刚地弓形虫GRA3基因的克隆与表达

采用PCR方法扩增弓形虫GRA3基因,将扩增产物与pMD18-T Simple载体连接,重组质粒经PCR、双酶切鉴定后测序;构建pGEX-4T-1／GRA3表达载体,经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE、Western blot分析。结果显示,克隆的GRA3基因片段长687bp,含有1个669bp的开放阅读框,编码222个氨基酸,与GenBank中UK株（AF414079）的同源性为99．8％;表达的融合蛋白为50Ku,能被弓形虫阳性血清识别;表明该融合蛋白具有较好的免疫反应活性。     

刚地弓形虫速殖子抗原研究进展

弓形虫为顶复动物门寄生原虫,呈世界性广泛分布,可感染所有温血动物,并在宿主免疫功能低下或受抑制时导致严重的疾患,其极高的流行性和致病的机会性已越来越引起人们的关注。作者综述了目前弓形虫速殖子抗原研究的现状。     

刚地弓形虫18S rDNA基因的克隆与序列分析

采用PCR方法从弓形虫RH株和CN株总DNA中分别扩增到18S rDNA基因，与pGEM-T easy vector连接，并进行DNA测序分析。结果表明，2个虫株均扩增出1745bp的片段，用DNAMAN软件对其与GenBank上2个虫株相应序列进行同源性比较，4个虫株的同源性为99．34％。刚地弓形虫虫株在不同宿主和不同区域上存在着一定的差异。     

刚地弓形虫钙依赖蛋白激酶9对小鼠Ana-1巨噬细胞功能的影响

本试验旨在探究刚地弓形虫钙依赖蛋白激酶9(CDPK9)对小鼠Ana-1巨噬细胞活性及功能的影响。利用激光共聚焦技术验证CDPK9与Ana-1巨噬细胞的结合情况;采用细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)检测不同浓度CDPK9处理24h对Ana-1巨噬细胞增殖活性的影响;利用流式细胞术检测不同浓度CDPK9处理48h对Ana-1巨噬细胞凋亡及吞噬功能的影响;采用总一氧化氮试剂盒检测不同浓度CDPK9处理48h对Ana-1巨噬细胞NO分泌量的影响;利用细胞因子ELISA试剂盒检测不同浓度CDPK9处理48h对Ana-1巨噬细胞TNF-α、TGF-β1、IL-10、IL-1β分泌的影响。结果如下:CDPK9能够与Ana-1巨噬细胞结合。CDPK9对Ana-1巨噬细胞增殖具有抑制作用,较高浓度时抑制作用明显。CDPK9能够显著提高Ana-1巨噬细胞的凋亡比例,同时促进其吞噬能力。CDPK9上调了Ana-1巨噬细胞NO产量。细胞因子IL-1β和TNF-α的表达量上升,而TGF-β1和IL-10的表达量有所下降。CDPK9能够与巨噬细胞结合并通过多种途径影响其活性及免疫功能。     

鼠总科动物感染刚地弓形虫的研究进展

刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种典型的人畜共患病病原体,而鼠总科动物分布广泛,与人类生活领域有一定重合,其感染弓形虫情况应该得到重视。文章对鼠总科动物种类、分布,以及其感染弓形虫的研究概况及在弓形虫传播中的作用等进行综述,以期为小型野生动物寄生虫病研究及弓形虫流行病学调查提供一定借鉴。     

犬新孢子虫和刚地弓形虫超微结构的比较

使用透射电镜，对从犬获得的三株犬新孢子虫分离株的感染培养细胞的速殖子超微结构进行检查。三个分离株的超微结构相似，速殖子具有一个表膜、２２个表膜下微管、一个类椎体，前后均有极环，８—１２个电子致密对式细胞器、大量微丝、一个单在泡状核、管状线粒体、高尔基复合体、核糖体、内质网、一个无活性的微孔、电子致密体、脂质体和技链淀粉体。大多数速殖子寄生在靠近宿主细胞核寄生性空泡中，它含有大量内空泡管。速殖子以内出芽形式分裂。没有观察到犬新孢子虫组织包囊。犬新孢子虫和刚地弓形虫的速殖子可根据对式细胞器的结构和数量、微丝和电子致密体的数量和位置予以区别。     

犬新孢子虫和刚地弓形虫超微结构的比较

使用透射电镜，对从犬获得的三株犬新孢子虫分离株的感染培养细胞的速殖子超微结构进行检查，三个分离株的超微结构相似，速殖子具有一个表膜、２２个表膜下微管、一个类椎体、前后均有极环、８－１２个电子致对式细胞器、大量微丝，一个在泡状核，管状线粒体，高尔基复合体，核糖体、内质网，一个无活性的微孔、电子致密体，脂质体和技链淀粉体。大多数速殖子寄生在靠近宿主细胞核寄生性空泡中，它含有大量内空泡管，速殖子以内出芽     

