聚合酶链工反应（PCR）技术在植物病害诊断中的应用

ＰＣＲ技术是一项崭新的体外扩增基因的技术，已广泛应用于与生命相关的学科的研究。本文从植物病害检测的角度，探讨如何应用ＰＣＲ技术来进行植物病害的检测。     

用PCR-RFLP技术鉴别猪的氟烷基因型

用ＰＣＲ－ＲＦＬＰ技术对乐山市种畜场长白猪选育基础群的氟烷基因型进行了检测,查清了Ｈａｌｎ基因在该群体中的分布,Ｈａｌｎ基因的频率为１８０５６％。同时对影响ＰＣＲ的几个主要因素进行了初步研究。     

RAPD技术及其在动物育种中的应用

建立在ＰＣＲ基础上的ＲＡＰＤ标记，是一种可被广泛应用于动植物遗传作图、基因定位、特殊染色体区段的鉴定与分离、动物性别鉴定以及群体遗传变异检测等研究领域的ＤＮＡ多态性标记。本文系统地论述了ＲＡＰＤ的技术原理及研究概况，比较了ＲＡＰＤ与ＲＦＬＰ及同工酶技术，并探讨了这一新的分子标记在动物育种中的应用及其局限性和发展前景。     

禽传染性支气管炎病毒免疫原基因的PCR获取及其酶切鉴定

分绍用ＲＴ－ＰＣＲ（反转录－聚合酶链反应）获取禽传染性支气管炎病毒Ｍ４１株和广东地方致弱株Ｄ４１免疫原（Ｓ１）基因的详细方法，所用引物为ＩＢＶ Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ株Ｓ１基因两侧的对应序列，跨幅为１．７ｋｂ，结果表明，两株病毒所获的ＰＣＲ产物与预期的一致；用此对引物，以ＩＢＶ Ｄ４１株Ｓ１基因ＰＣＲ产物为模板，扩增出一样的ＤＮＡ片段，试验还显示，国内外几家公司有关ＲＴ和ＰＣＲ的分子生物学试剂可以兼用     

猪生长激素基因第二外显子区遗传变异的序列基础

采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）及ＰＣＲ产物有直接序列分析方法，对猪一长激素基因第二外显子外遗传变异的序列基础进行了研究，ＰＣＲ扩增片段长度为２３０ｂｐ，包含全部的生长激素基因的第二外显子序列（１６１ｂｐ）共分析了６头二花脸和６头长白猪，结果表明：在猪的生长激素基因第二外显子子区，共有７处碱基替换，依次为５０７处的Ｃ／Ｔ替换，５２０处的Ｃ／Ｔ替换，５４６处的Ｇ／Ａ替换，５５５处的Ｇ／Ａ替换，５５６处的Ｃ     

和PCR标记鉴定水稻抗稻瘟病基因Pi—2（t）在分离世代的变化规律

与水稻抗稻瘟病基因Ｐｉ－２（ｔ）紧密的克隆基因ＲＧ６４被用作水稻育种中目的标志性状的选择。本项研究的目的在于探明区别栽培品种中抗稻瘟病基因Ｐｉ－２（ｔ）和感病基因产生聚合酶连式反应（ＰＣＲ）多态性的可能性，克隆基因ＰＧ６４被顺，并且顺序列资料被用作设计水稻品种中稻瘟病表现上有差异的ＤＮＡ基因ＰＣＲ扩增成对的特殊引物。在三个已检测的品种中已标记了序列位置的扩增不具有多态性，然而，在抗病和感病的基因型     

水稻10kD富硫醇溶蛋白基因的克隆和序列分析

以水稻广陆矮４号为材料，利用ＰＣＲ技术从水稻基因组中扩增出１０ｋＤ富硫醇溶蛋白基因，并将其插入质粒ｐＵ１８的Ｓｍａ Ｉ位点，导入大肠杆菌ＪＭ１０９中筛选重组子。经酶切鉴定、ＰＣＲ检测获得含目的基因的克隆。采用银染测序法进行序列分析。结果表明，克隆的基因含４０２ｂｐ的ＯＰＦ，与Ｍａｓｕｍｕｒａ发表序列的同源率为８７．３％，编码１３３个氨基酸，包括２４个氨基酸的信号肽序列，推测的氨基酸序列与Ｍａｓｕｍ     

