鸡单增李斯特菌全菌灭活苗的制备与效果检测

采用甲醛将分离自鸡的单增李斯特菌灭活后再与弗氏完全佐剂按体积比1:1混合制备成全菌灭活疫苗,通过平板划线和动物接种试验对制备的疫苗进行安全性与免疫效力检验.结果表明,15日龄京粉雏鸡接种1×1010 CFU/mL抗原含量的全菌灭活苗后无异常反应,注射部位及内脏器官无病变损伤,对致死量的本菌攻毒具有100％的保护率;1×109 CFU/mL抗原保护率达85％以上,表明所制备的全菌灭活苗具有对雏鸡具有较好的免疫效力.     

散装盐水鸭中单增李斯特菌的风险等级评估

将市场调查数据与国内文献报道的统计分析结果相结合,运用半定量风险评估软件Risk Ranger,对南京市散装盐水鸭中单增李斯特菌的风险程度进行分级。结果表明,南京市散装盐水鸭中单增李斯特菌的风险评分为61分,属于高风险,每人每天因食用污染该菌的产品造成食物中毒的概率为2.90×10-4。通过进一步研究发现,加工后采取有效的控制体系,可使风险降低10倍。南京市散装盐水鸭是引发单增李斯特菌病的高危食品,需做好预防措施,加强监管。     

单增李斯特菌溶源性噬菌体的诱导及鉴定

利用丝裂霉素C诱导获得单增李斯特菌溶源性噬菌体,并确定其核酸类型。PCR及其扩增产物的序列测定检测原噬菌体,透射电子显微镜观察丝裂霉素C诱导获得的溶源性噬菌体颗粒,DNase I、RNase A和绿豆核酸酶分别消化噬菌体基因组,确定噬菌体的核酸类型。结果显示,38株单增李斯特菌分离株中的16株在tRNAArg位点携有原噬菌体,其中1株可诱导出噬菌体颗粒,该噬菌体为长尾噬菌体,核酸为dsDNA。噬菌体的成功诱导为噬菌体及其功能基因的开发利用奠定了基础。     

洛阳地区鸡肉中单增李斯特菌毒力基因的分布研究

为分析鸡肉中单增李斯特菌毒力基因的分布特征,从洛阳地区市售鸡肉中分离18株单增李斯特菌,血清凝集试验确定其血清型,然后采用PCR方法对inl A、inl B、virR、dlt A、dlt B、dlt C、dlt D及mpr F等8个毒力基因进行检测。结果显示,18株分离株血清型均为1/2型,且有9株具有全部毒力基因,其中inl B、dlt A、dlt B基因全部呈阳性,inl A、virR、dlt C、dlt D、mpr F存在缺失现象,其检测率分别为88.9%(16/18)、94.4%(17/18)、83.3%(15/18)、88.9%(16/18)、83.3%(15/18)。毒力基因缺失与血清型相关性分析结果显示,不同血清型缺失基因呈多样性。表明这8个毒力基因在市售鸡肉的单增李斯特菌中普遍分布。     

单增李斯特菌基因组DNA提取方法比较

为了选择一种简单、快速、有效的单增李斯特菌基因组DNA的提取方法,采用溶菌酶-蛋白酶K法、氯仿/异戊醇法、液氮冻融法提取单增李斯特菌基因组DNA,利用PCR扩增结果判断所得DNA样品的质量.结果为,3种不同方法均能扩增出234 bp条带,溶菌酶一蛋白酶K法提取的DNA模板检出限最低,为1.25 x 10,CFU/mL.结论为,溶菌酶-蛋白酶K法提取的DNA模板进行PCR扩增检出限最低,该方法提取的基因组DNA适用于PCR扩增和其他分子生物学研究.     

