猪胸膜肺炎放线杆菌 ApxⅡ主要抗原表位区原核表达及其间接 ELISA 方法的建立

[目的]以原核表达的重组蛋白作为检测抗原,建立间接 ELISA方法用来检测猪血清中APP抗体。[方法]将猪胸膜肺炎放线杆菌 ApxⅡ主要抗原表位区基因片段克隆至原核表达载体 pET-28a（＋）,构建重组质粒 pET-ApxⅡA1。将重组质粒转化至宿主菌 BL21（DE3）中进行表达。通过 Western-blot分析重组蛋白免疫原性。用纯化的重组蛋白作为包被抗原建立检测猪 APP抗体的间接 ELISA方法,并优化反应条件,确定抗原的最佳包被量和血清的最佳稀释度。[结果]经 PCR双酶切及测序鉴定,重组质粒构建成功,诱导表达纯化后,重组蛋白可被 APP阳性血清特异性的识别,表明表达产物具有良好的免疫原性。用纯化的重组蛋白初步建立了检测 APP抗体的间接ELISA方法,用该方法与商品化 ApxⅣ抗体检测试剂盒分别对94份临床非免疫血清样品进行检测,结果两者的符合率为90.4%。[结论]所建立的间接 ELISA 方法具有良好的特异性和敏感性,为流行病学调查和疫苗免疫效果评估提供了技术手段。     

间接ELISA检测胸膜肺炎放线杆菌血清1型抗体的研究

进行了胸膜肺炎放线杆菌血清1型荚膜多糖的提取制备实验,并以该抗原作为诊断抗原建立了检测胸膜肺炎放线杆菌血清1型抗体的间接ELISA方法。此抗原与猪巴氏杆菌病、猪布氏杆菌病、仔猪副伤寒等阳性血清无交叉反应;与胸膜肺炎放线杆菌血清2型、3型、4型、6型、7型、8型、9型、10型标准阳性血清也无交叉反应。可用于猪群感染血清1型胸膜肺炎放线杆菌的诊断和监测。     

猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅡ主要抗原表位区原核表达及其间接ELISA方法的建立(英文)

[目的]以原核表达的重组蛋白作为检测抗原,建立间接ELISA方法用来检测猪血清中APP抗体。[方法]将猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅡ主要抗原表位区基因片段克隆至原核表达载体pET-28a(+),构建重组质粒pETApxⅡA1。将重组质粒转化至宿主菌BL21(DE3)中进行表达。通过Western-blot分析重组蛋白免疫原性。用纯化的重组蛋白作为包被抗原建立检测猪APP抗体的间接ELISA方法,并优化反应条件,确定抗原的最佳包被量和血清的最佳稀释度。[结果]经PCR双酶切及测序鉴定,重组质粒构建成功,诱导表达纯化后,重组蛋白可被APP阳性血清特异性的识别,表明表达产物具有良好的免疫原性。用纯化的重组蛋白初步建立了检测APP抗体的间接ELISA方法,用该方法与商品化ApxⅣ抗体检测试剂盒分别对94份临床非免疫血清样品进行检测,结果两者的符合率为90.4%。[结论]所建立的间接ELISA方法具有良好的特异性和敏感性,为流行病学调查和疫苗免疫效果评估提供了技术手段。     

猪胸膜肺炎放线杆菌毒素ApxⅠ对小鼠的致病性及免疫原性研究

将血清10型胸膜肺炎放线杆菌接种于含0.02%NAD、5%犊牛血清、1mMcaCl<,2>的LB液体培养基中培养12h,离心后的上清液经硫酸铵盐析、葡聚糖凝胶分子筛层析,分离纯化Apx Ⅰ.将纯化的ApxⅠ进行半数致死量测定,并对小鼠剖检后进行内脏器官病理变化观察.将纯化的Apx Ⅰ与弗氏佐剂按1:1的比例混合制备亚单位疫苗,免疫小鼠,初免2周后加强免疫1次,二免2周后用血清10型胸膜肺炎放线杆菌攻毒,测定最佳免疫剂量.根据最佳免疫剂量于30日龄和45日龄免疫小鼠,60日龄时分别用血清1、3、5、7型胸膜肺炎放线杆菌攻毒.结果该毒素对小鼠的LD50为80.9mg/kg,LD50的95%平均可信限为63.2～103.5mg/kg;Apx Ⅰ亚单位疫苗的最佳免疫剂量为40μg,对血清1、3、5、7型胸膜肺炎放线杆菌的攻击具有一定的免疫保护效果.     

猪胸膜肺炎放线杆菌毒素Ⅰ基因的克隆、表达及其ELISA检测方法的建立

根据胸膜肺炎放线杆菌S4074菌株毒素Ⅰ的序列,设计了1对引物,从本室自己分离的菌株中扩增了猪胸膜肺炎放线杆菌毒素Ⅰ的结构基因(aoxICA),扩增的DNA片段大小为3 640 bp(4 687～8 326 bp),将其克隆到pMD18-T载体中,酶切鉴定和序列测定后,进一步将其插入pET-28a中构建了原核表达载体,SDS-PAGE和Westernblotting分析表明,该基因在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了表达,而且表达的蛋白质具有免疫学活性.利用表达的蛋白作为抗原包被酶标板,建立了检测毒素Ⅰ血清抗体的ELISA方法.临床应用表明,该方法可用于APP强毒株感染的检测.     