香蕉束顶病毒PCR检测技术研究

建立了聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增技术检测香蕉组织和单头蚜虫内的香蕉束顶病毒（ＢＢＴＶ）,并报道了ＢＢＴＶ免疫捕捉ＰＣＲ（ＩＣ－ＰＣＲ）和直接结合ＰＣＲ（ＤＢ－ＰＣＲ）检测方法,ＩＣ－ＰＣＲ和ＤＢ－ＰＣＲ分别能从４μｇ和０．４ｍｇ香蕉叶组织中检测到ＢＢＴＶ。     

苏云金芽孢杆菌8010cryIA（b）基因的PCR鉴定

苏云金芽孢杆菌８０１０ｃｒｙＩＡ（ｂ）基因的ＰＣＲ鉴定ＰＣＲＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｏｒＩｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇｃｒｙＩＡ（ｂ）ＧｅｎｅｏｆＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ８０１０￥／／近年来，国外已陆续有人用ＰＣＲ技术对苏云金芽孢杆菌杀...     

抗菌肽Shiva A基因导入杂交水稻恢复系明恢63的初步研究

利用农杆菌介导法将抗菌肽Ｓｈｉｖａ Ａ 基因导入杂交水稻恢复系明恢６３ 成熟胚诱导的愈伤组织中，并再生植株。经ＰＣＲ检测分析证明Ｓｈｉｖａ Ａ 基因已整合到再生植株的基因组中。     

藏绵羊DQA1基因多态性分析

 【目的】研究藏绵羊DQA1基因多态性,确定其等位基因数、核苷酸多态位点、氨基酸多态位点及各等位基因间的遗传关系,同时分析其进化意义。【方法】采用PCR-SSCP方法检测了900只藏绵羊DQA1基因第2外显子多态性;克隆、测序群体内变异产生的各等位基因序列,并分析序列数据。【结果】发现了17个DQA1的等位基因,包括缺失的1种基因,其中5个为发现的新等位基因。16个单倍型序列中发现56个核苷酸多态位点,27个氨基酸多态位点。【结论】藏绵羊DQA1基因第2外显子具有丰富的多态性,群体中可能蕴藏着更多的遗传资源;藏绵羊DQA1基因最初可能是由2个等位基因突变分化成两大类等位基因的;藏绵羊DQA1基因第2外显子序列与牛的DQA1基因第2外显子序列具有较高的同源性,预示绵羊和牛的DQA1基因最早可能来源于它们分歧以前的共同祖先原始序列;DQA1基因在与其相关的特定抗原刺激下发生的免疫应答反应在绵羊和牛上具有相似性;新等位基因C的139位发现了1个新的核苷酸突变位点（A/G）,属同义突变;5个新发现的DQA1等位基因遗传关系较近,可能由同一等位基因突变产生。     

柑橘大实蝇微卫星标记的筛选

【目的】筛选可用于柑橘大实蝇（Bactrocera minax）种群遗传研究的微卫星标记。【方法】选取33对柑橘大实蝇同属种柑橘小实蝇（B. dorsalis）、木瓜实蝇（B. papayae）、瓜实蝇（B. cucurbita）、东澳番茄实蝇（B. cacuminata）中多态性较好微卫星引物,通过对PCR扩增产物进行琼脂糖电泳初筛选及变性聚丙烯酰胺凝胶电泳再筛选,并对其等位基因频率、多态信息含量和有效等位基因数等指数进行分析。【结果】33对微卫星引物中有12对引物对柑橘大实蝇有扩增条带,其同源率为36.4%。6个微卫星位点在柑橘大实蝇上共检测到 23个等位基因,平均等位基因数为3.83 个;6对微卫星引物的平均多态信息含量（PIC）为0.2248,最高为0.4105,最低为0.0869。【结论】所筛选出的6对微卫星引物表现出较好的多态性,可用于后续对柑橘大实蝇的种群遗传研究。     