刚地弓形虫微线体蛋白3的研究进展

微线体蛋白3(MIC3)是刚地弓形虫生活史各个时期均能表达的分泌蛋白,具有较强的免疫反应性,在弓形虫对宿主细胞的识别、黏附及入侵过程中发挥重要作用。深入研究弓形虫MIC3有助于研制弓形虫病诊断制剂及疫苗以防制弓形虫病。文章综述了近年来关于MIC3的分子生物学特征、相关疫苗及其用于弓形虫病诊断方面的研究进展。     

异育银鲫蛋白质与氨基酸营养研究概述

蛋白质与氨基酸不仅是构成异育银鲫组织器官不可缺少的物质,而且还是其机体内许多生物活性物质如酶、激素和抗体等的组成成分,同时也是饲料成本中比例最大的成分.鱼类对蛋白质的需要实质上就是对氨基酸的需要.本文综述了蛋白质与氨基酸营养对异育银鲫的生长、免疫力、亲鱼繁殖性的影响,以及平衡氨基酸对异育银鲫的影响、必需氨基酸研究进展.     

刚地弓形虫Rop18基因的原核表达及鉴定

利用PCR技术从弓形虫RH株基因组中扩增出Rop18基因片段,克隆入pET-30a载体,将重组质粒转化入大肠杆菌Top10中,经酶切鉴定获得阳性重组质粒并对其进行测序。测序结果与参考序列(登录号:JX045329.1)比对发现,核苷酸同源性为99.6%。将阳性重组质粒转化入大肠杆菌BL21中,表达产物经SDS-PAGE检测结果显示,Rop18基因在大肠杆菌中成功表达;融合蛋白的分子质量在66.2 ku左右,Western blotting显示其能被兔抗弓形虫免疫血清识别。结果表明,弓形虫RH株Rop18基因可以在原核表达系统中高效表达,该重组蛋白具有免疫原性,有望作为弓形虫疫苗候选抗原。     

刚地弓形虫GRA25基因的克隆及序列分析

本研究旨在对来源于不同宿主和地理分布的22株弓形虫的GRA25基因进行PCR扩增并测序,对获得的GRA25基因序列进行比对,利用MP和ML两种方法对不同分离株的GRA25基因构建系统进化树。利用生物信息学软件将弓形虫RH株的GRA25基因翻译成氨基酸序列,对其编码蛋白的生物学特征进行分析。结果显示,弓形虫GRA25基因序列有2种长度,分别为939和948 bp。序列比对结果显示,GRA25基因在不同虫株间有82个核苷酸变异位点,变异率为0~4.4%。进化分析结果显示,用GRA25基因不能区分弓形虫基因Ⅰ型和Ⅱ型虫株。生物信息学分析预测弓形虫GRA25蛋白含有7个亲水区域,10个α-螺旋,3个β-折叠,8个无规则卷曲和8个潜在的线性B淋巴细胞抗原表位。本研究结果表明,GRA25基因不能作为标记分子区分不同基因型的弓形虫虫株,但可能作为疫苗候选分子研制新型抗弓形虫基因疫苗或表位肽疫苗。     

弓形虫病诊断技术概述

弓形虫病是一种分布广泛、危害严重的人兽共患病.因此建立快速、准确、特异的弓形虫病诊断方法尤为重要,对该病在病原学、免疫学及分子生物学方面的诊断方法进行了简要概述.     

影响刚地弓形虫组织包囊体内外形成因素的研究进展

在刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）发育为成熟组织包囊（bradyzoites）和卵囊（sporozoites）的两个时期,传统上需要进行动物试验,这极大地阻碍了对这些阶段的形态和代谢的生物学研究,而此阶段对弓形虫的感染至关重要。因此,在研究组织包囊时利用体外诱导的方法成为研究的重要途径,近年来这方面的研究也取得了一些突破性进展。文章综述了影响组织包囊形成的因素,旨在为弓形虫病的研究、预防和控制提供参考。     

弓形虫蛋白质翻译后修饰研究进展

弓形虫是一种复杂的单细胞原生动物寄生虫,通过入侵宿主细胞、分裂和诱导宿主细胞破裂等一系列的过程,在温血动物体内进行增殖。弓形虫的生物学特征受基因组、表观遗传及转录等多种因素的调控。蛋白质翻译后修饰（protein post-translational modifications,PTMs）,如磷酸化、泛素化、巴豆酰化、棕榈酰化、琥珀酰化、乙酰化、甲基化、糖基化和二羟基异丁酰化等,是弓形虫调节对细胞外刺激的反应和生命周期转变的主要机制之一。弓形虫蛋白质翻译后修饰通过改变靶蛋白的定位、结构、活性、蛋白质-蛋白质相互作用等增加蛋白质的复杂性和多样性,从而在虫体生命周期的任何时间点都可以发挥至关重要的作用。在这篇综述中,作者重点对弓形虫蛋白质翻译后修饰进行简要总结,以期为深入研究弓形虫的生物学特征奠定基础。     

