学参数（总活率与渐进性活力）,筛选出最佳适宜浓度为0.06 g·L^-1。其次,将0.06 g·L^-1 CAPE与400 μmol·L^-1的H₂O₂建立氧化胁迫模型,在第1、3、5天分别采用CASA测定精子总活率与渐进性活力,荧光探针技术评估质膜完整性与顶体完整性,抗氧化试剂盒检测过氧化氢酶（catalase,CAT）与超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性,在第5 天利用实时荧光定量 PCR技术测定AMPK/FOXO3a信号通路下游靶向基因（AMPK、FOXO3a、SOD1、SOD2、CAT）及凋亡基因BAX的mRNA表达水平,蛋白免疫印记技术测定AMPK、p-AMPK蛋白表达。【结果】（1）浓度筛选试验中,0.06 g·L^-1的CAPE在保存第3 天显著提高精子的总活率并维持至第5天（P<0.05）,不仅如此,精子的渐进性活力在第1 天显著高于其他处理组（P<0.05）。（2）氧化胁迫试验中,H₂O₂处理组的精子质膜完整性、顶体完整性、总活率、渐进性活力、SOD与CAT活性在保存的第5天均极限显著低于空白组与CAPE+H₂O₂混合组（P<0.001）,而空白组与CAPE+H₂O₂混合组的总活率、顶体完整性、CAT与SOD活性不存在显著差异（P>0.05）。与CAPE+H₂O₂混合组相比,H₂O₂处理组AMPK、FOXO3a、SOD1、SOD2、CAT的mRNA表达水平显著降低（P<0.05）,BAX的表达水平显著升高（P<0.05）,而空白组与CAPE+H₂O₂混合组的AMPK、SOD1、CAT与BAX不存在显著差异（P>0.05）。在蛋白表达水平中,CAPE+H₂O₂混合组与H₂O₂组相比,AMPK、p-AMPK 与p-AMPK/AMPK比率显著提升（P <0.05）。【结论】在常温基础稀释液中添加0.06 g·L^-1CAPE可通过促进磷酸化AMPK的表达,诱导AMPK/FOXO3a信号下游抗氧化分子的转录,继而缓解H₂O₂介导的氧化危害对精液品质产生的影响,延长精液的保存时间,但CAPE保护精子氧化损伤更为深入的分子机制仍需作进一步探究。