辽宁省稻瘟病菌无毒基因型鉴定及分析

【目的】鉴定稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）的无毒基因型,了解无毒基因在不同地区流行菌株中的分布情况,为品种布局提供参考。【方法】根据已经克隆且与稻瘟病菌致病性相关的6个无毒基因序列设计引物,选取辽宁省稻瘟病常发区的26株稻瘟病菌单孢菌株,提取各菌株DNA样本作为模板,进行PCR扩增。通过琼脂糖凝胶电泳及PCR产物测序,对6个无毒基因PCR产物进行碱基和氨基酸序列的分析比较。对琼脂糖凝胶电泳未出条带的,设计不同引物进行验证性试验。【结果】在PCR产物电泳检测中,Avr1-CO39、Avr-pia和Avr-pii没有产物条带,对这3个无毒基因设计验证引物,其PCR产物电泳检测仍没有条带出现,其结果证明辽宁省各水稻主产区流行稻瘟病菌中多不携带Avr1-CO39、Avr-pia和Avr-pii;对于其他3个无毒基因 AvrPiz-t、Avr-pik和Avr-pita则有特异性扩增产物,说明这3个无毒基因在各稻区稻瘟病菌中以不同突变类型及不同频率出现。其中,与Pi2、Pi9和Piz-t对应的AvrPiz-t,分别在22个菌株的中被检测到,且有21个菌株的序列与其序列一致,说明该基因遗传相对稳定,也间接证明携带Pi2、Pi9和Piz-t 的水稻品种在辽宁地区的广谱抗性;与基因组序列不同的16号菌株,在DNA序列192 bp处发生一个单碱基C的缺失,从而导致移码突变,且碱基突变导致氨基酸序列至72位氨基酸时提前终止,而使该基因编码的蛋白质失去无毒基因的功能。与Pik、Pik-p、Pik-m和pik-s对应的Avr-pik,电泳检测结果表明各菌株均有特异性条带出现,经测序验证等位基因序列分为4种类型（B、D、F、G）,其中12个菌株携带可为Pik或其等位基因Pik-m和pik-p所识别的D类型;9个菌株携带B类型,该等位基因曾被报道,但是否具有无毒基因的功能仍未验证;另有2个菌株携带F类型等位基因,该基因为首次发现,并分别出现在丹东和盘锦地区。其特点在于与D类型基因间存在143（A/G）的碱基差异,氨基酸序列翻译结果显示其为错义突变,即48（G/D）;而其余3个菌株携带G类型等位基因,该基因亦属首次发现,且仅出现在抚顺新宾地区,碱基序列与D类型存在168（G/A）的差异,导致翻译提前终止,基因功能丧失。对于Avr-pita,26个菌株特异性扩增产物一致,但测序检测到5种等位基因类型,且均与Avr-pita有差异,碱基序列的变化多导致错义突变。这5种等位基因的氨基酸序列之间差异由3个氨基酸位点的差异所致,分别为83（D/N）、192（Y/C）和207（K/R）,3处突变均在基因结构域范围内,几种等位基因均已见报道。【结论】辽宁稻区流行稻瘟病菌中Avr-pik、AvrPiz-t和Avr-pita分布较为广泛,选育及推广携带相应抗病基因的水稻品种可减轻稻瘟病的危害。     

西瓜炭疽病菌Colletetrichum orbiculare的分子检测

【研究目的】探索西瓜炭疽病菌(Colletetrichum orbiculare )的分子检测技术，为西瓜、甜瓜等生长期和采后炭疽病的快速、准确鉴定和检测提供技术和方法。【采用的主要方法和研究结果】根据GeneBank中Colletetrichum属的24个种的ITS系列，比较设计出一对引物CY1/CY2，可以特异的从西瓜炭疽病菌C. orbiculare和菜豆炭疽病菌C. lindemuthianum菌株中扩增到一条442bp的条带，将这两个种的炭疽菌和其它菌分开。进一步利用RAPD随机引物扩增C. orbiculare和C. lindemuthianum，找出在C. orbiculare中的特异性条带，经过克隆、测序后，设计出一对SCAR引物RB/RC，可以特异的在C. orbiculare中扩增出一条216bp的条带，将C. orbiculare和C.lindemuthianum分开。采用两对引物组成双重PCR，能够将C. orbiculare和其它相关和近似菌株分开。【主要结论】利用上述两对引物组成双重PCR检测体系，可以快速鉴定C. orbiculare，并且能够直接在植物组织中将西瓜炭疽病菌C. orbiculare检测出来，灵敏度可以达到1pg/μl。     