蛋白质定向进化技术概述

定向进化技术是近二十年发展起来的蛋白质改造技术,其可通过对基因的突变和重组来构建突变库,然后通过高通量的筛选鉴定性能改善的突变体,此技术是改善酶性能最有效的途径之一。本文就定向进化技术的几种常用方法和定向进化后的文库筛选、应用及展望进行了概述。     

刚地弓形虫丝裂原活化蛋白激酶1基因克隆、表达及抗原性分析

克隆、表达刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)丝裂原活化蛋白激酶1(TgMAPK1)基因片段,并分析其抗原性。提取弓形虫GT1株速殖子总RNA,逆转录合成cDNA。RT-PCR扩增TgMAPK1基因。扩增产物经双酶切后连接入pET28a(+)载体,重组质粒转化大肠埃希菌(Escherichia Coli)DH5α,阳性菌落经PCR和双酶切鉴定,并测序。将测序正确的重组质粒pET28a(+)-TgMAPK1转化至E.coli BL21并加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合考马斯亮蓝染色检测表达产物。以鼠抗弓形虫血清为一抗,蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白的抗原性。RT-PCR扩增产物约为1 599bp。菌落PCR、双酶切和测序结果显示,重组质粒pET28a(+)-TgMAPK1构建成功。SDS-PAGE结果显示,经IPTG诱导获得相对分子质量约58 000的包涵体重组蛋白。Western blotting分析证实其能被鼠抗弓形虫血清识别。刚地弓形虫GT1株TgMAPK1基因片段可在原核表达系统中表达,且该重组蛋白具有抗原性。     

刚地弓形虫PTS核酸疫苗的构建及免疫保护力评价

旨在构建弓形虫磷脂酰苏氨酸合成酶(Toxoplasma gondii phosphatidylthreonine synthase,PTS)基因DNA疫苗,评价其抗弓形虫的免疫保护力。利用RT-PCR技术扩增得到弓形虫PTS基因,构建真核表达质粒pVAXTgPTS,然后转染HEK 293-T细胞,分析pVAX-TgPTS在细胞中的表达情况。利用真核表达质粒pVAX-TgPTS对BABL/c小鼠进行3次免疫,并用空质粒pVAX1作为对照,在每次免疫前和第3次免疫后2周收集小鼠血清,经ELISA方法检测小鼠血清中的IgG水平。第3次免疫后2周每组取3只小鼠,将其剖杀取脾脏,CCK-8法检测脾淋巴细胞增殖能力,流式细胞仪测定CD4+和CD8+T细胞百分比。小鼠脾细胞经STAg刺激后,利用ELISA试剂盒检测脾细胞细胞因子的表达情况。第3次免疫后2周,每只小鼠腹腔注射1 000个弓形虫RH株速殖子,观察记录小鼠的存活时间。结果显示,pVAX-TgPTS能够在HEK 293-T细胞中表达;第3次免疫后2周pVAX-TgPTS组血清中IgG含量相比对照组有了显著提高;pVAX-TgPTS组淋巴细胞刺激指数(SI)略微高于对照组;CD4+和CD8+T细胞百分比含量明显高于对照组;pVAX-TgPTS组中脾细胞经STAg刺激后能够明显提高IFN-γ的表达量。攻虫试验结果表明,pVAX-TgPTS组小鼠存活时间比对照组明显增长。本试验成功构建真核表达质粒pVAX-TgPTS,证明pVAX-TgPTS能够诱导小鼠产生一定的体液免疫和细胞免疫反应,并对弓形虫感染产生一定程度的免疫保护力,该研究结果为进一步研发弓形虫核酸疫苗奠定基础。     

刚地弓形虫抗原基因SAG2的克隆、表达和纯化

目的克隆刚地弓形虫抗原基因SAG2,并在大肠杆菌中进行高效表达及纯化。方法设计引物从弓形虫基因组DNA中扩增SAG2基因序列,构建pGEX-4T-SAG2重组质粒,双酶切鉴定后,在大肠杆菌中进行表达,并对其表达条件进行优化,所表达蛋白用GST亲和层析柱进行纯化。结果经SDS-PAGE检测,所表达的蛋白约为41KD。Western-blotting表明该蛋白能与兔抗弓形虫血清特异性结合。培养基2×YTA,IPTG浓度0.1 mmol/L,诱导时间3 h,培养温度30℃,摇瓶转速220 r/min是GST-SAG2融合蛋白表达的最佳条件,且得到的是可溶性融合蛋白GST-SAG2。结论得到高效表达的SAG2抗原蛋白,为建立弓形虫病快速免疫诊断试剂盒打下基础。     

~(60)钴丙线控制刚地弓形虫速殖子感染性的研究

刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)呈世界性分布,严重影响人体健康和畜牧业生产的发展。人弓形虫病主要的感染途径是吃了未经煮熟的含有弓形虫包囊的肉类或被包囊污染的食物。如果利用辐照技术能杀灭该虫同时又保持食物原有的性质,必将有利于预防和控制传播。为此,我们进行了~(60)钴丙丙线控制刚地弓形虫感染性的实验,现报道于下。