牛奶中布鲁氏菌和单增李斯特菌双重PCR检测方法的建立

【目的】建立牛奶中布鲁氏菌和单增李斯特菌的双重PCR检测方法。【方法】根据布鲁氏菌IS711序列和单增李斯特菌毒力因子HlyA序列设计并合成引物,建立双重PCR检测方法,对其特异性、敏感性和重复性进行检测,并制备污染模型乳,通过直接检测、增菌后检测、细菌富集后增菌检测,确定最低检测限。【结果】建立了牛奶中布鲁氏菌和单增李斯特菌双重PCR检测方法,该方法特异性好、敏感性高、可重复性好。布鲁氏菌和单增李斯特菌单PCR检测最小DNA质量浓度分别为0.282和3.33 pg/μL,双重PCR检测最小DNA质量浓度分别为2.82和33.3 pg/μL。感染模型乳不经过增菌,布鲁氏菌和单增李斯特菌最低检测限分别为104和8×104CFU/mL;经过24h增菌,就可以检测到10 CFU/mL的布鲁氏菌,经过12 h增菌,就可以检测到8 CFU/mL的单增李斯特菌;经过离心法富集细菌后再增菌,灵敏度可以扩大40~50倍,布鲁氏菌经24 h增菌后最低检测限为10 CFU/40 mL,单增李斯特菌经12 h增菌后最低检测限为8 CFU/40 mL。【结论】建立的双重PCR检测方法特异、灵敏、可重复,可单独或同时检测牛奶中的布鲁氏菌和单增李斯特菌,也可以用于其他产品中布鲁氏菌和单增李斯特菌的检测。     

超高压对单增李斯特菌生物被膜形成的影响

为探究超高压处理对单增李斯特菌被膜形成能力的影响。以2株4b血清型的单增李斯特菌(Wa X12、ATCC13932)为研究对象进行超高压处理(100~500 MPa,15 min,20℃),通过24孔板结晶紫染色方法对2株菌生物被膜形成能力进行检测,结合荧光显微镜和扫描电镜来观察生物被膜形成情况。Wa X12比ATCC13932形成被膜的能力强。100 MPa压力处理显著增强Wa X12的被膜形成能力(P0.05),200 MPa压力处理使ATCC13932被膜形成量显著增多(P0.05),而大于300 MPa的超高压处理使2株菌的被膜形成量均显著减少(P0.05)。荧光显微镜和扫描电镜观察结果与结晶紫染色结果相符,超高压处理对2株单增李斯特菌被膜形成能力均有影响。小于200 MPa压力处理后单增李斯特菌被膜形成能力增强,并在48 h后被膜形成量达到最大值。     

重庆市部分超市鸡肉中单增李斯特菌的耐药性与分子特征分析

为了解重庆市部分地区超市鸡肉中单增李斯特菌(Listeria monocytogenes, LM)的耐药性、毒力基因分布和分子特征,为LM监测程序的建立提供一定的数据支撑,以该地区5个超市鸡肉中分离鉴定的24株LM为研究对象,选用19种抗生素开展药敏试验;用PCR方法检测菌株携带的毒力基因,并开展血清型分型以及多位点序列分型(Multilocus sequence typing, MLST)研究.结果显示：24株分离株对苯唑西林(96.0%)、头孢噻肟(41.7%)和多粘菌素B(37.5%)的耐药率较高,多重耐药率为29.2%; 24株单增李斯特菌中23株均检测出10个毒力基因,仅1株在inlB基因上出现基因缺失.血清型分型结果表明：24株单增李斯特菌大多为1/2型,另有4株致病性较强的4b型菌株. MLST分型共鉴定出11个序列型(Sequence type, ST),其中易引起单增李斯特菌病的常见ST型(ST87,ST9,ST2)菌株占50%(12/24),并发现1个新的ST型ST1011.该研究结果说明该地区超市鸡肉中单增李斯特菌的污染比较严重,耐药情况普遍,且分离株多是致病性较...     

氧化还原失衡对单增李斯特菌毒力基因转录水平的影响

保持氧化还原平衡对生物体维持其正常生理活动具有重要作用。单增李斯特菌是可以自身合成谷胱甘肽(glutathione,GSH)的革兰氏阳性菌,GSH可影响该菌毒力基因的转录。为了研究氧化还原平衡对于单增李斯特菌毒力基因转录水平的影响,利用氧化剂H_2O_2和还原剂GSH分别对单增李斯特菌进行氧化和还原应激,qRT-PCR检测毒力基因hly、actA和plcB的转录水平变化,结果表明,22 mmol/L H_2O_2和10 mmol/L低浓度GSH均能诱导毒力基因转录水平的显著上调,而22 mmol/L高浓度GSH则抑制毒力基因的转录,表明在单增李斯特菌的氧化还原平衡调节能力范围之内,有效打破其氧化还原平衡,无论是氧化应激,还是还原应激,都可以促进其毒力基因的转录。     