8种猪呼吸道和繁殖障碍病病原体GeXP检测方法的建立

【目的】建立了一种同时鉴别H1、H3亚型猪流感、猪繁殖与呼吸障碍综合征、猪瘟、猪日本乙型脑炎、猪圆环病毒病、猪细小病毒病和猪伪狂犬病8种病毒性呼吸道和繁殖障碍病病原体的GeXP 高通量检测方法。【方法】根据这8种病原体的基因保守序列,设计并合成了9对特异性引物, 在每对特异性引物的5′端均加上一段通用引物,形成特异性嵌合引物。运用GeXP单重PCR方法,以单一病毒cDNA/DNA为模板验证引物的可行性;建立GeXP多重PCR方法,以单一病毒cDNA/DNA模板、阳性cDNA/DNA混合模板验证GeXP多重检测体系的特异性和准确性;将含猪圆环病毒、猪细小病毒和猪伪狂犬病病毒靶基因的克隆质粒及体外转录的RNA（H1、H3亚型猪流感、猪繁殖与呼吸障碍综合征、猪瘟、猪日本乙型脑炎）分别梯度稀释为10³,10²,10¹拷贝/µL,运用GeXP多重PCR方法进行单一病原体灵敏度分析;根据单一病原体的灵敏度分析结果,优化各对特异性嵌合引物的工作浓度,将含有体外转录好的6种RNA模板和3种克隆质粒等量混合,将混合物梯度稀释为10⁴,10³,10²,10¹拷贝/µL,运用GeXP多重PCR方法分析同时检测8种病原体的灵敏度。运用建立好的GeXP多重检测体系对23份临床样品进行检测,并与常规单重PCR进行比较,对该GeXP多重检测体系的临床应用进行评价。【结果】基于GeXP系统的单重PCR检测体系和GeXP多重PCR检测体系均能扩增出特异性片段,验证了引物的可行性、GeXP多重检测体系的特异性和准确性;GeXP多重检测体系的单一病原模板灵敏度分析结果显示,多重检测体系对单一病原体检测的下限均为10¹拷贝/µL;GeXP多重检测体系在8种病原体同时检测的灵敏度分析结果显示,多重检测体系可在10³拷贝/µL水平可同时检测到8种病原体;比较GeXP多重PCR检测方法和常规PCR方法对临床样品的检测结果,两种检测方法的检测结果相符。【结论】成功建立了基于GeXP系统的多重PCR检测体系,可以同时检测8种猪呼吸道和繁殖障碍性疾病病原体;本研究建立的同时鉴别8种猪呼吸道和繁殖障碍性疾病病原体的GeXP检测方法具有高通量、特异性强和灵敏度高的特点,为猪病毒性呼吸道和繁殖障碍性疾病的分子诊断提供了新型的检测方法。     

4对微卫星DNA标记在3个绵羊品种中多态性的研究

选用无角道塞特、萨福克与中国美利奴肉羊品种群体,耳组织提取基因组DNA,用4对微卫星引物进行PCR扩增,通过电泳分型、凝胶成像系统分析各位点等位基因及全部个体的标记基因型,计算基因频率、多态信息含量(PIC)和杂合度等,从分子水平上分析4个位点的遗传多态性.结果表明,CSSM18,OB2,MCM38,MCMA26这4个位点的等位基因数分别为14、15、13、13,多态信息含量(PIC)丰富,杂合度高,均属于高度多态性位点,用于作为与生产性能相关的遗传标记是较理想的.     

Development of a Highly Informative Microsatellite （SSR） Marker Framework for Rice （Oryza sativa L.） Genotyping