猪胸膜肺炎放线杆菌毒素I基因的克隆、表达及其ELISA检测方法的建立

 根据胸膜肺炎放线杆菌S4 0 74菌株毒素I的序列 ,设计了 1对引物 ,从本室自己分离的菌株中扩增了猪胸膜肺炎放线杆菌毒素I的结构基因 (apxICA) ,扩增的DNA片段大小为 36 4 0bp(4 6 87～ 832 6bp) ,将其克隆到pMD18 T载体中 ,酶切鉴定和序列测定后 ,进一步将其插入pET 2 8a中构建了原核表达载体 ,SDS PAGE和Westernblotting分析表明 ,该基因在大肠杆菌BL2 1(DE3 )中获得了表达 ,而且表达的蛋白质具有免疫学活性。利用表达的蛋白作为     

鲁西地区猪胸膜肺炎放线杆菌流行病学调查

[目的]为调查鲁西地区猪传染性胸膜肺炎病的流行状况,建立了检测胸膜肺炎线杆菌（Aetinobacillus pleuropnemunoniae,APP）的PCR方法。[方法]利用PCR方法对186头病死猪的病变组织及545头无临床症状健康猪群进行了APP的流行病学研究。[结果]186份病料中APP阳性率占43．0％（80／186）,545份猪血清APP阳性占7．9％（43／545）。[结论]该PCR方法可作为APP临床诊断的重要手段之一。     

猪胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白型的研究

对猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（APP）12个血清的外膜蛋白型进行了测定。用N-十二烷酰肌氨酸法提取其主要外膜蛋白（OMPs）,经SDS-PAGE电泳后,用考马斯亮兰法进行染色,结果APP 12个血清型的OMP可以分为6个OMP型,表明APP的OMP具有多样性。     

用PCR检测猪胸膜肺炎放线杆菌

为了快速诊断猪的传染性胸膜肺炎，试验设计合成了1对引物，建立了检测猪胸膜炎肺放线杆菌的PCR方法，猪胸膜炎肺放线杆菌Ⅰ型菌血清2、5、6、9、10型均能扩增出预期片段；大肠杆菌，猪痢疾蛇形螺旋体、多杀性巴氏杆菌、鸡葡萄球菌和支气管败血性波氏杆菌的扩增结果均为阴性，用该方法检测了自猪肺脏分离的30个菌株，有11株为阳性，19株为阴性，结果证实，本方法可以用于猪胸膜肺炎的快速诊断。     

猪胸膜肺炎放线杆菌Ⅱ型分泌蛋白结构与功能的研究

猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)引起猪传染性胸膜肺炎,是猪的最重要呼吸道传染病之一。通过筛选APP 3～8 kb随机基因组文库,获得1株阳性克隆。测序拯救质粒得到序列,通过BLAST分析确定此片段为APP Ⅱ型分泌蛋白基因,预计成熟蛋白分子量为45.716 KD。根据序列设计特异性引物PCR扩增该基因,分子克隆表达该Ⅱ型分泌蛋白。Western blot结果表明,该蛋白与APP康复期血清发生反应;研究还发现,纯化的Ⅱ型分泌蛋白能结合C3。     

猪胸膜肺炎放线杆菌的分离与鉴定

从陕西某养猪场表现呼吸困难、下痢及肺炎病变的３月龄病猪检出弓形虫滋养体并分离到一致病菌。该菌表现出形态多样性、革兰氏染色不定和形成从琼脂表面难以移取的菌落等特点，小鼠试验显示有毒力。药敏试验表明，该菌对痢特灵、氯霉素高度敏感。系统的生物学特性鉴定表明，该分离菌为胸膜肺炎放线杆菌（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定

从江西省猪场病死猪肺脏中分离到三株胸膜肺炎放线杆菌。本试验对分离菌株的理化特性进行了测定,并用分离菌株制备了灭活疫苗,有效控制了菌株分离场的猪传染性接触性胸膜肺炎。     

猪放线杆菌性胸膜肺炎的诊治

猪放线杆菌性胸膜肺炎是由猪胸膜肺炎放线杆菌引起的一种伴有胸膜炎的出血性坏死肺炎．可发生于仟何年龄的猪只,呈世界性分布。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌变异株的分离与鉴定

对江苏泰兴某猪场疑似猪传染性胸膜肺炎病料进行实验室分离培养,成功分离到1株猪传染性胸膜肺炎放线杆菌,并对其进行生化特性、双抗夹心ELISA鉴定。为进一步分析该分离株的血清型,针对ApxIVA和ApfA保守基因设计2对检测引物,PCR结果表明:该分离株未扩增出预期大小的片段,说明该分离株很有可能是1株猪传染性胸膜肺炎放线杆菌变异株,其血清型还有待进一步鉴定。     