不同培养条件下sigB对单增李斯特菌生物被膜形成的影响

本研究比较分析了不同温度(4、15、25和37℃)、pH(4、5、6和7)及NaCl浓度(0.5％、2.5％、4.5％和6.5％)对单增李斯特菌野生型菌株(WaX12)及sigB缺失突变型菌株(WaX12-ΔsigB)生物被膜形成能力的影响.结果表明,相比于WaX12菌株,WaX12-ΔsigB菌株生物被膜的形成量显著降低(P＜0.05).变异系数分析显示,不同培养条件对WaX12菌株及WaX12-ΔsigB菌株生物被膜形成能力均有影响,其中温度的影响最大,NaCl浓度次之,pH最弱;且WaX12-ΔsigB菌株生物被膜形成能力更易受到培养条件的影响.其次,分别选取了WaX12菌株与WaXl2-ΔsigB菌株生物被膜形成量差异最显著的培养条件(37℃、pH 6及2.5％NaCI)进行后续分析.结果发现WaX12-ΔsigB菌株胞外多糖及胞外蛋白的相对含量均显著降低(P＜0.05),而其活菌数略有降低.本研究为深入探讨sigB参与单增李斯特菌生物被膜形成的分子机制提供科学依据.     

冷却猪肉中假单胞菌生长预测模型的建立与验证

以从腐败猪肉中分离得到的假单胞菌P1,P2,P3,P4,P5,P6的混合培养物为受试菌液,应用Origin7．5软件拟合假单胞菌0-10℃下的生长情况。经比较发现,修正的Gompertz模型对假单胞菌生长曲线的拟合效果优于线性模型,R2均在0．96以上。应用平方根模型和Arrhenius模型对由修正的Gompertz模型得出的最大比生长速率进行拟合,所得Arrhenius模型的R2为0．9716,拟合效果优于平方根模型（R2为0．9326）。结果表明,所建二级模型,能真实快速有效地预测0-10℃冷藏条件下假单胞菌的生长。     

多重PCR检测三种重要食源性致病菌方法的建立及应用

 【目的】建立快速检测奇异变形杆菌、沙门氏菌和单核细胞增生李斯特氏杆菌3种食源性致病菌的多重PCR方法。【方法】根据奇异变形杆菌尿素酶合成的正向调节因子R基因（ureR）、沙门氏菌侵袭性抗原保守基因（invA）和单核细胞增生李斯特氏杆菌编码溶血素O(LLO)的 hlyA基因,分别设计3对特异性引物,对单基因PCR和单管多重PCR扩增的特异性、敏感性分析以及建立L16(43)正交试验对单管多重PCR扩增条件,如引物浓度、Tm值、模板量等的优化,建立快速检测奇异变形杆菌、沙门氏菌和单核细胞增生李斯特氏杆菌的稳定的单管多重PCR方法。【结果】针对奇异变形杆菌、沙门氏菌和单核细胞增生李斯特氏杆菌3种食源性致病菌所设计的3对引物分别能扩增出374、724和215 bp的目的条带,具有高度特异性,反应条件优化后,3种目的菌在105 CFU/mL均可同时扩增出较清晰条带(奇异变形杆菌和单核细胞增生李斯特氏杆菌在104 CFU/mL浓度下仍然可见到条带),比单基因PCR低一个稀释度,并且人工模拟试验和市售食品试验检测结果稳定。【结论】该方法操作简单、快速、特异性强和灵敏度高,能够实现对奇异变形杆菌、沙门氏菌和单核细胞增生李斯特氏杆菌3种食源性致病菌的快速诊断检测和监控。     

环介导等温扩增技术快速检测单核细胞增生性李斯特氏菌的研究

[目的]采用环介导等温扩增技术,快速检测单核细胞增生性李斯特氏菌。[方法]以单核细胞增生性李斯特氏菌（CMCC54001）的hlyA基因作为靶基因,设计引物,观察检测结果。[结果]确定了环介导等温扩增技术检测单核细胞增生性李斯特氏菌的最适反应条件。采用该方法检测单核细胞增生性李斯特氏菌的灵敏度为4.2CFU/ml。[结论]该研究建立了环介导等温扩增技术单核细胞增生性李斯特氏菌的检测方法。     