To select highly informative microsatellite markers （SSRs） and establish a useful genetic SSR framework for rice genotyping, 15 rice （Oryza sativa L.） cultivars including six indica varieties and nine japonica varieties were used to analyze the polymorphism information content （PIC） value of 489 SSR markers. A total of 1 296 alleles were detected by 405 polymorphic markers with an average of 3.2 per locus. The PIC value of each chromosome was ranged from 0.4039 （chromosome 2） to 0.5840 （chromosome 11）. Among the two rice subspecies, indica （0.3685-0.4952） gave a higher PIC value than japonica （0.1326-0.3164） and displayed a higher genetic diversity. Genetic diversity of indica was high on chromosome 12 （0.4952） and low on chromosome 8 （0.3685）, while that for japonica was high on chromosome 11 （0.3164） and low on chromosome 2 （0.1326）. A SSR framework including 141 highly informative markers for genotyping was selected from 199 SSR markers （PIC〉0.50）. Ninety-three SSR markers distributed on 12 chromosomes were found to be related to indica-japonica differentiation. Of these 93 pairs of SSR primers, 17 pairs were considered as core primers （all the japonica varieties have the same specific alleles, while the indica varieties have another specific alleles）, 48 pairs as the second classic primers （all the japonica or indica varieties have the same specific alleles, while the indica or japanica varieties have two or more other specific alleles ） and 28 pairs as the third classic primers （all the japonica and indica varieties have two or more alleles, but the specific alleles are different between japonica and indica）. Thirty-two SSR markers were selected to be highly informative and useful for genetic diversity analysis of japonica varieties. This work provides a lot of useful information of SSR markers for rice breeding programs, especially for genotyping, diversity analysis and genetic mapping.     

4个微卫星标记对3个绵羊品种肉用性状多态性的研究

选用无角陶赛特、萨福克与中国美利奴肉用绵羊161只,经耳组织提取其基因组DNA,并通过4对微卫星引物对其进行PCR扩增,然后通过电泳分型、凝胶成像系统分析各位点等位基因及全部个体的标记基因型,计算基因频率、多态信息含量(PIC)和杂合度等遗传多态性指标.结果表明,BM3413,BP33,MCM38,MCMA26位点的等位基因数分别为12、15、13、13,多态信息含量丰富,杂合度高,均属于高度多态性位点,用于绵羊肉用形状较理想的遗传标记.     

柑橘品种鉴定的SSR标记开发和指纹图谱库构建

【目的】筛选出一套SSR核心引物,用于构建柑橘品种的DNA指纹图谱库,为柑橘种苗认证、品种登记和植物新品种保护提供技术支撑。【方法】以柑橘属8个主要栽培种类为试材进行PCR扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测,筛选出多态性丰富、扩增条带稳定的引物对部分参试品种进行PCR扩增,扩增产物通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行进一步的引物筛选;筛选得到的引物进行荧光标记,并选用部分柑橘品种进行PCR扩增,扩增产物利用基因分析仪检测,分别计算各引物的PIC值、等位基因数目,选取一套多态性丰富的适合进行荧光毛细管电泳检测的SSR引物组合,进而对所有参试品种进行分析,构建柑橘品种的DNA指纹图谱库,同时利用筛选的SSR标记对参试品种进行鉴定。【结果】初期以柑橘属8个种的代表品种(太田椪柑、沙田柚、沅江酸橙、大红甜橙、邓肯葡萄柚、枸橼、费米耐劳柠檬和墨西哥来檬)为材料,用362对SSR引物进行PCR扩增,扩增产物经4%琼脂糖凝胶电泳检测,初步筛选出80对种间多态性高、扩增稳定的SSR引物;进一步从8个种类里选择不同类型的64个柑橘品种,用上述筛选出的80对SSR引物进行PCR扩增,扩增产物经6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,再筛选出60对品种类型间多态性高、扩增稳定、条带清晰的SSR引物,并分别进行荧光标记;另以168份柑橘品种为材料对上述60对SSR引物进行PCR扩增,经荧光毛细管电泳检测,依据各引物的PIC值、等位基因数目、峰图读取难易程度、扩增稳定性及染色体位置等,最终筛选出21对SSR引物作为指纹图谱库构建的核心引物。为消除不同仪器、不同试验批次等引起的误差,为21对SSR引物各主要等位变异选择相应的参照品种。根据各引物标记的荧光颜色及扩增片段大小进行合理组合,21对SSR引物可分成5组进行多重电泳,共采集500份柑橘品种的DNA指纹。利用SSR标记,有111份品种仅用1对引物即可鉴别,86份品种用2对引物组合即可鉴别,24份品种用3对引物组合即可鉴别,另外279份品种虽无法单独一一鉴别,但可分为87个小组,组内品种无法区分,组间品种易鉴别。【结论】利用筛选出的21对SSR核心引物,构建了包含500份柑橘品种的DNA指纹图谱库,筛选出部分品种的特异标记,可以鉴别221份柑橘品种和87个品种组合,构建了基于毛细管电泳平台的柑橘SSR分子标记品种鉴定体系。