猪胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白对小白鼠的最适免疫剂量

以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清5型外膜蛋白为试材,分别用1、4、7、10、13、16、19、22、25μg/只的剂量对80只30日龄的小白鼠进行攻毒试验,结果其对小白鼠的最适免疫剂量为16μg/只。     

猪胸膜肺炎放线杆菌基因组文库的构建

由猪胸膜肺炎放线杆菌（APP）引起的猪传染性胸膜肺炎是猪最重要的呼吸道传染病之一。为研究该细菌表面蛋白的结构与功能,选取APP代表菌株,提取其基因组DNA,用TSPS091随机消化成3～8kb的片段并回收,连接到预先消化的入ZAPⅡ载体上,经过包装、扩增和滴定后,成功地构建了APP基因组文库。     

猪传染性胸膜肺炎的ApxIV—ELISA检测方法

【目的】建立一种敏感性好、简便快捷,适用于临床诊断、实验室检测和血清学调查的诊断技术,为规模化养猪场监控胸膜肺炎放线杆菌（APP）感染及净化猪传染性胸膜肺炎（PCP）提供技术支撑。【方法】以ApxIV重组蛋白为抗原,建立ApxIV-ELISA检测方法,经可行性、特异性、准确性、重复性检验后,对采自广西南宁周边地区随机抽取的未免疫APP疫苗育肥猪与经产母猪进行血清抗体检测。【结果】经试验证实,以ApxIV-ELISA检测APP具有可行性,且具有特异性良好、准确性较高、重复性较好的特点,其判断标准：S（样品孔OD630 nm）≥0.397为阳性,S＜0.397为阴性。以ApxIV-ELISA检测的90份血清样品中有40份为阳性,阳性率为44.4%;其中经产母猪阳性血清33份,占总阳性血清的82.5%。【结论】广西南宁周边地区的养猪场已普遍存在APP感染,特别是经产母猪较严重。采用ApxIV-ELISA检测方法能及时鉴别诊断猪群的APP感染情况,且敏感性好、简便快捷,适用于临床诊断、实验室检测和血清学调查。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌溶血素的研究进展

猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌引起的一种呼吸道疾病。根据荚膜多糖和脂多糖抗原表位不同,将胸膜肺炎放线杆菌分为15个血清型,不同血清型的菌株毒力大小不同,致病性也有强弱之别。该菌的致病性与多种毒力因子密切相关,而溶血素是决定该病原菌致病性强弱的关键因素。本文主要就其溶血素的研究进展作综述。     

猪胸膜肺炎放线杆菌山东分离株的血清型与Apx毒素型研究

 从山东省不同地区采集的85份具有严重呼吸道症状病死猪的肺脏、气管和扁桃体进行胸膜肺炎放线杆菌（APP）的分离鉴定，采用凝集试验和PCR方法对分离菌株进行血清型和APX毒素型的检测。结果从山东省不同地区分离到20株分属5个血清型的APP，其中，血清7型6株、血清5型5株、血清3型4株、血清4型3株、血清8型2株，血清7型、5型为优势血清型。不同地区分离的APP血清型不同，同一地区也存在不同的血清型。PCR检测结果表明，不同血清型的 APP共含有4种溶血毒素(Apx)，其中，血清3、4、8型APP含ApxⅡ、ApxⅢ和ApxⅣ，血清5型含ApxⅠ、ApxⅡ和ApxⅣ，血清7型含ApxⅡ和ApxⅣ，20株APP分离株均含有ApxⅡ和ApxⅣ两种毒素，表明野毒株的血清型与毒素基因的种类有一定的相关性。毒素序列分析结果表明，相同毒素型APP，其毒素基因序列的同源性在99.5％~100％之间，与血清型无关。致病性试验结果表明，所含毒素类型不同的APP对小白鼠的致病性不同，其中含ApxⅠ和ApxⅡ的血清5型APP毒力最强。该研究为猪传染性胸膜肺炎的免疫预防、亚单位疫苗的研制及基于ApxⅣ的PCR检测奠定了基础。     

猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅠA基因克隆与生物信息学分析

通过提取猪传染性胸膜肺炎放线杆菌ApxⅠA基因组DNA,运用PCR方法扩增ApxⅠA基因片段,并采用TA克隆技术获得pMD18–T–ApxⅠA重组质粒,进行生物信息学分析。结果表明:成功获得长度为1 209 bp的ApxⅠA基因;ApxⅠA蛋白的理化性质稳定;ApxⅠA蛋白有磷酸化位点,但无糖基化位点;信号肽预测ApxⅠA蛋白无信号肽;ApxⅠA蛋白为亲水性蛋白,无跨膜结构;预测二级结构主要由无规则卷曲构成,占50.62%,α–螺旋占25.56%,β–折叠占23.82%,三级结构主要由无规则卷曲和β–折叠构成。