不同试验条件下猪肉中气单胞菌生长预测模型的建立和验证

采用响应曲面模型(RSM)研究温度、pH、初始菌浓度对冷却猪肉中气单胞菌Aeromonas spp.生长的影响.应用Gompertz模型对不同试验条件下气单胞菌的生长曲线进行拟合,一级模型的参数生长率(U)和迟滞期(LPD)采用RSM方法构建冷却猪肉中气单胞菌生长的二级模型.然后随机选择试验组合对建立的方程进行验证,并应用计算均方误差(MSE)、准确因子(AF)和偏差因子(BF)的方法对建立的生长预测方程进行数学检验.结果表明,修正的Gompertz模型可以较好地模拟不同试验条件下冷却猪肉中气单胞菌的生长情况(R2>0.96),温度、pH和初始菌浓度对气单胞菌生长影响显著(P<0.05),数学检验参数MSE较小,AF和BF接近1.0,均在可接受范围,用RSM方法建立的生长预测模型可以较好地模拟冷却猪肉中气单胞菌在不同试验条件下的生长情况.     

单核细胞增生性李斯特氏菌快速检测技术研究进展

单核细胞增生性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,IM)是主要食源性致病菌之一,可以引起严重的李斯特菌病.日益受到人们的重视,各种快速检测技术也迅速发展.综述了在单增李斯特菌检测时基于常规培养、分子生物学、免疫学和传感器的快速检测技术,并进行了探讨.     

单核增生李斯特菌ERIC-PCR分子分型方法的建立

以单核增生李斯特菌10403s基因组为模板,运用L16(54)正交试验,对影响ERIC-PCR的多个因素,包括Mg2+、dNTP、引物、模板和rTaq酶浓度等进行优化,并应用于不同来源的单核增生李斯菌株的ERIC-PCR,其扩增图谱表现出明显的多态性。结果表明:建立的ERIC-PCR反应体系和程序适合于单核增生李斯特菌进行分子分型。     

单核增生性李斯特杆菌感染和李氏溶血素

单核增生性李斯特杆菌病能引起绵羊、人和其他很多动物疾病,在免疫学检测上有重要意义,在研究胞内菌感染的分子机制上也是一个重要的模型。但由于当前血清学试验上的非特异性和非敏感性,使李氏杆菌病的诊断和流行病学调查存在困难。在所有致病性的李斯特杆菌中,李斯特溶血素是主要致病因子,现已经有用其做诊断抗原的报道。文章论述了近年来单核增生性李斯特杆菌及李氏溶血素的最新进展,对研究李氏杆菌病的发病机理有一定作用。     

绵羊产单核细胞李斯特菌的分离及鉴定

采用生化反应、溶血试验、致病力试验等常规方法对从疑似产单核细胞李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)患病羊脑组织分离的病原作了初步鉴定.通过PCR扩增hlyA基因部分保守序列,测序证实其与已报道的核苷酸序列的同源性达到100%,从而确诊该菌为产单核细胞李斯特菌.     

伊犁地区绵羊李氏杆菌药敏特性及平板凝集快速诊断方法的建立

[目的]建立一种快速检测李氏杆菌病的方法。[方法]通过对实验室保存的5株李氏杆菌分离株进行药敏试验,用甲醛灭活苗免疫试验动物,制备特异性抗体,将特异性抗体与抗原进行平板凝集试验。[结果]分离菌株对氨苄西林、庆大霉素、链霉素高度敏感,对头孢唑啉、左氧氟沙星和多粘菌素中度敏感,对头孢他啶、头孢呋辛钠耐药性较强。通过用甲醛灭活苗免疫试验动物来制备特异性抗体,将特异性抗体与抗原做平板凝集试验,建立一种快速准确检测李氏杆菌病的方法。[结论]成功建立了一种快速检测李氏杆菌病的方法。     

烤烟生物量指数模型构建及其验证

为了构建科学合理的烤烟生长生物量模型,通过盆栽控水的方法,对5种不同处理的烤烟进行农艺性状指标测定,采用变异系数法计算相关指标的权重,利用指数和法计算出烤烟生物量,实现在活体条件下测算烤烟生物量;并采用相关分析、拟合度分析对模型进行了验证,证明该方法能较为敏感和准确地反映烤烟在生长发育过程中生物量的变化情况。